MT Bir Doktora Öğrenciliği [ref tarafından desteklenmektedir. Yeni Araştırmacı Ödülü [ref tarafından 092839/Z/10/Z] ve CR. 095623/Z/11/Z] Wellcome Trust.

1.. İsteğe bağlı: FBM Atraksiyon Testi için Affı-jel Heparin Boncuk (Jel Boncuk) hazırlayın NOT: eksplant prosedürü başlamadan önce en az 1 gün jel boncuk hazırlayın. <ol><li> Oda sıcaklığında (RT) bir silindir üzerine 20 dakika için steril PBS ile 100 ul jel heparin boncuk süspansiyonu yıkayın. </li><li> 13000 x g, 5 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj içerisinde Pellet boncuk. Steril PBS ekleyin ve yıkama işlemi 4x tekrarlayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, PBS kaldırmak ve solüsyon ile boncuk kapsayacak şekilde bakımı, tercih edilen bir yeniden birleştirici protein ihtiva eden bir steril çözelti, küçük bir hacim içinde boncuk ıslatın. Bu protokol daha önce yayımlanmış bir deney 16 üretmek için PBS içinde 100 ul / ng yeniden birleştirici insan VEGF165 kullanır. </li><li> 4 ° C &#39;de bir silindir üzerinde 12 saat arasında, en az rekombinant protein çözeltisi ve 1 haftalık bir maksimum ile jel boncukları heparin inkübe </li></ol> 2. Kültür Ekle Kaplamas Arka beyin eksplantlar Corning kültürü üzerinde kültürlenmiştir, bir 8 um gözenek büyüklüğü ya da eşdeğer bir ekler ile ekler. Kültür uçlar da, damıtılmış su ile yıkandı, etanol ile sterilize edilmesi ve gerekli olana kadar% 70 etanol içinde saklanır verilen, protokolün tamamlanmasından sonra yeniden kullanılabilir. Not: Aşağıdaki adımlar, steril koşullar altında bir akış başlığı içinde yapılmalıdır. <ol><li> B27 (20 ul / ml) ile takviye edilmiş ortam Neurobasal oluşan eksplant kültür ortamı hazırlayın, glikoz (6 mg / ml) ve penisilin / streptomisin (5 ug / ml). </li><li> Yıkama kültür 5 dakika ve akış kaputu altında 5-10 dakika boyunca kuru için steril PBS ile ekler. </li><li> Bir 12well plakanın her oyuğuna ayrı ayrı bir kültür koyunuz. Not: ekler kuyunun içine sıkıca küçük bir itme gerekebilir. </li><li> , Neuro temelli ortam içinde 10-20 ug / ml fare laminin ile kültür uçları Kapak ve 37 ° C,% 5 CO (bir doku kültürü inkübatörü içinde, koyun <sub&gt; 2), 1 saat boyunca. Not: Kaplama eksplante gününde yapılmalıdır. </li></ol> 3. E11.5 fare embriyoları Hindbrains diseksiyonu <ol><li> Embriyonik günde bir etik onaylı prosedüre (E) 11.5 ile zamanlanmış hamile kadın fare itlaf ve buz L15 ortamı ile 100 mm plastik tabak embriyoları içeren rahim yerleştirin. Not: Tüm adımlar diseksiyon buz soğukluğunda L15 olarak gerçekleştirilmelidir. </li><li> Diseksiyon mikroskobu kullanılarak ve Dumont saatçi, embriyolar maruz rahim kas duvarı gözyaşı her embriyo bırakın, göbek bağını koparmak ve dikkatle sarısı kesesi kaldırmak, sayısı 5 forseps. </li><li> Geniş çaplı bir açıklığı olan bir plastik pastör pipeti kullanılarak, buz soğukluğunda L15 ile temiz bir plastik çanak içine her embriyo transferi. </li><li> Dumont forseps kullanarak, sadece ön ayakları üzerinde embriyo başını kesmek. Deney embriyoların genotiplendirmesi gerektiriyorsa, genomik DNA izolasyonu için doku örnekleri toplamak (örneğin küçük piecyolk kesesi veya kuyruk ucu 16,20) e. </li><li> Kadar baş sırt tarafını çevirin ve ince bir doku tabakası (Şekil 2B) ile kaplıdır 4. ventrikül, tanımlamak. Dikkatle roofplate delmek ve arka arka beyin ve omurilik üzerinde orta hat boyunca caudally bunu soyulmaya başlar ve rostrally Ortabeyin bitti. Beyin artık (Şekil 2C) maruz olmalıdır. </li><li> Dikkatle kalan baş mezenşimi ve arka beyin (Şekil 2B) ve Pial tarafına bağlı herhangi meninks uzak kızdırmak. </li><li> Beyin unfurls böylece orta beyin ve omurilik dokusu çıkarmak ve açık bir kitap hazırlanması (Şekil 2E) düz yalan olabilir. </li><li> Geniş çaplı bir plastik pastör pipeti kullanılarak, buzla soğutulmuş L15 ihtiva eden bir 12-yuvalı plaka her kesilmiş arka beyin transferi ve hindbrains parçalara edilene kadar buz üzerinde saklayın. </li><li> Geniş çaplı bir plastik Pasteur pipet kullanarak, bir günah aktarmakbunu yaklaşık 100 ul L15 bir damlacık kadar açık bir kitap hazırlama, ventriküler tarafını tutarak boş bir çanak gle Beyin,. </li><li> Aynı damlacık için kuluçkalanmıştır heparin jel boncuklarının birkaç mikrolitre aktarın. Not: boncuk büyüklükleri değişken olduğu için, bu yaklaşık 10 boncuk transferi ve daha sonra arka beyin içine nakil için optimal boyutunu seçmek tavsiye edilir. </li><li> Arka beyin dokusunda küçük bir gözyaşı yapın ve dikkatli bir şekilde doku içine düşürülmesi, orta hat ve arka beyin yanal kenarı arasında yaklaşık yarım, R5 / 6 düzeyinde arka beyin dokusuna 1-3 jel boncukları eklemek ve böylece boncuk sadece arka beyin yüzeyinin altında konumlandırılmış. NOT: diseksiyon prosedür deneyimine bağlı olarak, 5-20 dakika / arka beyin