Name: robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing
Uploaded: 2015-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing at JoVE.com

The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

Polimer sulu iki fazlı bir sistem 1. Hazırlama (ATPS) <ol><li> Polietilen glikol (PEG) (MW 35,000) ve 0.5 g tartılır ve sulu faz, PEG (w / v)% 5, 10 ml hazırlamak için, steril bir 15 ml konik tam büyüme ortamı 9,5 ml ekleyin. Not: İlk polimer ekleyerek ve ardından konik orta yarısını eklenmesi sonra orta kalan miktarı konik duvarlara polimerin yapışmasını en aza indirir ve polimer daha hızlı çözülür yardımcı olur. </li><li> Dekstran (Dex) ve 0.128 g (MW 500,000) tartılır ve% 12.8 (w / v) sulu bir DEX faz 1 ml hazırlamak için, steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde tam büyüme ortamı 0.872 ml ekleyin. </li><li> Yaklaşık 1 dakika vorteksleyin, her iki çözelti ortam içinde polimerlerin çözünmesi için. </li><li> Bir çözünme ve karışımın homojen bir karışım sağlamak için 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de bir su banyosu içinde, her iki çözüm tutun. Banyosundan çözümler bulaşma olasılığını önlemek için su seviyesinin üzerinde kapaklarını tutmaksu. </li><li> Steril, plastik şırıngaya PEG fazlı bir çözelti yükleyin ve yabancı maddelerin çıkarılması için 0.2 mikron gözenek boyutunda bir şırınga filtresinden geçirilir. Yavaş yavaş filtre ile çözüm itmek, PEG çözeltisi ile şırınga doldurun bir konik tüpün üst ve kuvvet kullanarak filtre ekleme yerleştirin: Not. Bu enjektör pistonunun hareketine karşı direnç olması normaldir. Çözeltisinin bir kısmının filtre kalır, ancak polimer konsantrasyonu değişmez olarak polimer çözeltisinin küçük kaybı oluşur. </li><li> Pipet 10 DEX faz çözeltisi ul ve ayrı bir tüp içinde ortamdan 10 ul seyreltilmesi% 6.4 (ağırlık / hacim) deksmedetomidin fazlı bir çözelti ile sonuçlandırılabilir. Aspire 100, PEG faz çözeltisi ul bir Petri çanağı içine dağıtın. <ol><li> PEG faz çözeltisi içine deksmedetomidin faz çözeltisi (ağırlık / hacim)% 6.4, 0.5 ul koyun. Görme mikroskop altında DEX damla gözlemleyerek başarılı ATPS oluşumunu onaylayın. damla sınıriki sabit, ayrı sulu fazın varlığına işaret eden görülebilir kalmalıdır. </li></ol></li><li> Kullanana kadar 4 ° C stok sulu PEG ve DEX faz çözümleri saklayın. Not: Polimer solüsyonları, önceki her bir deney için taze olarak hazırlanmıştır ve depolama, 24 saat içinde kullanılması önerilmektedir. </li></ol> Baskı Kanseri Hücre küremsilerin 2. Hazırlık <ol><li> % 90 -100% konfluent tek tabaka için de (örneğin, MDA-MB-157 göğüs kanseri hücre) kanser hücrelerinin büyütün. MDA-MB-157 hücreleri için, DMEM,% 10 FBS,% 1 glutamin ve% 1 antibiyotik içeren oluşan bir ortamı kullanmaktadır. <ol><li> (Üreticinin protokolüne göre) ve 15 ml konik bir süspansiyon yük hücre ayırma tamponu kullanılarak hasat hücreleri. , 173.3 x g&#39;de 5 dakika için santrifüj süpernatant kaldırmak ve tekrar süspansiyon hücreleri tam büyüme ortamı, 1 ml. </li></ol></li><li> Yük hücreleri bir hemositometrede üzerine ve onları saymak gerekli sayısını hesaplamak içinistenen bir küremsi hücre yoğunluğu için hücre. T75 şişesi içinde yetiştirilen, MDA-MB-157 hücrelerinin konfluent tek tabaka genellikle ~ 7 x 10 6 hücre sağlar. Not:. 1.5 x 10 4 veya MDA-MB-157 hücreleri için daha büyük bir damla hacmi için gerekli hücre yoğunluğu, bir tek küremsi hücre tipine bağlı olacaktır oluşturmak için örneğin 22, bir yoğunluk için 0.3 ul deksmedetomidin faz damla başına önerilir Tek bir sfero oluşumunu sağlamak. </li><li> 173.3 x g&#39;de 5 dakika boyunca ikinci bir kez santrifüj hücreleri ve arzu edilen bir hücre yoğunluğuna kadar süspansiyon konsantre büyüme ortamı, uygun hacimde bunları yeniden süspanse edin. Not: 7 x 10 6 kanser hücreleri hasat edilmiştir, örneğin, bir 0.3 ul deksmedetomidin faz damla 1.5 x 10 4 hücre yoğunluğunun bir küremsi oluşturulması için gerekli olan hücre süspansiyonu, toplam hacmi 140 | il olacaktır. Bununla birlikte bağlı bir sonraki aşamada deksmedetomidin faz çözeltisi ile seyreltme ile, sadece hücreler tekrar süspansiyon hücre kültür ortamı, 70 ul kullanın. </li><li&gt;% 12.8 eşit bir miktarda (w / v) sulu bir DEX fazlı çözelti 1.2 hazırlanan elde edilen hücre süspansiyonu ekleyin. 