Nous remercions le Yacoub Institut Magdi (IPR) pour appuyer les analyses de microscopie et les projets impliquant la réparation cardiaque, les techniciens et le directeur de notre animalerie. Ce travail a été soutenu par la British Heart Foundation (BHF), subvention de projet PG/10/019. MPS est soutenu par le IPR et BHF. TP est un Fellow excellence BHF-recherche. NR est un NH &amp; MRC Australie Fellow.

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les organisations internationales (la directive 2010/63/UE du Parlement européen) et national (Home Office britannique, loi de 1986) des règlements. Les procédures décrites ici font partie de notre plan de travail en vertu des autorisations de licence au Royaume-Uni et n&#39;ont pas été entrepris dans le but de l&#39;enregistrement. Une. Préparation des cellules Ce protocole décrit la préparation d&#39;une lignée cellulaire spécifique (rein embryonnaire humain, des cellules HEK293) à des fins de démonstration. Protocoles spécifiques aux cellules doivent être utilisées pour la culture et, éventuellement, la différenciation des cellules souches pluripotentes ou adultes dans des lignées cellulaires spécifiques. <ol><li> Cultiver les cellules dans du milieu DMEM (taux élevé de glucose, 4500 mg / L) contenant du pyruvate de 1% de sodium, 2 mM de glutamine, 1% d&#39;antibiotique Pen / Strep et 10% de sérum bovin fœtal (FBS). Une plaque de 10 cm doit être normalement divisée à 01h03 et médias complétée frais tous les deux jours. </li><li> Traiter les cellules légèrement avec trypsen 1x et remettre en suspension dans du milieu DMEM décrit dans 1:1. </li><li> Compter les cellules dans un hémocytomètre et la chambre de collecte de 3 x 10 6 cellules dans un tube séparé. </li><li> Centrifuger dans un seau rotor oscillant à 100 g pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant et laver le culot de cellules avec un tampon de phosphate stérile 2x. </li><li> Remettre en suspension dans du PBS 1x à une concentration de 10 6/50 pi pour l&#39;injection dans le ventricule gauche de souris immunodéplétion. </li></ol> 2. Conditions préchirurgicales <ol><li> Maintenir souris immunodéplétion (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) avec des granulés stériles alimentaires et de l&#39;eau dans un isolateur à température contrôlée (22 ° C; tableau 1) avant chaque intervention. </li><li> Effectuer la chirurgie de souris immunodéplétion sous une hotte à flux laminaire. Nettoyer la zone de travail avec 70% d&#39;éthanol et l&#39;autoclave outils chirurgicaux (pinces et ciseaux). </li><li> Mettez coussins chauffants pour la chirurgie et pour la reprise. Les coussins chauffants sont importantspour bloquer la diminution de la température du corps se produisant pendant et après la chirurgie. </li><li> Placez une cage propre et stérilisé sur le pavé de récupération de chauffage. </li><li> Transporter les souris dans leur cage d&#39;origine à partir de l&#39;isolateur de la salle d&#39;opération à l&#39;autoclave dans un sac stérile. </li><li> Peser la souris et en fonction du poids corporel injection sous-cutanée (sc) une solution contenant la médétomidine et de chlorhydrate de kétamine dilué dans 0,9% de solution saline stérile pour anesthésier les souris, ainsi que pour relaxer la musculature (médétomidine 1 mg / kg; chlorhydrate de kétamine 75 mg / kg). </li><li> Débranchez la souris de la cage lorsqu&#39;il est complètement anesthésié (dans 1-2 min, pas de pincement pincée réflexe après stimulation) </li><li> Appliquer les cheveux crème dépilatoire sur le côté gauche de la poitrine et de la région de la gorge. Après un laps de temps approprié (environ 2-5 min), essuyer les poils à un tissu mouillé d&#39;eau. </li><li> Placer la souris sur le panneau de chirurgie dans une position couchée sur le dos. À partir dele point de vue du chirurgien la position verticale, la queue basse-tête. </li><li> Injecter la solution analgésique à 0,1-0,2 ng / g dilué dans une solution saline stérile (buprénorphine) dans le membre postérieur voie sous-cutanée et couvrir la zone rasée avec l&#39;iode solution de povidone aseptique en utilisant un applicateur coton-tige. </li><li> Focaliser le microscope (objectif 2.5X) sur la zone de la gorge. </li></ol> 3. Conditions chirurgicales <ol><li> Avec des ciseaux émoussés faire une incision de la peau ventrale médiane d&#39;environ 0,5-1 cm de longueur légèrement en dessous du cartilage cricoïde. Séparer la peau des tissus conjonctifs de visualiser les glandes salivaires. </li><li> Divisez les glandes salivaires sur leur division médiane naturel en tirant simultanément chaque partie latéral avec pince et magnétique poitrine enrouleur