arasında sürebilir, ve yavrular büyük ise uzun bir süre içinde streç olabilir, herhangi bir durumda, hindbrains iyi için 3 saat otopside daha artık kültür olmalıdır Sonuçlar. </li></ol> 4. BeyinEksplant Culture <ol><li> Inkübatör kültür ekler içeren plakasını sökün, laminin kaplama çözüm aspire. </li><li> Kültür insert (Şekil 2G) üzerine kadar her Beyin ventral tarafı aktarmak, geniş çaplı bir plastik Pasteur pipet kullanarak, buz L15 ile dolu ayrı bir kültür çanak içine bir kültür koyunuz. Beyin uç zarı tamamen düz durmalıdır. </li><li> Dikkatle çanak kültürü eki kaldırın ve aşırı sıvı kaldırmak için temiz doku kağıt üzerinde bunu birkaç kez hafifçe sürün. Bu işlem, arka beyin, düz ve açık bir kitap hazırlanmasında kültür inserte yapışmasını sağlar. Beyin yukarı kıvrılan varsa, onun doku geri dönüşümsüz birlikte büyümek olabilir. </li><li> 500 ul önceden ısıtılmış kültür ortamı ile orijinal 12-plaka doldurun ve de bu geri yerleştirirler. Dikkatle Beyin şamandıra etmez sağlanması, sadece arka beyin karşılamak için başka bir medya 400-600 ul ile ses seviyesini ayarlamakzar kapatır. Bu yüzer ise, 4,4 adım ve arka beyin zara bağlı kalır kadar tekrar geri dönün. </li><li> Bu aşamada, bu FBM nöronların göç üzerindeki etkisini incelemek için ortama ilgi biyolojik inhibitörlerinin ilave edilmesi de mümkündür. NOT: boncuk implante veya diğer tedavileri uygulamak, bu deney başarıyla kurulduktan emin olmak için her deneyde, normal büyüme koşulları altında en az 2 kontrol eksplantlarının korumak için tavsiye edilir. </li><li> Bir doku kültürü kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO2) içinde 24-30 saat boyunca inkübe eksplantlar. </li></ol> 5. Beyin eksplant Wholemount Immunofluorescent Boyama <ol><li> Her kuyudan aspire ortam, PBS ile durulayın ve buz soğukluğunda% 4 formaldehit (PBS içinde çözülmüş% 4 paraformaldehid, taze hazırlanmış ya da taze çözülmüş) içinde hafif bir çalkalama ile 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca düzeltin. Not: fiksasyon öncesi kültür Ovülden arka beyin kaldırmak için çalışmayıntamamlandı. </li><li> 3 kez PBS ile yıkayın. Dikkatle Dumont forseps kullanarak kültürü ekler gelen hindbrains soyun. Bazı eksplantlan kalkmasına zordur, ancak genellikle tekrar tekrar pipetle PBS kovma yoluyla hafif bir basınç uygulayarak kaldırılabilir. </li><li> Immünfloresans etiketleme için 2.0 ml&#39;lik yuvarlak dipli tüpler hindbrains aktarın. Yumuşak haddeleme ile,% 0.1 Triton X-100 (PBT) ihtiva eden PBS içinde oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca hindbrains geçirgenliği. </li><li> Yumuşak haddeleme ile% 10 ısıyla inaktive edilmiş normal keçi serumu ihtiva eden PBT oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Isl1 için spesifik birinci antikor ile 5 gün boyunca 4 ° C&#39;de nazik bir haddeleme ile inkübe eksplantlar,% 1 ısı ile inaktive edilmiş normal keçi serumu ihtiva eden PBT içinde 1:100 oranında seyreltildi. </li><li> 15 dakika her biri için PBT ile RT 4x de eksplantlar yıkayın. </li><li> Fluorofor ile konjüge edilmiş keçi anti-fare antikoru (örneğin, Alexa Fluor 488 keçi anti ile, 3 saat boyunca oda sıcaklığında hafif bir haddeleme ile eksplantların inkübeFare,% 1 ısı ile inaktive edilmiş normal keçi serumu ihtiva eden PBT) 1:200 seyreltilmiştir. </li><li> Eksplantlar yumuşak haddeleme ile 15 dakika her biri için PBT ile oda sıcaklığında 4x yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 formaldehit içinde eksplantlar sonek. </li><li> Eksplantlarının için bir cep oluşturmak için 3 siyah elektrik bandı katmanları ve bir neşter katmanlı bant küçük bir kare ile ÖTV ile bir cam slayt kapağı; alternatif olarak, bir depresyon cam slayt kullanın. </li><li> Bir cebine Slowfade reaktif içinde her arka beyin montaj ve dikkatli bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak tuzak hava kabarcıkları ve görüntü kaçınarak, bir cam lamel ile kaplayın. Not: immun boyama için bir alternatif olarak, FBMS (örneğin Isl1 veya Phox2b) tanıyan riboprobes ile in situ hibridizasyon FBM nöronlar 16,21 görselleştirmek için kullanılabilmektedir. </li></ol> Adımlar ve zamanlama Özeti ~ 14 gün: E11.25 gebelik elde Çiftleşmeyi Zamanlı İsteğe bağlı: Boncuk hazırlık (Protocol 1): embriyo öncesi izolasyon gününde ~ 2 saat, Kültür ekler ve medya (Protokol 2) hazırlayın: ~ 30 dk önce, embriyo izolasyon Embriyo izolasyon ve Beyin diseksiyonu (3,1-3,4 adımlar): ~ 10 dk / embriyo Beyin diseksiyonu (3,5-3,7 adımlar): ~ 5-10 dakika / Beyin Eksplant prosedürü (3,8-3,9 adımlar): ~ 5-10 dakika / Beyin İsteğe bağlı: boncuk implantasyon (3,10-3,11 adımlar): ~ 5-10 dakika / Beyin Eksplant kültür (adım 4.7): 24 saat Antikor boyama Fixation (adım 5.1): 2 saat Boyama prosedürü ve görüntüleme (Protokol 5): 5 gün