1.5 x 10 4 hücre yoğunluğu sfero Örneğin, deksmedetomidin fazlı bir çözelti, 70 ul hücre süspansiyonu, 70 ul ilave edilir. </li><li> İyice hücreleri ve deksmedetomidin çözeltisi karıştırma homojen dağılımını sağlamak için bir hücre süspansiyonu karıştırılır. Pipetleme yukarı ve aşağı kabarcık oluşmasmı önlemek üzere yavaşça yapılması gerekmektedir. </li></ol> Eş-kültür küremsi Baskı için 3. Hazırlık <ol><li> Büyüme kanser hücreleri (örneğin, MDA-MB-157 insan meme kanseri hücreleri) ve 90% -100% konfluent tek tabaka destek hücreler (örneğin, insan fibroblastları). (Üreticinin protokolüne göre) bir hücre ayırma tamponu kullanılarak, her hücre türü hasat edilir. <ol><li> Her konik 5 173.3 xg&#39;de dakika ve aspire süpernatant onları santrifüj, 15 ml konik içine her süspansiyon yükleyin. Tam g, 1 ml her bir konik hücreleri tekrarrowth ortamı. Not: Calcein AM (canlı hücre lekesiz) ve nükleer boya (Hoechst) gibi floresan boyalar iki hücre tipleri ayırt etmek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Bir hemasitometre üzerinde ayrı ayrı hücre tipi yükleyin ve ko-kültür sferoitler hücreleri desteklemek için kanser hücrelerinin arzu edilen bir oran için, her hücre türü için gerekli sayısını hesaplamak için say. T75 şişeleri içinde yetiştirilen Konfluent, MDA-MB-157 hücrelerinin tek tabakaları ve fibroblast genellikle, sırası ile, yaklaşık 7 x 10 6 ve ~ 6 x 10 6 hücreleri vermek. </li><li> Iki hücre türünün sayısının istenilen oranı verecek şekilde kanser hücreleri süspansiyonuna hücrelerdeki durdurulması- doğru hacim. Örneğin, 1 fibroblast hücre 50 kanser hücreleri oranı kullanılır. </li><li> Santrifüj, uygun bir hacim içinde 173.3 xg ve tekrar süspansiyon hücreleri, 5 dakika boyunca karıştırılmış bir hücre süspansiyonu ihtiva eden konik sulu deksmedetomidin (w / v) eşit bir büyüme ortamı hacmi ve% 12.8 içeren son yoğunluğuna sonuçlandığı(1.2 hazırlandı) fazlı çözelti. </li><li> Yavaşça süspansiyon homojenliği sağlamak için yukarı ve aşağı ortaya çıkan hücre süspansiyonu pipetle. </li></ol> 96 oyuklu bir plaka içerisine Tümör sferoitlerin 4. Baskı <ol><li> Bir gün önce deneyler için,% 1 kat muamele edilmemiş, yuvarlak dipli 96 oyuklu plakalar, 24 saat boyunca 37 ° C &#39;de (w / v) Pluronik. Bu kaplama, kültür süresi boyunca, hücre yapışmasını önler. </li><li> Süzüldü% 5, 50 ul koyun 96 oyuklu bir plaka (hedef plaka) her bir oyuğuna, sulu PEG faz (a / h). </li><li> Bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonu karışımı (aşama 2 veya sırasıyla mono ve ko-kültür, Aşama 3&#39;te hazırlanan) ve 384 oyuklu plakanın bir kolonu (kaynak plaka) ile ilgili de her süspansiyonun 20 ul . </li><li> Sıvı işleyici ve &quot;ev&quot; koordinatlarını kaydetmek için pipet kafa açın. Ardından laboratuar aletlerinin sağlamak için (4.6 aşağıda) önceden tanımlanmış protokol derlemek ve parametreleri doğru tanımlanırly. Bu &quot;güdümlü&quot; bir adım, farklı sıvı işleyicileri için farklı olabilir. Not: protokol akışı, adım-adım aşağıda 4.6 olarak, ne olursa olsun kullanılan robotik sıvı işleyici benzer olacaktır gösterilmiştir; Ancak, programlama arayüzü sayesinde farklı yazılım kullanımı farklı görünebilir. </li><li> Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi sıvı işleyici iş istasyonunda belirlenen pozisyonlarda kaynak plaka, plaka hedef ve pipet ucu kutuları yerleştirin. </li><li> Aşağıdaki adımları içeren protokolü yürütün: <ol><li> Yük istasyonunda (Şekil 1) den pipet uçları (8 ipuçları) karıştırma