Biz Michael Feiss ve faj oluşturma ve arıtma ile ilgili rehberlik için Jean Sippy minnettarız. Biz hücre tanıma yazılımı, Schnitzcell sağlamak için Michael Elowitz ederim. , Welch Vakfı (Hibe Q-1759) ve İnsan Frontier Bilim: Golding laboratuarda çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM082837), Ulusal Bilim Vakfı (Yaşam Hücreleri Fizik Merkezi 082265, PFC) hibe tarafından desteklenmektedir Programı (RGY 70/2008).

<ol>
	<li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switches+in+bacteriophage+lambda+development.">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A genetic switch : phage lambda revisited. , (2004).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lambda II. , (1983).</li><li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Bacteriophage lambda. , (1971).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection.">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles.">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li><li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. , (1994).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical handbook of biochemistry and molecular biology. , (1989).</li><li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda.">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li><li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network.">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li><li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Personal communication with M. Feiss. , .</li><li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host:+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity.">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bakteriyel Suşlarının, Faj ve Plazmid: Gerinim LE392 supF olduğunu. O (ayrıntılar için bakınız Tablo 1) faj genomunda SAM7 mutasyon bastırmak için seçildi. Böylece indüklenmiş lysogens sonunda lyse ve faj parçacıkları serbest, litik yolu seçmiş gibi olacak infekte hücreleri olacak. Lizogenik hücreler 30 ° C&#39;de yetiştirilen faj genomu içinde 857 aleli CI hassas sıcaklık varlığı nedeniyle. Isı indüksiyonu sonrasında, GPD-EYFP ve yabani tip GPD λ LZ1 genomunun ve plazmid pPlate * D sırasıyla ikinci eş olarak ifade edilmiştir. Sonuç olarak, yeni oluşturulan faj λ LZ2 bir kapsid GPD-EYFP ve GPD proteinlerin bir karışımını içerir. Bu mozaik faj bireysel fajlar 5 algılanmasına izin vermek için yapısal istikrarlı ve yeterli floresan olduğunu. pP RE - mCherry lysogenic pathwa seçimi algılamak için kullanılan plazmid bir muhabiry. Promotor P RE lysogeny 1,11 kurulması sırasında CII tarafından aktive edilir. pP RE - mCherry 5 mCherry 12 gfp değiştirerek pE-gfp 11 türetilmiştir. Daha fazla ayrıntı için bizim daha önceki çalışmaları 5&#39;e bakınız. Büyüme Durum Parametreleri: Lysogen indüksiyonu sırasında (Bölüm 1), 180 rpm&#39;de hafif sallayarak iyi bir virüs verim 13 verir. Glukoz metabolizması kaçınılmalıdır büyüme ortamında glukoz kullanımı asidik metabolik ürünler üretir, ve olgun lambda parçacıklar asidik pH 13 de kararsız. MgSO4 ilavesi faj kapsid 3 stabilize hedefleniyor. Vahşi tip CI (yerine CI 857) taşıyan faj için lysogen DNA&#39;ya zarar veren ajan Mitomisin C 3 ile indüklenen olabilir. Adım 1.3 olarak, 37 inkübasyon ° C normal olarak 90 dakikayı geçmemelidir. Bu usef olduğunu<html> her 30 dakikada bir OD 600 ile hücre yoğunluğu kontrol etmek ul. İyi bir lizat için OD 600 0.2 veya daha az düşer ve kalan OD 600 hücre artıkları bir