<ol>
	<li>Lumsden, A., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+patterns+of+neuronal+development+in+the+chick+hindbrain.">Segmental patterns of neuronal development in the chick hindbrain.</a> Nature. 337 (6206), 424-428 (1989).</li><li>Chandrasekhar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+heads:+development+of+vertebrate+branchiomotor+neurons.">Turning heads: development of vertebrate branchiomotor neurons.</a> Dev. Dyn. 229 (1), 143-161 (2004).</li><li>Mapp, O. M., Wanner, S. J., Rohrschneider, M. R., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle1b+mediates+interpretation+of+migratory+cues+during+zebrafish+facial+branchiomotor+neuron+migration.">Prickle1b mediates interpretation of migratory cues during zebrafish facial branchiomotor neuron migration.</a> Dev. Dyn. 239 (6), 1596-1608 (2010).</li><li>Glasco, D. M., Sittaramane, V., Biol, D. e. v. .., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse Wnt/PCP protein Vangl2 is necessary for migration of facial branchiomotor neurons, and functions independently of Dishevelled. 369 (2), 211-222 (2012).</li><li>Marillat, V., Sabatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Slit+Receptor+Rig-1/Robo3+Controls+Midline+Crossing+by+Hindbrain+Precerebellar+Neurons+and+Axons.">The Slit Receptor Rig-1/Robo3 Controls Midline Crossing by Hindbrain Precerebellar Neurons and Axons.</a> Neuron. 43 (1), 69-79 (2004).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Vivancos, V., Chen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activity+guides+facial+branchiomotor+neuron+migration+and+involves+the+PCP+pathway+and+JNK+and+ROCK+kinases.">Wnt activity guides facial branchiomotor neuron migration and involves the PCP pathway and JNK and ROCK kinases.</a> Neural Dev. 4, 7 (2009).</li><li>Guan, K. -. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues.">Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 941-956 (2003).</li><li>Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+axon+guidance+of+cranial+motor+neurons.">Patterning and axon guidance of cranial motor neurons.</a> Nat. Rev. 8 (11), 859-871 (2007).</li><li>Garel, S., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+migratory+pathway+of+facial+branchiomotor+neurones.">Control of the migratory pathway of facial branchiomotor neurones.</a> Development. 127 (24), 5297-5307 (2000).</li><li>Gavalas, A., Ruhrberg, C., Livet, J., Henderson, C. E., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+defects+in+the+hindbrain+of+Hoxa1,+Hoxb1+and+Hoxb2+mutants+reflect+regulatory+interactions+among+these+Hox+genes.">Neuronal defects in the hindbrain of Hoxa1, Hoxb1 and Hoxb2 mutants reflect regulatory interactions among these Hox genes.</a> Development. 130 (23), 5663-5679 (2003).</li><li>Grant, P. K., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroepithelial+basement+membrane+serves+as+a+boundary+and+a+substrate+for+neuron+migration+in+the+zebrafish+hindbrain.">The neuroepithelial basement membrane serves as a boundary and a substrate for neuron migration in the zebrafish hindbrain.</a> Neural Dev. 5, 9 (2010).</li><li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+compartition+in+the+early+avian+hindbrain.">Segmentation and compartition in the early avian hindbrain.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1081-1088 (2004).</li><li>Tsuchida, T., Ensini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79 (6), 957-970 (1994).</li><li>Qu, Y., Glasco, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+cadherins+Celsr1-3+differentially+regulate+migration+of+facial+branchiomotor+neurons+in+mice.">Atypical cadherins Celsr1-3 differentially regulate migration of facial branchiomotor neurons in mice.</a> J. Neurosci. 30 (28), 9392-9401 (2010).</li><li>Schwarz, Q., Gu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+controls+neuronal+migration+and+cooperates+with+Sema3A+to+pattern+distinct+compartments+of+the+facial+nerve.">Vascular endothelial growth factor controls neuronal migration and cooperates with Sema3A to pattern distinct compartments of the facial nerve.</a> Genes Dev. 18 (22), 2822-2834 (2004).</li><li>Stockinger, P., Ma&#238;tre, J. -. L., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+neuroepithelial+cell+cohesion+affects+tangential+branchiomotor+neuron+migration+in+the+zebrafish+neural+tube.">Defective neuroepithelial cell cohesion affects tangential branchiomotor neuron migration in the zebrafish neural tube.</a> Development. 138 (21), 4673-4683 (2011).</li><li>Wanner, S. J., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+tracts+guide+zebrafish+facial+branchiomotor+neuron+migration+through+the+hindbrain.">Axon tracts guide zebrafish facial branchiomotor neuron migration through the hindbrain.</a> Development. , (2013).</li><li>Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cranial+motor+neurons+in+live+transgenic+zebrafish+expressing+green+fluorescent+protein+under+the+control+of+the+islet-1+promoter/enhancer.">Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer.</a> Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).</li><li>Laird, P. W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M. A., Jaenisch, R., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+mammalian+DNA+isolation+procedure.">Simplified mammalian DNA isolation procedure.</a> Nucleic Acids Res. 19 (15), 4293 (1991).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1 (1), 4 (2001).</li><li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants:+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development.">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J. Vis. Exp. (74), (2013).</li><li>Holland, P. J., George, A. M., Worrell, L. T. C., Landsberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electroporation+of+the+lower+rhombic+lip+of+midgestation+mouse+embryos.">In vitro electroporation of the lower rhombic lip of midgestation mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (66), (2012).</li></ol>