et exposer la trachée. </li><li> Tirez la languette doucement sur le côté pour exposer le larynx. Faites glisser le tube d&#39;intubation avec précaution dans la trachée. La pointe du tube est visible à travers la l affichéearynx et de la trachée. Il est important, si le tube est dans, mais pas clairement visible, il est dans l&#39;œsophage. Retirez-le et changer la position de la pointe du tube. </li><li> Connectez le tuyau à la machine de ventilation. Réglez le volume de la course à 200 pi et 150 AVC / min. Fixer le tube de ventilation sur le panneau de la chirurgie avec une bande. </li><li> Avec des ciseaux et des pinces émoussés, faire une queue verticale à la tête de 1 - 1,5 cm de long incision de la peau sur la zone du thorax gauche. </li><li> Desserrez la peau des couches de tissu / musculaires conjonctifs et les majeurs et mineurs muscles pectoraux sans incisions. </li><li> Effectuer une thoracotomie entre les troisième et quatrième nervures comme suit: <ol><li> Perforer la couche musculaire intercostal par pincement et le grattage avec de petites pinces arrondis. </li><li> Une fois que la couche musculaire intercostal est perforé, placer l&#39;enrouleur de la poitrine d&#39;ouvrir au maximum la cavité thoracique. Les parties supérieures et moyennes du ventricule gauche (VG) avec son pavillon de recouvrement (atrium) sontmaintenant visible. </li></ol></li><li> Préparer une seringue de précision avec des cellules. La seringue doit être en mesure de livrer une quantité de volume de 10 ul pour chaque injection. Jetez un aiguille 30 G à l&#39;extrémité de la seringue. </li><li> Fixer avec du ruban adhésif, une petite canule en plastique (à partir d&#39;un Introcan-W 20 G) sur l&#39;aiguille, laissant exposés seulement 1 mm dont l&#39;extrémité ouverte de l&#39;aiguille. Cela permettra d&#39;éviter que l&#39;aiguille de perforation de la paroi ventriculaire gauche et la totalité de l&#39;injection des cellules dans la cavité du ventricule gauche. </li><li> Avec l&#39;aide d&#39;un objectif 5X, de visualiser à ce grossissement du ventricule gauche et d&#39;injecter les cellules dans la paroi ventriculaire gauche dans 5 endroits différents (chaque injection livrera 10 ul pour un total de 106 cellules injectées). Si l&#39;injection est réussie, une zone blanche et l&#39;absence de grand lavage des cellules seront visibles (si l&#39;injection n&#39;a pas réussi, l&#39;animal serait exclu de l&#39;analyse fonctionnelle). </li><li> Retirez l&#39;enrouleur. Fermez la paroi thoracique by joignant les deux nervures séparées avec deux points de suture de soie 6-0. </li><li> Hydrater les muscles pectoraux et la peau avec un coton-tige trempé dans du PBS 1x et posez-les délicatement les muscles du dos dans la position initiale avec la pince. </li><li> Fermer la peau avec 3-4 points de suture de soie 6-0. Suturer l&#39;incision de la gorge avec 2-3 points de suture pour refermer la peau. </li><li> Injecter atipamezole (1 mg / kg la concentration finale) pour revenir aux effets anesthésiants. </li><li> Dès que la souris commence à respirer de manière autonome, prendre le tube de la trachée et de mettre la souris sur le côté droit. On prévoit que la souris pour récupérer en quelques minutes. </li><li> Lorsque la souris se met à tourner et marcher, le placer dans la cage de récupération à chaud (petite cage IVC avec haut filtrée fermée) pendant une heure. </li><li> Laissez les animaux la nuit dans une boîte chauffée contrôlée (37 ° C). </li><li> Remplir un plat avec de l&#39;eau et de la nourriture à granulés pour soutenir la reprise au cours des 2 premiers jours après la chirurgie. </li></ol> Dix coeurs injectées avec des cellules et 10 coeurs contrôle pas injectés sont analysés histologiquement comme suit: <ol><li> Effectuer l&#39;analyse des cellules greffées 1 semaine après l&#39;injection (figures 1 et 3). <ol><li> Après euthanasie par une surdose d&#39;isoflurane, perfuser les coeurs avec 20 ml de paraformaldéhyde 4% (PFA) pour fixer le tissu. Déshydrater le tissu fixé en pourcentage croissant de l&#39;éthanol (à partir de 70-100%) et de l&#39;intégrer dans des blocs de paraffine. </li><li> Section des coeurs dans la paraffine avec un microtome à 5 um et tache avec de l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine pour l&#39;analyse morphologique. </li><li> Visualisez le tissu conjonctif à l&#39;aide de colorant Trichrome de Masson. </li><li> Analyser les images sous un microscope scanner de diapositives (figures 1A, 2A, 3A, 3B et 3C) et de visualiser l&#39;ensemble du coeur en vue courte de l&#39;axe à l&#39;aide d&#39;un microscope scanner de diapositives numériques (Figures 1B et 