sıvı işleyici pipet kafasından varil bir sütun. </li><li> Kaynak plaka (Şekil 1), oyuklarında hücre süspansiyonu karıştırılır. Kabarcık oluşumunu önlemek için kuyular hücre süspansiyonu hacmi daha küçük bir karıştırma birimi seçin. </li><li> Boş bir atık ipuçları kutusu (Şekil 1) içine ipuçlarını çıkarın. </li&gt; <li> Yük 10 ul dağıtım pipet uçları ile pipet kafasından varil bir sütun (Şekil 1). </li><li> Her bir kaynağı havalandır pipet içine kaynak plaka hücre süspansiyonunun 0.3 ul (Şekil 1). </li><li> Hedef plakanın bir kolonu (şekil 1) ve kuyu içine bir hücre süspansiyonu koyun. 0.5 mm&#39;lik bir dağıtıcı yüksekliği ve 1&#39;den küçük ul / sn bir dağıtıcı akış hızı kullanın. </li><li> Tüm hedef plakasına kolon-by-kolonu baskı tamamlanana kadar tekrarlayın 4.6.6 ile 4.6.1 adımları. </li></ol></li><li> Dikkatle iş istasyonu yüzeyinden hedef plaka kaldırmak ve CO 2 37 ° C&#39;de nemli inkübatör yerleştirin ve% 5. Hücreleri içeren DEX faz damlalarının bozmamak için kuvöz içine taşırken plaka yatay koruyun. </li><li> Deksmedetomidin faz damla içinde bir küremsi, hücrelerin toplanmasını sağlamak için 24 saat boyunca plaka inkübe edin. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Cancer Celi sferoitlerin İlaç Tedavisi Aşağıdaki protokol 4 gün ilaç tedavisi ve diğer tedavi dönemleri için modifiye edilebilir günden sonra 2. taze ilaç ile bir yenileme içerdiğini unutmayın. <ol><li> Görsel olarak, 24 saat sonra, 96 gözlü plakalar içinde küremsi oluşumu teyit edilmiştir. Her sfero küçük ve en büyük çap ortalamasını alarak küremsilerin boyutunun ölçülmesi için görüntü kuyu Gerekirse. </li><li> Önceden tespit edilmiş bir çözünürlük konsantrasyonda üretici tarafından tavsiye edilen bir solvent içinde eritilmesi ile arzu edilen bir ilacın stok çözelti hazırlayın. Örneğin, mi, 2 mg / su içinde sisplatin çözülür. Not: İlaç ışığa duyarlı ise ışıktan ilacın stok solüsyonu koruyun. </li><li> Seri seyreltme tekniği kullanarak, önceki aşamada hazırlanmış olan stok çözeltisinden hücre kültür ortamı ile sulandırılmış ilaç konsantrasyonları hazırlamak. Her bir seyreltme iki kez, istenen konsantrasyon yapılmalıdır. DilKatkı oranları başlangıç ​​stok konsantrasyonuna bağlı olarak değişir ve çalışma konsantrasyonlarını arzu edecektir. </li><li> Her bir oyuğa, önceki aşamada hazırlanan ilaç solüsyonu 50 ul ekle. Bu robot veya manuel pipetleme yapılabilir. Not: her bir ilaç konsantrasyonu, her yuva içinde daha önce 50 ul sulu bir PEG faz ile istenen konsantrasyona devre seyreltilir. <ol><li> Her bir konsantrasyon için, 96-çukurlu bir tablaya (n = 16) iki adet sütun sferoidler kullanın. </li><li> Kontrol kuyuları olarak, sulu bir PEG fazın mevcut 50 ul taze kültür ortamı 50 ul ekle. </li></ol></li><li> Işıksız bir ortamda 37 ° C&#39;de 48 saat% 5 CO2 için ilaç ile sferoidler inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan 48 saat sonra, arzu edilen konsantrasyonlarda ilacın taze dilüsyonları hazırlanması ve her bir oyuğa taze ilaç çözeltisinin 50 ul ekleyerek ilaç yeniler. Not: kuyular zaten ilk ilaç t istenen ilaç konsantrasyonu içerirreatment. Seyreltme ortaya çıkar çünkü Bu nedenle, bu yenileme evresinde, her bir konsantrasyonu, arzu edilen bir konsantrasyonda hazırlanır. </li><li> Işıksız bir ortamda 37 ° C&#39;de başka bir 48 saat süre ile ilaç ve% 5 CO2 ile sferoidler inkübe edin. </li></ol> 6. küresellerde hücresel viabileteyi analizi <ol><li> Yenilenen ilaç (örneğin, bir ilaç ile küremsilerin toplam tedavi süresi 4 gün) ile inkübasyondan ve 48 saat sonra iyi kılavuzlarını pipetleme ile bir ortamın toplam hacmini ölçün. Not: Bir kuyuda tipik hacmi 140 ul (küçük bir düşüş buharlaşma nedeniyle oluşur) ~ olduğunu. </li><li> Toplam oyuk hacmi içinde% 10 konsantrasyonda hücre canlılığı reaktifi (örneğin, PrestoBlue) hacminin hesaplayın. Her bir oyuğa Hücre canlılığı reaktifi bu