Yazarların hiçbiri çıkarlarını veya çatışan çıkarları rekabet var.

Bu protokol FBM nöronların göç incelemek için bir Transwell sistemde E11.5 fare hindbrains en wholemount kültür açıklar. Bu protokol Fare Beyin nörotoksinlerini ex vivo işleme ortamı, 24 saat bir süre için canlı ve göç tutulması sağlar. Bu yöntem, nöronal göç moleküler ve hücresel mekanizmaları tespit etmek isteyen araştırmacılar için çok sayıda deneysel avantajlara sahiptir. Geleneksel geçiş deneyleri kültür çanakları üzerinde matris içine küçük sinir doku parçaları eksplant ve eksojen uyaranlara yanıt olarak tek tek nöronların gözlem olanak ise, transwell tahlilinde önemli bir avantajı, ana organı ortamı içinde göç nöronlar işlemek için uygunluğu ve bu nedenle daha fazla fizyolojik bağlam. Önemli olarak, maddeler, hali hazırda administe ile ilişkili muhtemel yan etkilere engellemeyi, nöronal göç üzerindeki etkisini test etmek için ex vivo arka beyin eksplantlar uygulanabilirhamile bir fare bu maddeleri halka. Son olarak, ex vivo modeli, aynı zamanda, işlevi ve bloklama yapmayan antikorların olarak plasenta engeli, çapraz olmayan maddelerin test edilebilir. Bu sebeplerden dolayı avantajları, ex vivo kültür arka beyin akvaryum su içinde veya özel kullanımını gerektirir embriyonik beyinlerinin utero elektroporasyon, &#39;de suda çözünür küçük moleküller ile tedavi edilebilir zebra balığı embriyolar, kullanarak alternatif ve tamamlayıcı bir yöntem temin etmektedir Ekipman ve burada açıklanan kültürü tekniği daha usta daha zordur. Burada tarif edilen protokol bir başka avantajı, bu nedenle nöronal göç bir fare modeli civciv embriyo işlemek için geliştirilen bir standart embriyolojik yöntemin uygulanmasını sağlayan, yeniden birleştirici proteini veya diğer reaktifler batırılmış boncuk implante olan amenability olduğunu. Özel olarak, ex vivo kültür modeli genetik olarak farelerin hindbrains tatbik edilebilir arızalıgibi büyüme faktörü reseptörleri ya da yönlendirme gibi nöronal göç karıştığı spesifik molekülleri, in göstermeyen primer ve ligandlara yanıt kayıp olmadığını test etmek için boncuk implantlar ile birlikte. , Farmakolojik manipülasyonlara karşı ek olarak, ex vivo kültür protokolü de ilginç genlerin ekspresyonunu idare edebilir ifade vektörlerini elektroporasyonu için adapte edilebilir, elektroporasyon için uygun yöntemler, daha önce 22,23 tarif edilmiştir. Rosa26Yfp 21; Bu protokol, aynı zamanda, floresanla işaretlenmiş FBM nöronlar, örneğin Isl1-Cre içeren, transjenik farelerden alınan arka beyin eksplantlarında zaman atlamalı mikroskobu ile nöron göç görselleştirmek için uyarlanabilir. Bu büyük embriyonik aşamada hindbrains kullanımını gerektirecektir ve en fazla 48 saat boyunca kültür gerekebilir, ancak son olarak, bu protokol, aynı zamanda, bu tür alt zeytin oluşturdukları gibi arka beyin içinde göç nöron diğer türleri, çalışma için kullanılabilir, nöronal canlılığı bağlı olarak <em&gt; Ex vivo. Kritik adımlar ve sorun giderme Bu protokolün başarısı için, embriyolar FBM nöron göçü sadece başladı E11.25, yakın günlük E11.5, erken toplanan çok önemlidir. Bununla birlikte, bunun nedeni birleşme farelerin doğal değişkenlik için bu gelişme aşamasında embriyolar yakalamak ve buna göre farklı deneyler arasında FBM göç uzanan bazı değişkenlik olabilir, her zaman mümkün değildir. Deney Şekil 3E de görülebileceği gibi, atanan zaman çerçevesi içinde, yaklaşık 3 saat tamamlanmaması durumunda FBM göç değişkenlik de gözlenebilir. E11.25 fare embriyoları Beyin dokusu hassastır. Kesme ve eksplant prosedür boyunca, bu FBM nöronların bulunduğu r4-R6 arasındaki alanlarda arka beyin doku yarılmaması önemlidir. Nedeniyle Diss hassas doğasıhindbrains kültürün içine yerleştirilir hangi hız sonucu etkiler ection süreç, çünkü, prosedür kıymetli numuneler veya reaktifler kullanılır özellikle önce, uygulama bir kaç usta çalışır sürebilir. Son olarak, kültür sırasında arka beyin dokusunun katlanır (Şekil 3F bakınız), normal FBM göçünü önler, çünkü arka beyin doku kültürü uçta açık bir kitap konfigürasyonda yerleştirilir önemlidir.

