Biz Michael Feiss ve faj oluşturma ve arıtma ile ilgili rehberlik için Jean Sippy minnettarız. Biz hücre tanıma yazılımı, Schnitzcell sağlamak için Michael Elowitz ederim. , Welch Vakfı (Hibe Q-1759) ve İnsan Frontier Bilim: Golding laboratuarda çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM082837), Ulusal Bilim Vakfı (Yaşam Hücreleri Fizik Merkezi 082265, PFC) hibe tarafından desteklenmektedir Programı (RGY 70/2008).

<ol>
	<li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switches+in+bacteriophage+lambda+development.">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A genetic switch : phage lambda revisited. , (2004).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lambda II. , (1983).</li><li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Bacteriophage lambda. , (1971).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection.">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles.">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li><li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. , (1994).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical handbook of biochemistry and molecular biology. , (1989).</li><li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda.">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li><li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network.">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li><li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Personal communication with M. Feiss. , .</li><li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host:+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity.">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bakteriyel Suşlarının, Faj ve Plazmid: Gerinim LE392 supF olduğunu. O (ayrıntılar için bakınız Tablo 1) faj genomunda SAM7 mutasyon bastırmak için seçildi. Böylece indüklenmiş lysogens sonunda lyse ve faj parçacıkları serbest, litik yolu seçmiş gibi olacak infekte hücreleri olacak. Lizogenik hücreler 30 ° C&#39;de yetiştirilen faj genomu içinde 857 aleli CI hassas sıcaklık varlığı nedeniyle. Isı indüksiyonu sonrasında, GPD-EYFP ve yabani tip GPD λ LZ1 genomunun ve plazmid pPlate * D sırasıyla ikinci eş olarak ifade edilmiştir. Sonuç olarak, yeni oluşturulan faj λ LZ2 bir kapsid GPD-EYFP ve GPD proteinlerin bir karışımını içerir. Bu mozaik faj bireysel fajlar 5 algılanmasına izin vermek için yapısal istikrarlı ve yeterli floresan olduğunu. pP RE - mCherry lysogenic pathwa seçimi algılamak için kullanılan plazmid bir muhabiry. Promotor P RE lysogeny 1,11 kurulması sırasında CII tarafından aktive edilir. pP RE - mCherry 5 mCherry 12 gfp değiştirerek pE-gfp 11 türetilmiştir. Daha fazla ayrıntı için bizim daha önceki çalışmaları 5&#39;e bakınız. Büyüme Durum Parametreleri: Lysogen indüksiyonu sırasında (Bölüm 1), 180 rpm&#39;de hafif sallayarak iyi bir virüs verim 13 verir. Glukoz metabolizması kaçınılmalıdır büyüme ortamında glukoz kullanımı asidik metabolik ürünler üretir, ve olgun lambda parçacıklar asidik pH 13 de kararsız. MgSO4 ilavesi faj kapsid 3 stabilize hedefleniyor. Vahşi tip CI (yerine CI 857) taşıyan faj için lysogen DNA&#39;ya zarar veren ajan Mitomisin C 3 ile indüklenen olabilir. Adım 1.3 olarak, 37 inkübasyon ° C normal olarak 90 dakikayı geçmemelidir. Bu usef olduğunu<html> her 30 dakikada bir OD 600 ile hücre yoğunluğu kontrol etmek ul. İyi bir lizat için OD 600 0.2 veya daha az düşer ve kalan OD 600 hücre artıkları bir