sonucudur. Yeni oluşturulan faj hücre enkaz içine DNA enjekte etmeye başlayabilir yana çok uzun kuluçka düşük bir faj verim neden olabilir. Adımlar 2.11 ve 2.13 &#39;de görünür bir faj bandı (en az 1 x 10 11 faj parçacıkları) elde etmek için, Adım 1.2&#39; de en az 500 ml kültür büyür. Adımları 5.1 ve 5.2 büyüme ortamının içine% 0.2 maltoz ilavesi kuzu, faj lambda adsorpsiyon 3,14 için reseptör ekspresyonu inducing hedefleniyor. MCherry - yerine Adım 5.2 &#39;de 100 kat 1000 kat seyreltme muhabiri plazmid pP RE mCherry plan düzeyinde azaltılması hedefleniyor. , 35 tetikleme faj DNA enjeksiyon için Basamak 5.5 &#39;te ° C sıcaklığa duyarlı allel cI857 indüksiyon önlemek için tercih edilir. Faj Arıtma: jove_content &quot;&gt; faj saflaştırma adımları (2.11 aracılığıyla adımlar 2.1) diğer arıtma protokolü 5 ile değiştirilir, ama CsCl denge degrade (Adımlar 2.12 ve 2.13) vasıtasıyla nihai Ultrasantrifügasyon kaçınılmaz olabilir. Sallanan kova rotor Adımlar 2.10 ve 2.12 için gerekli saf faj stok elde kolayca bir hafta kadar sürebilir. keskin görünür faj bantları sağlamak, bu yüzden emin bir şey ara adımları sırasında yanlış gittiğinde yapmak için yol boyunca faj titresi kontrol edilmesi gereklidir. Faj Elleçleme: Bölüm 2&#39;de tüm saflaştırma işlemleri sırasında, faj faj kafaları faj kuyrukları kesme önlemek için nazikçe lizat işlemek için kritik öneme sahiptir. Bölüm 5 (örn., 5.7 ile 5.5 adım) olarak hücre enfeksiyonu esnasında, bu da enfekte olmuş hücreden faj partiküllerinin makaslama önlemek için önemlidir. Faj DNA&#39;sını enjekte edildikten sonra enfekte olmuş hücreden makaslanmış ise, sonuç bir &quot;karanlık&quot; enfeksiyon olduğunu unutmayın, içinde yaniInfeksiyon sonuç deneyinde gözlenen ancak bulaşmasını faj olmaz edilecektir. Faj veya faj / hücre karışımı işleme her tür sorunları en aza indirmek için, geniş bir pipet kullanın. DAPI Test: DAPI (Bölüm 4) ile faj stok Boyama faj stok saflığını kontrol etmek için hızlı ve etkili bir yöntemdir. Aynı zamanda, zaman içinde mevcut bir faj stokunun olası bozulması için test etmek için de kullanılabilir. Saf bir stok için, flöresanlı bir mikroskop altında YFP ve DAPI sinyallerinin eş-yerelleştirme% 100&#39;e yakın olması gerekir. Biz genellikle YFP lekelerin% 1&#39;den az bu parçacıkların başarılı viral DNA paketlemek olmadığını gösterir ya da başka bir yerde zaten onların DNA enjekte ettiği DAPI (viral genom olmadan capsids temsilen), içermez gözlemliyoruz. DAPI lekelerin% 1&#39;den azı YFP (floresan olmayan faj karşılık) içermez. Bu durumda değilse, o da tekrar edilmesi 2.14 gerek yoluyla 2.12 StepsTekrar arındırmak için order. Hiçbir uzun vadeli yaşamak-hücre görüntüleme burada gerekli olduğundan görüntüleme parametreleri ile ilgili olarak, Adım 4.3 mikroskop kurulumu Bölüm 5 olarak önemli değildir. Istediği bir tek faj partikülünün floresans yoğunluğunu ayarlamak için Ancak, Bölüm 5 &#39;de anlatılanla aynı mikroskopi ayarları tutma yararlıdır. PBS-agaroz levha çok temiz, veya DAPI boya kullanılan çok fazla değilse, faj DNA ile ilgili olarak bazı DAPI lekeler &quot;halo&quot; terimi ile çevrelenmiş olabilir. Çok az DAPI boya kullanılması durumunda, DAPI kanal sinyali çok zayıf olabilir. Mikroskop Sistemi: Bölüm 6&#39;da görüntüleme için, biz bir 100x objektif (Plan Fluo, sayısal açıklık 1.40, immersiyon yağı) ve standart filtre setleri (Nikon) ile ticari bir ters Epifloresans mikroskobu (Eclipse TE2000-E, Nikon) kullanın. Floresan ışık kaynağının ışık