Embriyonik nöronların beynin ventriküler bölgesinde doğmuş, ancak daha sonra büyük bir mesafe bulunmaktadır uygun hedef bölgelerine ulaşmak için yeni hedeflere göç edilir. Gelişmekte olan beynin ön-ventral ve ön-arka eksen boyunca uygun yerlere nöronal hücre organlarının doğru konumlandırma göçmen aşamasında 1-4 sonra doğru kablolama, hayatta kalma ve bu nöronların fonksiyonu için gereklidir. Akson rehberlik 5-7 kontrol moleküler mekanizmalarına benzer, çekici ve itici ipuçlarının birleştirici setleri göç nöronlar 1,8 rehberlik düşünülmektedir. Ancak, birden fazla hücre türlerine etkileşimler, nöronal göçü kontrol sinyalleri daha az yaygın olarak bağımsız hücre incelenebilir akson rehberlik, katılan daha incelenmiştir. Omurgalıların gelişmekte Beyin moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak için birkaç son çalışmalarda kullanılmıştırnöronal göç, civciv, fare ve zebra balığı 1-4,9 örneğin. Bu organ, birkaç precerebellar alt tipleri ve motor nöronlar 5,7,10,11 dahil nöronlar birkaç farklı tiplerini içerir. Beyin motornöron zemin plakası yakın ventriküler bölgesinde doğmuş ve menşe 1,12 kendi rhombomere göre belirli alt kümeleri ayırt edilir. Yüz branchiomotor (FBM) nöronlar arka beyin bölgesinde rhombomere (r) 4 üretilen ve yüz kasları 2,9,13 innerve ikinci brankial kemer içine dorsal bir r4 çıkış noktasından aksonları uzanır. Zebra balığı ve fareler FBM nöronlar bu nöronlar tekrarlanabilir bir spatiotemporally iyi tanımlanmış süreç içinde somata translocate, çünkü kolayca görüntülenmiştir bir süreçte nöronal göç moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için mükemmel bir model sağlar. Farelerde, FBM nöronlar ilk cau göççattı r5 yoluyla ve daha sonra hem kaudal ve ventral olarak onlar VII kranial sinir (VIIn) 10,11,14 ve eşleştirilmiş çekirdekleri oluşturmak R6, topraklarında arka beyin ve Pial tarafında kendi nihai konuma ulaşmak için. Zebra balığı, FBM nöronlar başlangıçta ventrale göç ve ardından laminin-bağımlı bir şekilde 4,12,15,16 pial yüzeyine doğru göç devam r4-r5 sınırında yönünü değiştirmek. Bu göç gelişmesinde birkaç günlük bir süre boyunca devam eder ve bu iki farklı süreçleri aracılık moleküllerinin tanımlanmasına izin veren, teğet ve radyal göç evreye ayrılabilir. Buna karşılık olarak, civciv embriyosu arka beyin bölgesinin FBM nöronlar r4 3,13,17-19 kalır. Göçleri sırasında, FBM nöronlar homoeodomain transkripsiyon faktörü adacık 1 (Isl1) 14 kendi ifadesi ile, diğer türleri veya motor nöronları gibi, tespit edilebilir. Bu nedenle, wholFarklı gelişme aşamalarında, bu marker için emount immünofloresan boyama ya da in situ hibridizasyon zebrabalıkları veya fare 4,15,16 olarak R6 r4 uzanan FBM somata en belirgin göç akışı ortaya koymaktadır. Ayrıca, bu tür Isl1-GFP floresan transgenik muhabir zebrabalıkları 3,17-19 içinde FBM nöronlar göç görselleştirmek için uygun bir araç olarak kullanılmıştır. Serbest yaşayan embriyoları hücre nakli teknikleri ve akvaryum suya doğrudan uygulanan farmakolojik bileşikler ile kolayca manipüle edilebilir, çünkü görüntüleme için uygunlukları ek olarak, pek çok araştırmacı, zebra balığı gelişmekte FBM nöronların göç inceledik. Buna karşılık olarak, fare embriyosu rehberlik sufle veya plasenta engeli çapraz olmayan fonksiyonu bloke edici antikorların verilmesini taşıyan boncukların implantasyonu engelleyen, rahim içine geliştirir. Ayrıca, hamile anneye uygulanan farmakolojik bileşikler un olabilirdolaylı embriyojenezinin bozabilir istenen yan etkileri. Bu sınırlama engellemeyi, biz 7,16 explanting sonra 24 saat boyunca FBM nöron göç ve yaşam ile uyumlu tüm fare arka beyin için bir ex vivo kültür yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, kolay farmakolojik manipülasyon, rehberlik ipuçları veya fonksiyon-bloke edici antikorların verilmesini taşıyan boncuk yerleştirilebilmesine ve aynı zamanda farklı gelişim aşamalarında arka beyin diğer nöronal alt tiplerinin göçünü incelemek için uyarlanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="575">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">211-2120</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Cell culture plates, 12 well</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150628</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Plastic cell culture dish, 100 mm</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150288</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:104px;">3477</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:111px;">Dumont</td>
			<td style="width:104px;">91150-20</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P4417</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Laminin mouse protein</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">23017-015</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Primary antibody, Isl1</td>
			<td style="width:111px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:104px;">39.4D5</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">A11029</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21103</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">B27 supplement (50x)&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">17504-044</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Leibovitz&#8217;s L-15</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21083-027</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Penicillin/ streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15070</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Glucose</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">101174Y</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">G9023</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">T8787</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Slowfade Antifade Kit</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">S-2828</td>
			<td style="width:147px;">Alternative mounting solutions may be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0912</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Cover glass</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Affi-Gel Heparin Beads</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td style="width:104px;">153-6173</td>
			<td style="width:147px;">Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:215px;">Recombinant human VEGF165</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:104px;">293-VE</td>
			<td style="width:147px;">Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse hindbrain ex vivo culture to study facial branchiomotor neuron migration