hacim. Not: iyi olarak 140 ul olan bir ortam hacmi ile, 15.6 ul bir hacim de, toplam% 10&#39;luk bir konsantrasyon vermek için gereklidir. Bu hesaplanır9 (140 ul / 9 = 15.6 ul) mevcut medya hacmine bölünmesi. </li><li> Işıksız bir ortamda 37 ° C &#39;de 6 saat süre ile her bir göze ilave hücre canlılığı maddesi ile plaka inkübe edin. </li><li> Bir mikro-plaka okuyucusu içinde plakayı ve sırasıyla 560 nm ve 590 nm&#39;lik eksitasyon ve emisyon dalga boyunda floresan sinyalini okur. </li><li> Aynı muamele şartlarından değerlerinin ortalaması sonra kontrol kuyularının edilene işlenmiş olan gözeneklerden elde floresan sinyali normalize edilmesi ile küremsi hücrelerin yüzde canlılığı hesaplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+in+drug+discovery.">Systems biology in drug discovery.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).</li><li>Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+anticancer+drug+discovery--a+novel+approach+based+on+engineered+mammalian+cell+lines.">In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines.</a> Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).</li><li>Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+microarrays+in+drug+discovery.">Cell microarrays in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).</li><li>Gidrol, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+microarrays+in+pharmacology.">2D and 3D cell microarrays in pharmacology.</a> Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).</li><li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery.">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).</li><li>Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decline+in+new+drug+launches:+myth+or+reality?+Retrospective+observational+study+using+30+years+of+data+from+the+UK.">Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK.</a> BMJ Open. 3, (2013).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li><li>Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+engineering:+the+other+face+of+tissue+engineering.">Tumor engineering: the other face of tissue engineering.</a> Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).</li><li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression.">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li><li>Carlsson, J., Yuhas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-overlay+culture+of+cellular+spheroids.">Liquid-overlay culture of cellular spheroids.</a> Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).</li><li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+angiogenesis+studied+in+confrontation+cultures+of+multicellular+tumor+spheroids+and+embryoid+bodies+grown+from+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells.</a> FASEB J. 15, 995-1005 (2001).</li><li>Tekin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+microwells+for+formation+and+retrieval+of+cell+aggregates.">Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates.</a> Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).</li><li>Patra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+uniform-sized+cell+spheroids+formation,+culture,+harvesting+and+flow+cytometry+analysis.">A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis.</a> Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).</li><li>Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconfigurable+microfluidic+hanging+drop+network+for+multi-tissue+interaction+and+analysis.">Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis.</a> Nat. Commun. 5, 4250 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-ring+structures+stabilize+microdroplets+to+enable+long+term+spheroid+culture+in+384+hanging+drop+array+plates.">Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates.</a> Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).