Sandra Bargen Biz mükemmel teknik destek için teşekkür ederim. Bu çalışma Protein araştırma departmanı (PRD, TP A1.2 (RC ve TS) ve RUB Araştırma Fonu, Rektoratsprogramme tarafından desteklenmiştir. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) monoklonal antikorlar 39.4D5 ve F55A10 Gelişim Çalışmaları Hibridoma elde edildi Bankası (DSHB, Iowa City, IA).

Özel reaktifler için: Sekme bakın. 1. Listelenen tüm diğer reaktifler Sigma Aldrich alınan hücre kültürü kalitesinde. 1. Tabaklar / lamelleri PORN-H/laminin kaplama <ol><li> 150 mM borat tamponu pH 8.35, 0.5 mg / ml Poly-DL-ornitin hidrobromid (PORNO-H) çalışma çözeltisi hazırlayın. <ol><li> 50 mg PORNO / 1 ml borat tamponu bir stok solüsyonu, önceden hazırlanmış ve -20 ° C&#39;de saklanabilir </li></ol></li><li> % 100 etanol içinde yanan cam lamelleri sterilize edin ve onları hava kurumaya bırakın. </li><li> Kapak 4 geceleme yeterli PORNO-H çözümü ile yüzey ° C </li><li> Ertesi gün, sterilize edilmiş su ve hava-kuru lamelleri ile üç kez yıkayın. </li><li> HBSS 2.5 mikrogram / ml laminin çalışma çözüm hazırlayın <ol><li> Alikot -20 ° C&#39;de saklanabilir. 4 ° C, kullanımdan hemen önce çözülmesini sağlayın. </li></ol></li><li> Laminin çözüm PORNO-H-kaplı lamelleri yüzeyini kaplayan ve onları kullanana kadar oda sıcaklığında en az 2 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> 2. Lektin arıtma plaka kaplama <ol><li> Steril su, pH 9,5 10 mM Tris bir çözüm hazırlayın. </li><li> Lektin (HBSS lektin (Sigma L9640) toz çözmek), son konsantrasyonu 10 mcg / ml ekleyin. </li><li> Kat 8 ml lektin çözüm ile 10 cm hücre kültürü çanak yüzey ve oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca inkübe izin. </li><li> Kadar HBSS HBSS ve mağaza ile plaka üç kez yıkayın. </li><li> 30mm KCl,% 0.8 (w / v) NaCl depolarizasyon çözüm hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) filtrasyon ve mağaza tarafından sterilize edin. </li></ol> 3. Motonöron kültür ortamı <ol><li> Çözülme at serum geceleme 4 ° C ve 55 inaktive ° C 30 dakika, 5 ml ve depoya Temsili miktar -20 ° C. Çözülme kısım doğrudan RT kullanmadan önce. </li><li> Mağaza -20 ° C&#39;de 1 ml aliqouts B27 ilavesi Kullanmadan hemen önce RT B27 takviyesi çözülme. Donma ve çözülme döngüleri kaçının. </li><li> Kısım -20 ° C&#39;de 0.5 ml alikotları ve mağaza içine glutamax ve 1:100 kullanın. </li><li> 10 mg / ml% 0,1 BSA ile sterilize su CNTF bir stok solüsyonu hazırlayın. -20 ° C&#39;de muhafaza </li><li> , 2.5 ml at serumu, 1 ml B27-ek ve doğrudan kullanmadan önce 0.5 ml glutamax ile 46 ml neurobasal orta karıştırın. </li><li> 37 ° C&#39;ye kadar nihai konsantrasyonu 10 ng / ml orta ve ön-sıcak orta CNTF ekle </li></ol> 4. Omurilik diseksiyonu <ol><li> E12.5 hamile bir fare Kurban ve embriyoların dikkatle çıkarın. Embriyoların tamamen karşılamak için yeterli RT HBSS ekleyin. </li><li> Baş ve kuyruk çıkarın ve ata biner gibi uzuvları ile embriyo arka tarafında bir yer. </li><li> Bir forseps ile embriyo saptamak ve diğer forseps ile dış deri kaldırmak. </li><li> Forseps altında delerek omurilik çıkarın ve omurilik her iki tarafta testere gibi hareketleri ile yukarı kaldırın. </li><li> HBSS ile yeni bir çanak izole spinal kord transferi ve dorsal tarafında omuriliğin merkezi kanal açmak. </li><li> Dorsal kök gangliyon omurilik içine meninksler kaldırarak çıkarın. </li><li> Buz üzerinde 1 ml HBSS ve mağaza ile dolu bir Eppendorf reaksiyon tüpünde lektin plaka başına 6 embriyolar kadar hazırlık yapılır kadar omurilik bel parçaları toplayın. </li></ol> 5. Lektin tabanlı arıtma tarafından motor nöronlar zenginleştirilmesi Not: sonraki adımlara başlamadan önce, burada son (adım 3) orta hazırlamak ve prewarm <ol><li> 4 100 ml HBSS, -20 ° C&#39;de saklamak ve çözülme 1 g tripsin çözme ° C tripsin bir çözüm hazırlayın. </li><li> Mix 1g tripsin inhibitörü, 98 ml HBSS ve 2 ml, 1 M Hepes pH 7.4, 1 ml alikotları 4 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir </li><li> Bir hücre kültürü kaputu omurilik tüp transferi ve HBSS 700 ul dikkatli bir şekilde kaldırın. </li><li> 7.5 ul tripsin çözümü ve dikkatle tersini tüp ile karışımı ekleyin. </li><li> 37 8 dk boyunca gerçekleştirin trypsination ° C. </li><li> 30 ul tripsin inhibitörü ekleyerek reaksiyon durdurun ve 1000 ul pipet ucu ile dikkatli bir şekilde 10-15 kat daha fazla hücre agrega görünür olana kadar kadar pipet ve aşağı (çiğnemek). 