sonucudur. Yeni oluşturulan faj hücre enkaz içine DNA enjekte etmeye başlayabilir yana çok uzun kuluçka düşük bir faj verim neden olabilir. Adımlar 2.11 ve 2.13 &#39;de görünür bir faj bandı (en az 1 x 10 11 faj parçacıkları) elde etmek için, Adım 1.2&#39; de en az 500 ml kültür büyür. Adımları 5.1 ve 5.2 büyüme ortamının içine% 0.2 maltoz ilavesi kuzu, faj lambda adsorpsiyon 3,14 için reseptör ekspresyonu inducing hedefleniyor. MCherry - yerine Adım 5.2 &#39;de 100 kat 1000 kat seyreltme muhabiri plazmid pP RE mCherry plan düzeyinde azaltılması hedefleniyor. , 35 tetikleme faj DNA enjeksiyon için Basamak 5.5 &#39;te ° C sıcaklığa duyarlı allel cI857 indüksiyon önlemek için tercih edilir. Faj Arıtma: jove_content &quot;&gt; faj saflaştırma adımları (2.11 aracılığıyla adımlar 2.1) diğer arıtma protokolü 5 ile değiştirilir, ama CsCl denge degrade (Adımlar 2.12 ve 2.13) vasıtasıyla nihai Ultrasantrifügasyon kaçınılmaz olabilir. Sallanan kova rotor Adımlar 2.10 ve 2.12 için gerekli saf faj stok elde kolayca bir hafta kadar sürebilir. keskin görünür faj bantları sağlamak, bu yüzden emin bir şey ara adımları sırasında yanlış gittiğinde yapmak için yol boyunca faj titresi kontrol edilmesi gereklidir. Faj Elleçleme: Bölüm 2&#39;de tüm saflaştırma işlemleri sırasında, faj faj kafaları faj kuyrukları kesme önlemek için nazikçe lizat işlemek için kritik öneme sahiptir. Bölüm 5 (örn., 5.7 ile 5.5 adım) olarak hücre enfeksiyonu esnasında, bu da enfekte olmuş hücreden faj partiküllerinin makaslama önlemek için önemlidir. Faj DNA&#39;sını enjekte edildikten sonra enfekte olmuş hücreden makaslanmış ise, sonuç bir &quot;karanlık&quot; enfeksiyon olduğunu unutmayın, içinde yaniInfeksiyon sonuç deneyinde gözlenen ancak bulaşmasını faj olmaz edilecektir. Faj veya faj / hücre karışımı işleme her tür sorunları en aza indirmek için, geniş bir pipet kullanın. DAPI Test: DAPI (Bölüm 4) ile faj stok Boyama faj stok saflığını kontrol etmek için hızlı ve etkili bir yöntemdir. Aynı zamanda, zaman içinde mevcut bir faj stokunun olası bozulması için test etmek için de kullanılabilir. Saf bir stok için, flöresanlı bir mikroskop altında YFP ve DAPI sinyallerinin eş-yerelleştirme% 100&#39;e yakın olması gerekir. Biz genellikle YFP lekelerin% 1&#39;den az bu parçacıkların başarılı viral DNA paketlemek olmadığını gösterir ya da başka bir yerde zaten onların DNA enjekte ettiği DAPI (viral genom olmadan capsids temsilen), içermez gözlemliyoruz. DAPI lekelerin% 1&#39;den azı YFP (floresan olmayan faj karşılık) içermez. Bu durumda değilse, o da tekrar edilmesi 2.14 gerek yoluyla 2.12 StepsTekrar arındırmak için order. Hiçbir uzun vadeli yaşamak-hücre görüntüleme burada gerekli olduğundan görüntüleme parametreleri ile ilgili olarak, Adım 4.3 mikroskop kurulumu Bölüm 5 olarak önemli değildir. Istediği bir tek faj partikülünün floresans yoğunluğunu ayarlamak için Ancak, Bölüm 5 &#39;de anlatılanla aynı mikroskopi ayarları tutma yararlıdır. PBS-agaroz levha çok temiz, veya DAPI boya kullanılan çok fazla değilse, faj DNA ile ilgili olarak bazı DAPI lekeler &quot;halo&quot; terimi ile çevrelenmiş olabilir. Çok az DAPI boya kullanılması durumunda, DAPI kanal sinyali çok zayıf olabilir. Mikroskop Sistemi: Bölüm 6&#39;da görüntüleme için, biz bir 100x objektif (Plan Fluo, sayısal açıklık 1.40, immersiyon yağı) ve standart filtre setleri (Nikon) ile ticari bir ters Epifloresans mikroskobu (Eclipse TE2000-E, Nikon) kullanın. Floresan ışık kaynağının ışık