</li><li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures:+from+molecular+mechanisms+to+clinical+applications.">Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications.</a> Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).</li><li>Minchinton, A., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumors.">Drug penetration in solid tumors.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li><li>Jeong, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tension-mediated,+concave-microwell+arrays+for+large-scale,+simultaneous+production+of+homogeneously+sized+embryoid+bodies.">Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies.</a> Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).</li><li>Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+imaging,+and+analysis+plate+for+facile+handling+of+384+hanging+drop+3D+tissue+spheroids.">Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids.</a> JALA. 19, 208-214 (2014).</li><li>Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput,+polymeric+aqueous+two-phase+printing+of+tumor+spheroids.">High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids.</a> Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).</li><li>Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+aqueous+biphasic+tumor+spheroid+microtechnology+for+anti-cancer+drug+testing+in+3D+culture.">Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).</li><li>Albertsson, P. -. A., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagrams.">Phase diagrams.</a> Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).</li><li>Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+co-culture+patterning+using+aqueous+two-phase+systems.">Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li><li>Frampton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+two-phase+system+patterning+of+detection+antibody+solutions+for+cross-reaction-free+multiplex+ELISA.">Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA.</a> Sci. Rep. 4, 4878 (2014).</li><li>Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+direct+visual+analysis+of+hydrolytic+enzyme+activity+using+aqueous+two-phase+system+droplet+phase+transitions.">Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions.</a> Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).</li><li>Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+spatio-temporally+controlled+cell+microprinting+with+polymeric+aqueous+biphasic+system.">Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system.</a> Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells.">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+system+rehydration+facilitates+high+throughput+cell+exclusion+patterning+for+cell+migration+studies.">Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies.</a> Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells:+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches.">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate.">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts.">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444 (2010).</li><li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids.">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li><li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer.">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+tumours+in+context.">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Sferoidler iyi tümör fizyolojisini ve ilaç etkinliğini anlamak ve anti-kanser ilaç keşfi için yararlı bir araç sağlamak için gerçekçi bir modeli sunuyoruz. Bu tür uygulamalar büyük ölçüde yalnızca standart laboratuar aletlerinin, sıvı taşıma araçları ve tarama ekipmanı gerektirmeyen basit sfero üretimi ve bakım teknikleri yararlanacak. sulu iki-fazlı sistemde açılan faz içinde kendiliğinden agrega kanser hücrelerinin kullanılması verimli üretim ve robotik sıvı işleyicilerle sfero...