yoğunluğunun kontrolü ile Arc lambadır. X, y ve z po: Aşağıdaki özellikler bilgisayar kontrollü olaraknoktası pozisyonu; parlak alan ve floresans panjurlar ve floresan filtre seçimi. Bir otomatik odaklama özelliği gereklidir. Aksi takdirde, odak kolayca time-lapse film (normalde 4 saat uzunluğunda) boyunca sürüklenip olabilir. Paralel birden fazla enfeksiyon etkinlikleri takip sağlar her zaman noktasında (x, y) birden fazla pozisyon alma yeteneği, yararlıdır. Biz genellikle 100 enfeksiyonu olayları takip etmek, her filmde 8 aşamalı pozisyonları kazanır. Kullandığımız kamera 16 bit (Cascade512, Fotometrik) bir dinamik aralık ile 16x16 mikron piksel kamera ile bir soğutmalı 512x512 CCD olduğunu. Toplama MetaMorph yazılımı (Molecular Devices) kullanılarak gerçekleştirilir. Mikroskop sıcaklık kontrollü bir odaya yerleştirildi olmalıdır; alternatif olarak, mikroskop aşama bir ısı kontrollü bir boşluk ile çevrili olmalıdır. Image Acquisition: Canlı hücre görüntüleme için, ağartma ve pho yol açabilecek örnek gereksiz maruziyeti önlemek için kritik öneme sahiptirtotoxicity. Bu nedenle, ilk ağartma aşırı veya hücre büyümesini engelleyen neden olmasa da floresan tespiti için izin verir, optimum ışık pozlama bulmak için sisteminizi karakterize etmek en iyisidir. İyi bir floresan görüntü elde etmek için, heyecan verici ışık şiddeti, maruz kalma süresi ve kamera kazanç ile oynamak. Adımlar 6.2-6.3 olarak, çerçeve 10 dakika süre ışığa maruz kalma en aza indirmek amacıyla seçilir. Her çerçeve, yalnızca tek bir odak görüntü faz-kontrast (hücre tanıması için) ve floresan kanalları (hücre kaderinin belirlenmesi için) gereklidir. Ilk zaman noktası olarak, YFP kanalı ile Bununla birlikte, çoklu z-pozisyon görüntü hücre yüzeyi üzerindeki tüm enfekte fajlar yakalamak için gereklidir. İlk çerçeve içinde YFP maruz kalma süresi de daha sonra zaman dilimlerinde hızlandırılmış film için kullanılan daha yüksek olması gerekir. Görüntü Analizi: Çok dikkatli Adım 7.1 hücre yüzeyi etrafında faj parçacıkları saymak. GibiYukarıda belirtildiği üzere, Adım 6.2 YFP kanalıyla z yığınlarının bir dizi çekmek. Ancak, bu hala sayma zorlukları bazı floresan faj partiküllerinin out-of-odak bırakabilir. Ilk bir zaman dilimi içinde hücre boyu Metamorph yazılımı kullanılarak ölçülür. Hücre uzunluğu da ImageJ ya da başka yazılım araçları ile ölçülebilir. Ayrıca, otomatik bir ev inşa Matlab programı, hücre soylarının birlikte zamanla floresans değişim olarak bilgi almak çok yararlı olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> Fisher Scientific </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> Sigma </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNaz </td><td> Sigma </td><td> R4642-10MG </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SM tampon </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> Iğne </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> Diyaliz kaset </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66333 </td></tr><tr><td> Mikroskop slayt </td><td> Corning </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti ultra net tüpü </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti ultra net tüpü </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> Refraktometre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> Epifloresans mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Tutulma TE2000-E </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Reaktifler ve cihazlar.