20-200 ul pipet ve ilgili bir ipucu ile öğütme işlemi tekrarlayın. </li><li> HBSS dolu lektin plakasına hücre çözümü Pipet ve yavaşça plaka döndürerek hücrelere dağıtmak. </li><li> Lektin plaka titreşimsiz bir yüzey üzerinde RT 60 dakika tutun. Kontaminasyonu önlemek için üzerini kapatın. </li><li> HBSS çok hafifçe kaldırın ve plaka hücre parçaları ve bağlı / unattached hücreleri çıkarmak için önceden ısıtılmış HBSS dikkatle 4 kez yıkayın. </li><li> Hemen son yıkama adımdan sonra, plaka 500 ul depolarizasyon çözüm ekleyin ve 1dk için kuluçkaya yatmaktadır izin. </li><li> Lektin bağlı hücrelerin sallayarak dekolmanı kolaylaştırılması veplaka dokunarak. </li><li> Önceden ısıtılmış 2 ml kültür ortamı ve 15 ml şahin tüp transfer plaka doldurun. </li><li> Neubauer sayma odasına hücre sayısını sayın. </li><li> Plaka uygulamaya bağlı olarak uygun sayıda laminin kaplı lamelleri veya plakaları hücre. </li><li> 1. gün ve daha sonra her iki günde bir, eski orta% 50 dikkatli yedek bir orta alışverişi yapın. Önceden ısıtılmış, taze hazırlanmış yeni bir kültür ortamı her zaman kullanın. </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları: Embriyonik motor nöronlar E12 E14 için fare embriyoları elde edilebilir. Lomber spinal kord toplam hücre popülasyonunun% 2-3 motor nöronlar oluşur ve dorsal kök ganglion nöronlar de NTR pozitif P75 olarak, (lektin tabanlı preplating işlemine başlamadan önce bu hücrelerin kurtulmak için önemlidir. genel bakış için bkz: Şekil 1 ve Şekil 2). İkincisi, meninksler lektin tabanlı preplating prosedürü (Şekil 2 ve Şekil 3) düzgün bir şekilde çıkarılmalıdır gibi, aynı zamanda güçlü ekarte edilmelidir bölünen hücreleri içerir. Kötü durumlarda, bu hücrelerin kültür plakaları büyümek. Şekil 3B ve 3D temsili resimleri yapılmıştır prosedürleri yıkadıktan sonra (protokol adım 5.9) düşük hücre yoğunluğu hakkında bir izlenim verir. Kültürler embriyonik fare motor nöronlar genellikle beş ya da yedi gün kadar tutulur. Bu süre boyunca hücrelere maksimum uzunluğu (Şekil 4) neurites oluşturabilirsiniz. Neurite uzunlukları 8 plakaları üzerinde substrat kuvvetle bağlıdır. PORNO-H kapalı kültür yemekleri kaplı tipik substrat laminin. Motor nöronlar, su lizis 8 tarafından üretilen ekstraselüler matrisler gibi, aynı zamanda başka bir ya da daha az tanımlanmış yüzeylerde büyüyebilir . Suboptimal kaplama, neurite uzunluğu ve büyüme konisinin alanı vakalarında azalma ve hücre ölümü genellikle artar. Trofik destek kültür embriyonik fare motor nöronlar hayatta kalmak için çok önemli bir rol oynar. Trofik 6 desteği olmadan% 10 ila% 20 günde yedi damla başlangıçta kaplama hücreleri Survival. Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ve Silier nörotrofik faktör (CNTF) en sık kullanılan faktörlerdir ancak diğerleri kadar [Lösemi inhibitör faktör (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF olarak hayatta kalma teşvik edebilir ), İnsülin-benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1) 9]. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" /> Şekil 1 embriyonik fare motor nöronlar hazırlanması için akış şeması. Şematik çizim fare embriyonik motor nöronlar izolasyonu ve kültürü için farklı adımları gösteriyor. Kısaltmalar: SC: omurilik; HBSS: Hanks dengeli tuz çözeltisi; MN: motonöron. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" /> Şekil 2 E12.5 fare omurilik bel kısmının izolasyonu: E12.5 fare embriyo. Bir sonraki adım için, baş ve kuyruk kaldırılır ve vücudun dorsal yukarı konumda B: sırt-yukarı konumda embriyo yerleştirilir. Omuriliğin sol ve sağ Forseps konumunu embriyo gövdesi tespit. Bir daha sonra forseps, deri kesme ve diğer embriyo konumunu düzeltmek için kullanılır omurilik altında kesmek için kullanılan C: E12.5 fare embriyo izole spinal kord. Spinal kord (bel, göğüs, rahim ağzı) parçalar gösterilir. Omurilik, meninksler çevrili ve dorsal kök gangliyon kısmı hala onlara eklemek D: omurilik boyuna doğru merkez kanal açmak için sırt tarafında kesilir E: ventral tarafta meninksler basık omurilik çıkarılır. Not: çıkartılır iken, bel kısmı küçük bir kesim tarafından işaretlenmiş F: omurilik Yalnızca bel kısmı daha sonra başka prosedürler için alınır . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" /> Şekil 3 E12.5 fare embriyoları lomber spinal kord Islet-pozitif hücrelerin belirlenmesi ve izolasyonu:. Islet-1 / 2 antikor embriyonik lomber spinal kord içinde etiket motonöron sütun (kırmızı ok) ve Hoechst etiketleri tüm bölüm içindeki çekirdekleri. Bir E12.5 lumar omurilik bölümünde Çapraz. E12.5 fare embriyoları, standart prosedürlere göre, 6 saat için% 4 paraformaldehid daldırma sabit fosfat tamponlu salin solüsyonu ile 3 kez yıkanır ve sakkaroz ile tedavi edildi. 20 mikron Cryosections Kriyostat ile alınmış ve bölümlerde standart prosedürlere 11 göre immunhistochemical boyama ele alındı. Bölümlerde eşya, daha sonra hücre çekirdeğinin lokalizasyonu için Hoechst ile etiketlenir. Notdorsal kök ganglion nöronlar yanı ve Islet-1/2-positive hazırlık prosedürü izolasyon prosedürü bu doku parçaları hariç B: E12 gelen etiketli Islet-1 / 2 (kırmızı ok) ayrışmış lomber spinal kord hücreleri. 5 embriyolar, sol ve sağ öncesi lektin tabanlı preplating sonra. Hücreleri tüm hücre çekirdekleri görselleştirmek için Hoechst ile zıt C: lektin tabanlı preplating önce ve sonra Islet-1/2-positive hücrelerin Niceleme: D bir gün sonra kültür E12.5 embriyolar Nkx6.1 etiketli motor nöronlar. Hücreler tüm çekirdeklerin cisualieze Hoechst ile zıt. Tüm hücrelerin% 90 Nkx6.1 olumlu olduğunu unutmayın. Kısaltmalar: SC: omurilik; MN: motonöron; DRG: dorsal kök ganglion. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" /> Şekil 4 A ve B E12.5 fare motor nöronlar Karakterizasyonu. Zenginleştirilmiş lomber spinal motor nöronlar 0 gün (0div) in vitro ve in vitro (2div) 2 gün P75 NTR ifade E12.5 fare izole edilmiştir. Hücreler,% 4 paraformaldehid ile sabit ve daha sonra standart prosedürlere göre P75 NTR boyandı. Hücreler tüm çekirdeklerin görselleştirmek için Hoechst kullanarak zıt C: Zenginleştirilmiş motor nöronlar PORNO-H ve laminin kültür substrat olarak in vitro (5div) 5 gün sonra ve β-III-tubulin CNTF boyanmış varlığı. Not hücreleri uzun neurites büyüdü ve uzun (dallanmış) süreci ve bir veya daha kısa süreçler (akson ve dendritler) ile tipik motonöron morfolojisi gösterilecek. Kısaltmalar: MN: motonöron; div in vitro gün. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> Lektin tabanlı preplating olmadan disosiasyon sonra </td></tr><tr><td> Toplam sayıda hücre / SC </td><td> Tripan mavi-pozitif hücrelerin [%] </td><td> Islet-1/2- pozitif hücrelerin [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995,0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889,4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> Ortalama ± SD </td><td> 1.021.0 ± 147,1 </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> Lektin-tabanlı preplating </td></tr><tr><td> Sonra hücrelerin sayısı preplating / SC </td><td> Tripan mavi-pozitif hücrelerin [%] </td><td> Islet-1/2- pozitif hücrelerin [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189,6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168,8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125,0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> Ortalama ± SD </td><td> 161.1 ± 33.0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özellikle bu amaç için 3 farklı izolasyon prosedürleri sahne E12.5 fare embriyonik motor nöronlar için temsili izolasyon prosedürleri özeti. Sonuçları sayıların toplamı, ya da yüzde numaraları ± SD olarak verilmiştir. Kısaltma: SC: omurilik, SD: standart sapma. <table border="1"><tbody><tr><td> Islet-1 / 2 pozitif hücrelerin P75 kaydırma [%] </td><td> Lektin tabanlı [%] kaydırma Islet-1 / 2 pozitif hücrelerin </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 1 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Lektin tabanlı ve P75 tabanlı 1 kaydırma motonöron hücre sayıları karşılaştırılması. Yüzdesi numaraları ± SD olarak verilmiştir.