Hücre bazlı analizler geliştirme ve yeni bir anti-kanser ilaçların bulunması için önemli bir araç sağlar. 1,2 Tarihsel, kanser hücrelerinin tek tabakalı kültürleri kanser hücrelerinin belirli türlerine karşı aday bileşiklerinin etkinliğini araştırmak üzere istihdam edilmiştir. standart kültür plakaları içinde tek tabakalı kültürler bakım kolaylığı, reaktifler ilave edildikten ticari robotik araçlar ile standart levha uyumluluğu ve kimyasal bileşikler hücresel tepkilerin alt analizi için tarama ekipmanı ile 2D Kültürlerin çekici bir araç kılan en önemli yararlar uyuşturucu testi için. 3 yazık ki, tek tabakalı hücre deneyleri genellikle ilaç geliştirme ve keşif son derece pahalı verme süreci, in vivo bileşiklerin etkinliğini tahmin etmek başarısız. 4,5 ilaç şirketleri ve akademik birimler, sadece ~% 1 önemli yatırım ve çaba rağmen Kanser karşıtı klinik çalışmalarda ilaç onaylanmıştırSon yirmi yıl içinde FDA tarafından. 2B kültürleri ve in vivo olarak kanser hücrelerinin, karmaşık 3 ortamı arasında 6 eşitsizlik tek tabakalı kültürü sistemlerinin önemli bir eksikliktir. 7 Bu nedenle, ortamda tümör hücrelerine karşı Aday bileşiklerin tarama daha yakından benzemektedir 3D tümör çevre roman kemoterapi ilaçlarının gelişimini hızlandırmak olabilir. 8 Kanser hücresi sferoidler, in vitro olarak ilgili bir 3D tümör modeli sunar. 9,10 olan sferoitler hususiyetlerini yapışmayan yüzeylerde ya da dönen bir şişede, sıvı kaplama, mikrofabrike mikro gibi teknikler kullanılarak süspansiyon içinde kanser hücrelerinin kendiliğinden ya da neden olduğu bir montaj ile oluşturan yoğun kümeleri . diziler, mikroakışkanlar ve asılı damla de 11-16 sferoitler geometri ve merkezi bölgeye oksijen, besin ve ilaç bileşiklerinin sınırlı ulaşım dahil olmak üzere katı tümörlerin temel özelliklerini taklit; dolayısıyla, onlar daha yakından uyuşturucu yanıtlayanların yenidentek tabakalı kültürleri ile karşılaştırıldığında katı tümörlerin bir bileşiğe dönüştürülebilir. Bu belirgin yarar rağmen 17-19 sferoidler rutin kanser hücrelerine karşı kimyasal bileşiklerin taranması için kullanılmamaktadır. Piyasada mevcut robotik ve tarama / görüntüleme araçları ile uyumlu bir standart yüksek kapasiteli ortamda üniforma ölçekli spheroidler üreten Zorluk ilaç geliştirme boru hattına sfero kültürünün birleşmesini engellemektedir. Özel malzemeler ve plakalar son zamanlarda bu ihtiyacı gidermek için piyasada mevcut hale gelmiştir rağmen, maliyet düşünceler onların yaygın kullanımını engellemek. Yeni asılı damla platformu ve mikrofabrike mikro-kuyuları kullanmak yüksek verimlilik tutarlı ölçekli spheroidler üretme yeteneği ile iki önemli teknikler. 13,16,20 Ancak, her iki yaklaşım özel plakaları ve imal pahalı ve uç nokta kullanıcılar için sakıncalı olan cihazlar gerektirir temel araştırma merkezleri ve ilaç sanayi, en büyük ef içindeyeni anti-kanser ilaç keşfi için kale yapılır. Damla plakaları asılı bir son tasarımı ile hücre içeren damla istikrar bazı iyileşmelere rağmen, plakanın sadece her delik hala damla yayılması / birleştirilmesi önlemek için kültür sırasında kullanılır. 16 Bu önemli ölçüde deneysel verim azalır. İlaç ilave ve yenileme kılavuzuna veya robotik pipetle zor ve bu plaka konfigürasyonu gibi plaka okuyucu gibi geleneksel tarama donanımları ile kolayca uyumlu olmadığı için sferoidler biyokimyasal analiz için standart bir plaka aktarılır gerekir. 