yoğunluğunun kontrolü ile Arc lambadır. X, y ve z po: Aşağıdaki özellikler bilgisayar kontrollü olaraknoktası pozisyonu; parlak alan ve floresans panjurlar ve floresan filtre seçimi. Bir otomatik odaklama özelliği gereklidir. Aksi takdirde, odak kolayca time-lapse film (normalde 4 saat uzunluğunda) boyunca sürüklenip olabilir. Paralel birden fazla enfeksiyon etkinlikleri takip sağlar her zaman noktasında (x, y) birden fazla pozisyon alma yeteneği, yararlıdır. Biz genellikle 100 enfeksiyonu olayları takip etmek, her filmde 8 aşamalı pozisyonları kazanır. Kullandığımız kamera 16 bit (Cascade512, Fotometrik) bir dinamik aralık ile 16x16 mikron piksel kamera ile bir soğutmalı 512x512 CCD olduğunu. Toplama MetaMorph yazılımı (Molecular Devices) kullanılarak gerçekleştirilir. Mikroskop sıcaklık kontrollü bir odaya yerleştirildi olmalıdır; alternatif olarak, mikroskop aşama bir ısı kontrollü bir boşluk ile çevrili olmalıdır. Image Acquisition: Canlı hücre görüntüleme için, ağartma ve pho yol açabilecek örnek gereksiz maruziyeti önlemek için kritik öneme sahiptirtotoxicity. Bu nedenle, ilk ağartma aşırı veya hücre büyümesini engelleyen neden olmasa da floresan tespiti için izin verir, optimum ışık pozlama bulmak için sisteminizi karakterize etmek en iyisidir. İyi bir floresan görüntü elde etmek için, heyecan verici ışık şiddeti, maruz kalma süresi ve kamera kazanç ile oynamak. Adımlar 6.2-6.3 olarak, çerçeve 10 dakika süre ışığa maruz kalma en aza indirmek amacıyla seçilir. Her çerçeve, yalnızca tek bir odak görüntü faz-kontrast (hücre tanıması için) ve floresan kanalları (hücre kaderinin belirlenmesi için) gereklidir. Ilk zaman noktası olarak, YFP kanalı ile Bununla birlikte, çoklu z-pozisyon görüntü hücre yüzeyi üzerindeki tüm enfekte fajlar yakalamak için gereklidir. İlk çerçeve içinde YFP maruz kalma süresi de daha sonra zaman dilimlerinde hızlandırılmış film için kullanılan daha yüksek olması gerekir. Görüntü Analizi: Çok dikkatli Adım 7.1 hücre yüzeyi etrafında faj parçacıkları saymak. GibiYukarıda belirtildiği üzere, Adım 6.2 YFP kanalıyla z yığınlarının bir dizi çekmek. Ancak, bu hala sayma zorlukları bazı floresan faj partiküllerinin out-of-odak bırakabilir. Ilk bir zaman dilimi içinde hücre boyu Metamorph yazılımı kullanılarak ölçülür. Hücre uzunluğu da ImageJ ya da başka yazılım araçları ile ölçülebilir. Ayrıca, otomatik bir ev inşa Matlab programı, hücre soylarının birlikte zamanla floresans değişim olarak bilgi almak çok yararlı olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> Fisher Scientific </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> Sigma </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNaz </td><td> Sigma </td><td> R4642-10MG </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SM tampon </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> Iğne </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> Diyaliz kaset </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66333 </td></tr><tr><td> Mikroskop slayt </td><td> Corning </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti ultra net tüpü </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti ultra net tüpü </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> Refraktometre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> Epifloresans mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Tutulma TE2000-E </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Reaktifler ve cihazlar.