<ol>
	<li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification.">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li><li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression.">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li><li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons.">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu lektin tabanlı preplating tekniğin avantajı NTR P75 tabanlı kaydırma işlemi daha az pahalı olduğunu ve lektin antikorlar daha kararlı. Şekil zenginleştirme listelenmiştir. 2 ve Tab. 1 yordam, benzer sayıda hücre arıtma sağlar ve bu hücrelerin bir kısmı olduğunu gösterir motonöron işaretleyici Islet-1 / 2 ifade eder. En kritik adım lomber spinal kord izolasyon prosedürü. Lektin tabanlı preplating tarafından aşağıdaki arıtma prosedürü için zarları ve DRG&#39;ler (Şekil 2) kaldırılması esastır. Bu doğru yönetilen varsa, hemen hemen tüm hücrelerin (temsili resim için bkz: Şekil 3a) P75 NTR ifade . Islet-1 / 2 ve P75 NTR büyük olasılıkla ifade arasındaki farkı nedeni lomber motor nöronlar farklı Islet-1 / 2 10 daha yüksek ve düşük seviyelerde ifade çünkü. Pozitif veya negatif hücreler (Çizelge 1) ile sıkı olduğu gibi düşük seviyelerde Islet-1 / 2 ifadesi bu durumda immuncytochemical boyama ve sonraki sayım dikkat kaçmış olabilir. Ayrıca, Tablo 1&#39;de açıkça hücrelerin geri dönüşümsüz hasar olduğunu gösteren sadece birkaç tripan mavi pozitif hücrelerin olduğu gibi, izole hücrelerin sağlıklı bir durum prosedürü hayatta olduğunu gösterir. Bu değiştirici prosedürü de embriyonik farelerden alınan karışık genotip litre tek embriyo ve bu nedenle motor nöronlar izolasyonu sağlar. Sonuç olarak, P75 NTR antikor 6 kaydırma işlemi için bu alternatif benzer olmasa bile olası uygulama aralıkları açısından aynı kapasiteleri ve fare embriyonik motor nöronlar için ucuz ve verimli bir alternatif bir arıtma yöntemi sağlar .