21 Mikro-kuyuları da yumuşak litografi kullanarak imal Kontrollü boyutu sfero üretimine izin. 13,20 Ancak, standart pipet araçları ile bu platformun uyumsuzluk tek bir tedavi durumu tüm sferoitleri açığa farklı ilaç bileşikleri / konsantrasyonları ile bireysel küremsi tedavi önler. Bu nedenle, bu yöntem için uygun değildirçok sayıda bileşik / konsantrasyonları aynı anda test gerektirir akış bileşik taraması. Bu engellerin üstesinden gelmek için, standart 96 oyuklu plakalar içinde sürekli boyutlu kanser hücresi sferoitlerin yüksek verimli üretimi için yeni bir teknik geliştirilmiştir. 22,23 yaklaşım polietilen glikol ile bir polimer sulu bir, iki fazlı bir sistem (ATPS) (dayanır faz oluşturucu polimerler PEG) ve dekstran (Dex). 24 ATPSs son hücre micropatterning sağlamak için yeni bir hücre, biyolojik bir dizi uygulamada kullanılabilir ve son derece sulu ortam içinde hücrelerin biyolojik tepkin maddelerin sağlanmasını lokalize edilmiştir. 25-32 bir oluşturmak küremsi, kanser hücreleri, sulu deksmedetomidin faz ve elde edilen süspansiyon bir alt mikrolitre damla karıştırılır iyi olarak ihtiva eden daldırma sulu PEG faz çözeltisi içine pipetlenir. damlası sfero oluşumunu kolaylaştırmak için daldırma aşaması sınırladığını hücrelerden karışmayan kalır. İthortantly yüksek sulu daldırma aşaması sfero hücrelerine besin sağlar ve ortam osmolalitesinin değişiklikler ve ilaç konsantrasyonlarının dalgalanmalara neden olur başka deneyler için ortak ortam buharlaştırma ile bilinen bir sorun en aza indirir. Bu teknik, küremsi üretim ve yalnızca standart 96 oyuklu plakalar içinde ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve pipetleme araçlarını kullanarak ilaç tedavisi sağlar. Önemli bir şekilde, küremsilerin hücresel tepkilerin analizi standart biyokimyasal tahlilleri ve plaka okuyucu kullanarak aynı plakada gerçekleştirilir. Robotik sıvı taşıma yaklaşım ATP ve adaptasyon ile çalışma kolaylığı mono-kültür ve ko-kültür hem de yüksek verim nesil basit bir laboratuar tekniği sferoitlerin yapar. Bu yeni yaklaşım, geliştirilmiş test hacmi ve test bileşiklerin ve Redu artan sayıda maliyet-etkililik (ilaç geliştirme ve keşif süreçlerine kanser hücresi sferoitlerin entegrasyonu yönünde atılmış büyük bir adım olacakCED reaktif tüketimi) ve verimlilik (zaman eller azaltıcı). ATPS yaklaşım kullanılarak 96 oyuklu plakalar içinde kanser hücresi sferoitlerin robot üretimi için ayrıntılı bir protokol, aşağıda tarif edilmiştir. Buna ek olarak, sonuçta elde edilen sferoitlerin ve ticari bir biyokimyasal analizi kullanılarak hücresel tepkilerin alt analizi ilaç tedavisi ayrıntıları sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents and Consumables&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol, MW: 35,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, MW: 500,000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Clacein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (10 &amp;micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (70 &amp;micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom 96-well plates</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Liquid Handler</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