following cell-fate in e. coli after infection by phage lambda

Bakteriyofaj (faj) lambda ve bakteri E. oluşan sistemi coli uzun hücre-kader tayin 1,2 için bir paradigma olarak hizmet vermiştir. Faj bir dizi hücrenin eşzamanlı enfeksiyondan sonra iki yoldan biri seçilmiştir: litik (öldürücü) veya lizogenik (hareketsiz) 3,4. Yakın zamanda floresan bireysel fajlar etiketlenmesine yönelik bir yöntem geliştirilmiştir ve bireysel fajlar ve hücreler 5 seviyesinde, mikroskop altında gerçek-zamanlı olarak sonrası enfeksiyon karar incelemek için mümkün. Burada, bizim daha önceki çalışmalar 5 de tarif enfeksiyon deneyleri yapmak için tam bir prosedür açıklanmaktadır. Bu, floresan faj oluşturulması, hücrelerin enfeksiyonu, mikroskop altında görüntü ve veri analizi içerir. Floresan faj kapsid GPD protein &quot;melez&quot;, eş-ifade yabani tip ve YFP-füzyon versiyonları olduğunu. Ham bir faj lisatı birinci GPD-EYFP (ENH bir lysogen indüklenmesi ile elde edilirBir plazmid ifade vahşi tip GPD barındıran, Sarı floresan proteini) faj anced. Saflaştırma aşamaları uygulanarak, bir dizi daha sonra mikroskop altında DAPI-etiketleme ve görüntüleme takip edilerek yapılır. Bu tekdüzelik, DNA&#39;nın paketleme verimliliği, floresans sinyali ve faj stokunun yapısal stabilite doğrulamak amacıyla yapılır. Bakteriler için faj ilk adsorpsiyon ° C viral DNA enjeksiyon 6 tetiklemek için 35 kısa bir inkübasyon sonra, ardından buz üzerinde gerçekleştirilir. Faj / bakteri karışımı daha sonra, ince bir besleyici agar plaka, bir lamel ile kaplanmış ve bir mikroskop altında Epifloresans görüntülü yüzeyine taşınır. Enfeksiyon sonrası işlem 10 dakika aralıklarla, 4 saat boyunca takip edilir. Multiple stage pozisyonları ~ 100 hücre enfeksiyonları tek bir denemede izlenebilmektedir böyle izlenir. Her pozisyon ve zaman noktada, görüntüleri faz-kontrast kırmızı ve yeşil floresan kanalları elde edilir. Faz-kontrast görüntünün otomatik cel daha sonra kullanılırfloresan kanal enfeksiyonu sonucu karakterize etmek için kullanılan iken l tanıma: yeniden hücre büyümesi ve bölünmesi takip lysogeny faktörlerin hücre parçalama veya ifade (kırmızı), ardından yeni floresan fajlar (yeşil) üretimi. Edinilen time-lapse film manuel ve otomatik yöntemleri bir arada kullanarak işlenir. Her enfeksiyon olayı (fajlar bulaştırmaktan örneğin sayısı ve konumları) yanı sıra enfeksiyon sonucu (lizis / lysogeny) için enfeksiyon parametrelerinin belirlenmesinde Veri analizi sonuçları. İstenirse, ek parametrelerin elde edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda at JoVE.com

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Bu makale bakteriyofaj lambda, enfeksiyon bir floresan etiketli versiyonu hazırlamak için prosedürü açıklar<em&gt; E. coli</em&gt; Bakteriler, mikroskop altında enfeksiyon sonuçlanması sonrasında ve enfeksiyon sonuçlarının analizi.

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

following-cell-fate-in-e-coli-after-infection-by-phage-lambda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

23.2K Görüntüleme.  University of Illinois at Urbana-Champaign. Bu makale bakteriyofaj lambda, enfeksiyon bir floresan etiketli versiyonu hazırlamak için prosedürü açıklar E. coli Bakteriler, mikroskop altında enfeksiyon sonuçlanması sonrasında ve enfeksiyon sonuçlarının analizi.

Video: Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

İntraperitoneal Enfeksiyon sonra Bağışıklık Hücreleri Ticareti Floresan Prion Çubuklar Saat İzlenmesi

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

Toplam Protein Ekstraksiyon ve 2-D Jel Elektroforez Yöntemleri<em&gt; Burkholderia</em&gt; Türler

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

Farelerde oral sonda ardından Probiyotik Maya Dönüşümü ve Gastrointestinal Bağışıklık Dokular Onların Kurtarma

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

Gıda kaynaklı patojen tarama kullanarak Manyeto-floresan Nanosensor: E. Coli O157: H7 hızlı tespiti

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...