Embriyonik nöronların beynin ventriküler bölgesinde doğmuş, ancak daha sonra uygun hedeflere ulaşmak için yeni hedeflere göç edilir. Işbirliği embriyonik beyinde nöronal göç rehberlik moleküler sinyalleri deşifre karmaşık sinir ağları daha sonra doğum sonrası yaşama destek veren formu nasıl anlamak için önemlidir. Fare embriyosu arka beyin Yüz branchiomotor (FBM) nöronları arka beyin ve R6 türetilmiş bölgesinde eşleştirilmiş yüz çekirdeklerini oluşturmak için rhombomere (r) 4 kaudal göç ederler. Burada FBM göç düzenleyen sinyal yollarını araştırmak için uygun fare embriyo hindbrains arasında Wholemount ex vivo kültür için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yöntemde, E11.5 fare embriyo hindbrains 24 saat boyunca hücre kültürü ekler üzerinde açık bir kitap hazırlanmasında kesildi ve kültüre edilir. Bu süre boyunca, FBM nöronlar R6 doğru göç kaudal ve bloklama yapmayan antikorların fonksiyon ve küçük Moleküller maruz kalabilirnöronal göç yol gösterilen sinyalleme yolaklarında roller incelemek için, rekombinant proteinleri ile yüklenen kültür ortamı heparin ya da tanelerinde es.