following cell-fate in e. coli after infection by phage lambda

Bakteriyofaj (faj) lambda ve bakteri E. oluşan sistemi coli uzun hücre-kader tayin 1,2 için bir paradigma olarak hizmet vermiştir. Faj bir dizi hücrenin eşzamanlı enfeksiyondan sonra iki yoldan biri seçilmiştir: litik (öldürücü) veya lizogenik (hareketsiz) 3,4. Yakın zamanda floresan bireysel fajlar etiketlenmesine yönelik bir yöntem geliştirilmiştir ve bireysel fajlar ve hücreler 5 seviyesinde, mikroskop altında gerçek-zamanlı olarak sonrası enfeksiyon karar incelemek için mümkün. Burada, bizim daha önceki çalışmalar 5 de tarif enfeksiyon deneyleri yapmak için tam bir prosedür açıklanmaktadır. Bu, floresan faj oluşturulması, hücrelerin enfeksiyonu, mikroskop altında görüntü ve veri analizi içerir. Floresan faj kapsid GPD protein &quot;melez&quot;, eş-ifade yabani tip ve YFP-füzyon versiyonları olduğunu. Ham bir faj lisatı birinci GPD-EYFP (ENH bir lysogen indüklenmesi ile elde edilirBir plazmid ifade vahşi tip GPD barındıran, Sarı floresan proteini) faj anced. Saflaştırma aşamaları uygulanarak, bir dizi daha sonra mikroskop altında DAPI-etiketleme ve görüntüleme takip edilerek yapılır. Bu tekdüzelik, DNA&#39;nın paketleme verimliliği, floresans sinyali ve faj stokunun yapısal stabilite doğrulamak amacıyla yapılır. Bakteriler için faj ilk adsorpsiyon ° C viral DNA enjeksiyon 6 tetiklemek için 35 kısa bir inkübasyon sonra, ardından buz üzerinde gerçekleştirilir. Faj / bakteri karışımı daha sonra, ince bir besleyici agar plaka, bir lamel ile kaplanmış ve bir mikroskop altında Epifloresans görüntülü yüzeyine taşınır. Enfeksiyon sonrası işlem 10 dakika aralıklarla, 4 saat boyunca takip edilir. Multiple stage pozisyonları ~ 100 hücre enfeksiyonları tek bir denemede izlenebilmektedir böyle izlenir. Her pozisyon ve zaman noktada, görüntüleri faz-kontrast kırmızı ve yeşil floresan kanalları elde edilir. Faz-kontrast görüntünün otomatik cel daha sonra kullanılırfloresan kanal enfeksiyonu sonucu karakterize etmek için kullanılan iken l tanıma: yeniden hücre büyümesi ve bölünmesi takip lysogeny faktörlerin hücre parçalama veya ifade (kırmızı), ardından yeni floresan fajlar (yeşil) üretimi. Edinilen time-lapse film manuel ve otomatik yöntemleri bir arada kullanarak işlenir. Her enfeksiyon olayı (fajlar bulaştırmaktan örneğin sayısı ve konumları) yanı sıra enfeksiyon sonucu (lizis / lysogeny) için enfeksiyon parametrelerinin belirlenmesinde Veri analizi sonuçları. İstenirse, ek parametrelerin elde edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda at JoVE.com

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Bu makale bakteriyofaj lambda, enfeksiyon bir floresan etiketli versiyonu hazırlamak için prosedürü açıklar<em&gt; E. coli</em&gt; Bakteriler, mikroskop altında enfeksiyon sonuçlanması sonrasında ve enfeksiyon sonuçlarının analizi.

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

following-cell-fate-in-e-coli-after-infection-by-phage-lambda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

23.0K Görüntüleme.  University of Illinois at Urbana-Champaign. Bu makale bakteriyofaj lambda, enfeksiyon bir floresan etiketli versiyonu hazırlamak için prosedürü açıklar E. coli Bakteriler, mikroskop altında enfeksiyon sonuçlanması sonrasında ve enfeksiyon sonuçlarının analizi.