Robotik sıvı işleyici iş istasyonu. Şekil 1&#39;de gösterildiği pipetleme baş ve bölüm 4.6 sferoidlerinin robotik baskıda kullanılan tüm istasyonlar etiketli edilir. Görüntü ucu kutuları için iki farklı istasyonda (bir karıştırma ipuçları grubu ve hücre süspansiyonu sulu deksmedetomidin faz karışımının / dağıtılmasını emilmesi için ikinci kümesinin) kullanımını göstermektedir. tüm kurulum kısırlık korumak için bir standart biyolojik güvenlik kabini içinde...

Watch this Scientific Journal Video about Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing at JoVE.com

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.0K Görüntüleme.  The University of Akron. A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Video: Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Kanser Araştırmaları

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor cells into neighboring tissue. Thus, invasion is a crucial step in metastasis, making the invasion process research and development of anti-metastatic drugs, highly significant. To address this demand, there is a need to develop 3D in vitro models which imitate the architecture of solid tumors and their microenvironment most closely to in vivo state on one hand, but at the same time be reproducible, robust and suitable for high yield and high content measurements. Currently, most invasion assays lean on sophisticated microfluidic technologies which are adequate for research but not for high volume drug screening. Other assays using plate-based devices with isolated individual spheroids in each well are material consuming and have low sample size per condition. The goal of the current protocol is to provide a simple and reproducible biomimetic 3D cell-based system for the analysis of invasion capacity in large populations of tumor spheroids. We developed a 3D model for invasion assay based on HMCA imaging plate for the research of tumor invasion and anti-metastatic drug discovery. This device enables the production of numerous uniform spheroids per well (high sample size per condition) surrounded by ECM components, while continuously and simultaneously observing and measuring the spheroids at single-element resolution for medium throughput screening of anti-metastatic drugs. This platform is presented here by the production of HeLa and MCF7 spheroids for exemplifying single cell and collective invasion. We compare the influence of the ECM component hyaluronic acid (HA) on the invasive capacity of collagen surrounding HeLa spheroids. Finally, we introduce Fisetin (invasion inhibitor) to HeLa spheroids and nitric oxide (NO) (invasion activator) to MCF7 spheroids. The results are analyzed by in-house software which enables semi-automatic, simple and fast analysis which facilitates multi-parameter examination.

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

A HMCA-based imaging plate is presented for invasion assay performance. This plate facilitates the formation of three-dimensional (3D) tumor spheroids and the measurement of cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). The invasion assay quantification is achieved by semi-automatic analysis.

Kanser hücre işgali ve Anti-metastatik uyuşturucu kullanarak hidrojel mikro-odası dizi (HMCA) eleme Analizi-tabak dayalı

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

Microwell Tabaklar kullanma büyüklüğü kontrollü Tümör küremsi Büyük Sayılar üretimi

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Biyomühendislik

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

İlaç Değerlendirme Çalışmaları için 3D Tümör Sferoidlerinin Üretimi

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell cultures. The clinostat mimics an environment where cells can assemble as highly reproducible spheroids with low shear forces and active nutrient diffusion. We demonstrate that both cancer and non-cancer hepatocytes (HepG2/C3A and THLE-3 cell lines) require 3 weeks of growth prior to achieving functionalities comparable to liver cells. This protocol highlights the convenience of utilizing incubators for 3D cells with cameras monitoring the cell growth, as snapshots can be taken to count and measure spheroids upon treatment. We describe the comparison of THLE-3 and HepG2/C3A cell lines, showing how non-cancerous cell lines can be grown as well as immortalized cancer cells. We demonstrate and illustrate how proteomics experiments can be conducted from a few spheroids, which can be collected without perturbing cell signaling, i.e., no trypsinization required. We show that proteomics analysis can be used to monitor the typical liver phenotype of respiratory chain metabolism and the production of proteins involved in metal detoxification and describe a semi-automated system to count and measure the spheroid's area. Altogether, the protocol presents a toolbox that comprises a phenotypic characterization via image capture and a proteomics pipeline to experiment on 3D cell culture models.

We present a protocol for growing high-reproducible spheroids and their phenotypic characterization using image capture and proteomics.

Fonksiyonel 3D Küresel Hücre Kültürlerinin Yarı Otomatik Fenotipik Analizi

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Biyokimya

FLIM Tabanlı Metabolik ve Hipoksi Analizi için Çok Hücreli Spheroid Oluşumu

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Yazar Spotlight: Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanarak Metabolik ve Oksijenasyon Analizi için Küresel Oluşum Yöntemlerinin Standardizasyonu

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Kanser hücre işgali ve Anti-metastatik uyuşturucu kullanarak hidrojel mikro-odası dizi (HMCA) eleme Analizi-tabak dayalı

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Microwell Tabaklar kullanma büyüklüğü kontrollü Tümör küremsi Büyük Sayılar üretimi

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

İlaç Değerlendirme Çalışmaları için 3D Tümör Sferoidlerinin Üretimi

Fonksiyonel 3D Küresel Hücre Kültürlerinin Yarı Otomatik Fenotipik Analizi

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)