Bu bölüm, ex vivo kültür yoluyla fare arka beyin nöron FBM içinde göç inceleyerek elde edilebilir sonuçlarının örneklerini göstermektedir. Bu 11 günlük fare embriyolarından eksplante hindbrains olarak FBM nöronlar ilk teğetsel geçiş (Şekil 3A) tabi tutulur ve daha sonra in utero davranışları benzer yüz motor çekirdeği (Şekil 3B), (Şekil 1) monte başlar göstermektedir. Biz daha önce gösterildiği gibi, 16, VEGF165 batırılmış boncuk implantasyon, FBM nöronlar (Şekil 3C ve 3D) çeken göstermektedir. Perfüze olmayan damar kültür 16 bozulur çünkü Daha da önemlisi, bu protokol, kan damarları ya da rahimde FBM göç etkileyebilmektedir damar kaynaklı faktörler yokluğunda FBM göç okuyan sağlar. Taze üzerinde Isl1 fare antikoru kullanılarak Böylece, spesifik kan hücresi etiketleme görülmektedirizole edilmiş fare hindbrains (Şekil 1) kültür (Şekiller 3A-F), 24 saat sonra, artık arka beyin dokusunda bulunur. Arka beyin embriyo izolasyonu (Şekil 3E) sonra ya da yakında eksplante değildi çünkü Son olarak, ya da, eksplante doğru ve bu nedenle de anormal dağılımında FBM nöronlar içeren değildi hindbrains iki örnek göstermek için (transwell içinde katlanmış arka beyin dokusu Şekil 3F). <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1.jpg" /> Şekil 1. FBM nöron göç Isl1 Wholemount immunolabeling ve flatmounting sonra yabanıl tip fare hindbrains Konfokal z-yığını,.. Bir E11.5 arka beyin ve arka beyin orta hat tüm panellerde bir yıldız işareti ile belirtilen (A) Ventriküler yüzey<html> R6 R4 kendi teğet göç gösteren Isl1 pozitif FBM nöronlar (ok) içeren bir alan;. Anlage ihtiva eden bölgede, aynı arka beyin yarısı içinde R4, R5 ve R6&#39;nın konum belirtilmiştir (A &#39;) Pial yüzey . teğet (ok) göç FBM nöronların ihtiva eden bir E12.5 arka beyin bölgesinin (VIIn ile gösterilir) eşleştirilmiş FBM çekirdeklerin biri, hem de diğer Isl1 pozitif nöron popülasyonlarının (B) Ventriküler yüzey, ok ucu bir örnek gösterir spesifik olmayan Isl1 fare IgG antikoru belirlemek için kullanılan anti-fare ikincil antikoru çapraz reaksiyon ile etiketlenir dolaşımdaki hücreleri ihtiva eden bir kan damarının. (B &#39;) içeren aynı E12.5 arka beyin, bir yarısının Pial yüzey Eşleştirilmiş FBM çekirdeklerin bir. Orta hat, her panelde bir yıldız işaretiyle gösterilir. Ölçek çubuğu (tüm paneller): 200 mikron. V, ventral, P, Pial./ 51397fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2.jpg" /> Şekil 2. E11.5 fare Beyin diseksiyonu ve ex vivo kültür. (AE) E11.5 Beyin diseksiyon protokolü Anahtar adımlar; ölçek çubuğu:. Uzakta ön ayakları seviyesinde embriyonun kalanından kesildi sonra embriyonun 1 mm (A) Baş (B) bir rostral kısmı. baş çıkarıldı ve 4. ventrikül (ok) yukarı doğru dönük olduğu kadar kafa dokusunun geri kalan kısmı bir yer. (C) 4. ventrikül Çatı soyulur, ve arka beyin uzak arka beyin altında doku soyulması ile ortaya edildi rostrally ve kaudal. (D) Pial membran (bu eski unutmayın çıkarıldıgeniş, bir servikal spinal kord (SC) ya da doku) arka beyin bağlı kalmıştır. (E) Fazla orta beyin (MB) ve omurilik (SC) ya da doku, sadece arka beyin korumak için kaldırılmıştır. (F) kültür ekleri ile kaplanmıştır laminin ve bir 12 gözlü bir doku kültür levhası içine yerleştirildi. (G) her bir arka beyin bir elemanının üzerine yerleştirilir ve ortamı ile kaplandı. (H) kültür 24 saat boyunca FBM nöronlar (mavi) göç tarafından alınan yolun şematik temsili. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" target="_blank">tıklayın Daha büyük resmi görmek için.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3.jpg" /> Şekil 3,. Fare Beyin ex vivo kültür. (A, B) bir arka beyin E11.5 24 saat ve immunofluoresc için kültürlendi<html> ently bir eksplant içinde FBM nöron geçişini göstermek için Isl1 etiketlenmiştir, ventriküler (A) ve pial arka beyin (B) kısımlarının her iki gösterilmiştir (C, D) E11.5 yavru hindbrains soaked implante boncuk heparin mevcudiyetinde kültürlenmiştir. PBS (C) ya da VEGF165 (D) içerisinde; FBM nöronlar doğru ve VEGF165 boncuk üzerine göç ve göç eden akım, bu nedenle, aynı arka beyin veya kontrol tanesi ihtiva eden arka beyin ve muamele edilmemiş tarafa göre daha fazla kaudal uzatılmış unutmayın (E. , tatmin edici E11.5 arka beyin FBMS R4 göç yok ettiği eksplantlar, (E), veya F) örnekleri, burada kültür (F) boyunca katlanmış arka beyin dokusudur. Orta hat, her panelde bir yıldız işaretiyle gösterilir. (Tüm paneller için) Ölçek çubuğu: 200 mikron. V, ventral, P, Pial.&quot;&gt; Daha büyük resmi görmek için buraya tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration at JoVE.com

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embriyonik nöronlar nöral tüp ventriküler bölgesinde doğmuş, ancak uygun hedeflere ulaşmak için göç edilir. Yüz branchiomotor (FBM) nöronlar nöronal göç incelemek için yararlı bir model vardır. Bu protokol FBM göçünü düzenleyen mekanizmaların araştırılması fare embriyo hindbrains arasında Wholemount ex vivo kültür açıklar.

Fare Beyin<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kültür Yüz Branchiomotor Nöron Göç Eğitim için

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

mouse-hindbrain-ex-vivo-culture-to-study-facial-branchiomotor-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

11.1K Görüntüleme.  University College London.  Embriyonik nöronlar nöral tüp ventriküler bölgesinde doğmuş, ancak uygun hedeflere ulaşmak için göç edilir. Yüz branchiomotor (FBM) nöronlar nöronal göç incelemek için yararlı bir model vardır. Bu protokol FBM göçünü düzenleyen mekanizmaların araştırılması fare embriyo hindbrains arasında Wholemount ex vivo kültür açıklar. 

Video: Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Nörobilim

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Kemirgen neuroblasts nucleofection Neuroblast Göç Eğitim için<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

Embriyonik Neurogenesis çalışmak için bir Model olarak fare arka beyin

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Ateş Ex Vivo sıçan beyin dilimleri kullanarak birincil olayları incelemek için alternatif bir yaklaşım

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

Aksonal İnhibisyon ve Rejenerasyon Çalışması için Sıçan Modelinde Yüz Sinir Cerrahisi

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Fonksiyonel Çalışma için Ex Vivo Basınçlı Hipokampal Kapiller-Parenkimal Arteriyol Hazırlığı

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

Tadı Uyaranlara Fare Genikül Ganglion Nöron Yanıtlarının In vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...