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Poly-DL-ornitin hidrobromid </td><td> Sigma </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Cam lamelleri </td><td> Thermo </td><td></td><td> Ø 10 veya 14mm </td></tr><tr><td> Lektin </td><td> Sigma </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre kültürü çanak </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon delta yüzeyi </td></tr><tr><td> At serumu </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> Her parti, MN kültür için test edilmesi </td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> Sigma </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> ¸ </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps </td><td></td><td></td><td> Paslanmaz çelik, 4 veya 5 </td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Worthington </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin inhibitörü </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Islet-1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> Hücre kültürü süpernatant </td></tr><tr><td> Anti-Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> Hücre kültürü süpernatant </td></tr><tr><td> Anti-P75 NTR </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3 özel reaktifler ve ekipman Tablo.

lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons

Spinal motor nöronlar, erken embriyonik sinir sisteminin geliştirilmesi yoluyla postmitotic aşamalarında doğru gelişir ve daha sonra dendrit ve aksonlar büyümeye. Ifade Nkx6.1 spinal motor nöronlar 1 için benzersiz öncü hücreler olduğunu nöral tüp nöroepitelyal hücrelerin. Postmitotic motor nöronlar nihai konumuna doğru hareket ve sütunlar halinde 2,3 spinal kanal boyunca kendilerini organize rağmen. Tüm bu farklılaşmış ve konumlandırılmış motor nöronlar% 90&#39;dan fazlası transkripsiyon faktörleri Islet 1 / 2 ifade eder. Onlar, uzuvların kasları yanı sıra beden ve iç organlar innerve. Diğerlerinin arasında, motor nöronlar genellikle yüksek reseptörler beyin türevli nörotrofik faktör (BDNF) ve nörotrofin-3 (NT-3), tropomiyozin ilgili kinaz B ve C (TrkB, TrkC) ifade eder. Tropomiyozin ilgili kinaz A (TrkA) 4 verilmemektedir. Iki yüksek reseptörler yanı sıra, motor nöronlar düşük afinite nörotrofin reseptör P75 NTR ifade. P75 NTR olgun nörotrofinler bağlamak yüksek reseptörler daha tüm nörotrofinler benzer ancak daha düşük afinite ile tüm nörotrofinler bağlayabilirsiniz. Embriyonik omurilik içinde, P75 NTR sadece spinal motor nöronlar 5 ile ifade edilir. Bu büyük çoğunluğunun hücreleri çevreleyen hücreler 6 arındırmak için motonöron izolasyon teknikleri geliştirmek için kullanılır olmuştur. P75 NTR ekstrasellüler etki karşı özel antikorlar (kaydırma) yardımı ile Yalıtımlı motor nöronlar tek bir deney için kullanılan antikor miktarı yüksek kaydırma için kullanılan plaka boyutu nedeniyle pahalı bir yöntem olduğu ortaya çıktı. Çok daha ekonomik bir alternatif lektin kullanımı. Lektin özellikle P75 NTR yanı sıra 7 bağlamak için gösterilmiştir. Aşağıdaki yöntem yerine P75 NTR antikor preplating prosedürü için buğday tohumu agglutinin kullanarak alternatif bir teknik anlatılmaktadır. Lektin NTR P75 antikor karşılaştırılabilir lektin P75 NTR antikor ve saflaştırma dereceleri son derece ucuz bir alternatif. Embriyonik omurilik motor nöronlar bu yöntemle izole edilebilir, hayatta kalmak ve neurites dışarı büyümek.

Watch this Scientific Journal Video about Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons at JoVE.com

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Omurilik fare embriyonik motor nöronlar izole alternatif bir yol tarif edilir. Bu yöntem, lektin düşük afinite sinir büyüme faktörü reseptör p75NTR bağlamak için aslında dikkate alır. Bu lektin tabanlı preplating p75NTR karşı spesifik antikor ile benzer bir arınma sağlar.

Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

lectin-based-isolation-and-culture-of-mouse-embryonic-motoneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.9K Görüntüleme.  Ruhr-University Bochum. Omurilik fare embriyonik motor nöronlar izole alternatif bir yol tarif edilir. Bu yöntem, lektin düşük afinite sinir büyüme faktörü reseptör p75NTR bağlamak için aslında dikkate alır. Bu lektin tabanlı preplating p75NTR karşı spesifik antikor ile benzer bir arınma sağlar.

Video: Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Diseksiyon, Kültür ve Analizi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyonik Retina Doku

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...