1C). </li></ol></li><li> Après les analyses ci-dessus, Déparaffiner les tissus cardiaques dans le xylène, réhydrater en immergeant les échantillons dans la diminution des pourcentages de l&#39;éthanol (à partir de 100% d&#39;eau) et le procédé de microscopie électronique à balayage (MEB) de la manière suivante: <ol><li> Incuber blocs déparaffinées avec de l&#39;acide tannique à 1% dans 0,1 M de tampon phosphate pendant 1 h. </li><li> Déshydrater les échantillons dans des pourcentages croissants d&#39;éthanol (25-100%). </li><li> Les échantillons secs avec HMDS (hexaméthyldisilazane). </li><li> Montez les spécimens sur Stubbs avec Acheson Argent Dag et les enduire avec de l&#39;or et de palladium. </li><li> Voir les échantillons dans un microscope électronique à balayage analytique (Figure 2B). </li></ol></li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans ce manuscrit, nous avons montré comment effectuer l&#39;injection intra-myocardique de cellules dans les coeurs de souris. Comme preuve de cette méthode, nous avons utilisé des cellules HEK293. Il est important de souligner que les cellules HEK293 sont pas utilisés dans une étude de thérapie cellulaire et donc les conclusions de ce manuscrit ne sont pas appropriés pour la traduction directe d&#39;une approche thérapeutique. Cependant, le fait que les cellules HEK293 sont des cellules contractiles pas et ne ...

Divers protocoles de transport cellulaire ont été testés dans des modèles murins de rat et de maladies cardio-vasculaires, dans le but de traduire l&#39;efficacité, l&#39;efficacité et l&#39;innocuité de cette procédure expérimentale chez des patients humains. Dans les petits coeurs de rongeurs, la livraison de cellules intramyocardique est la méthode la plus réaliste de la prestation de cellule 1,2, alors que dans le antérograde de coeur de rat 3 et rétrograde injection de cellules de 4 intracoronaire peut également être utilisé. Les deux méthodes ont des limites et avantages. livraison cellulaire par voie intracoronaire présente des avantages théoriques sur l&#39;injection intramusculaire directe dans la promotion de la diffusion de la cellule mondiale 3, mais il a aussi le risque de provoquer une embolie coronarienne 3,5. Limitations de livraison intramyocardique sont associées à une lésion mécanique, une inflammation aiguë et des lésions myocardiques 6,7. Chez les humains, les cellules pour la réparation cardiaque sont administrés par injection intra-myocardique par un épicardique endocavitaire ou chirurgicalapprocher ou par intracoronaire artère 8. Injection par voie transvasculaire est adapté chez les patients présentant un infarctus aigu du myocarde et reperfusé, mais peut-être pas possible dans le cas d&#39;occlusions totales ou mauvaise circulation dans les vaisseaux du territoire effectuée 9. L&#39;injection directe dans la paroi ventriculaire par injection transendocardique ou transépicardique est techniquement réalisable en fonction de l&#39;état de santé du patient. En effet, il a été montré que cette technique est sûre 10,11, bien que pour l&#39;injection transépicardique une chirurgie à thorax ouvert est nécessaire pour transendocardique et se rapproche d&#39;une cartographie électrophysiologique pour chaque patient est nécessaire pour différencier les sites de myocarde ischémique ou portant des cicatrices viable 9. Fait important, dans les études de thérapie cellulaire du choix de la meilleure cellule pour être transplanté est encore à l&#39;étude. Analyses à court terme (4 semaines) ont montré que l&#39;injection de cellules souches cardiaques définies comme cardiospheres <sjusqu&#39;à&gt; 12 cellules ou de la population des côtés de la moelle osseuse induite par 13 la récupération fonctionnelle cardiaque chez le rat et la souris 14 15 modèles de l&#39;infarctus du myocarde en réduisant la taille de la cicatrice et la mort cellulaire. L&#39;allogreffe de cardiospheres dans un modèle de l&#39;infarctus du myocarde de rat sans immunosuppression a été trouvé pour être sûr, promu la régénération cardiaque et améliore la fonction cardiaque par stimulation des mécanismes de réparation endogènes 15. Lin-/c-kit + adultes de cellules souches dans le coeur ont été montrés pour être auto-renouvellement, clonogenic, et multipotentes in vitro et in vivo, et lorsqu&#39;il est injecté dans un coeur de rat ischémique reconstitué une grande partie de la paroi du myocarde blessé 16 et eu l&#39; capacité à former des artères coronaires 17 conductrice et de taille intermédiaire. Ces données prometteuses ont alimenté la phase I et II des essais cliniques chez l&#39;homme: l&#39;injection de cellules souches mésenchymateuses autologues et allogéniques (MSC) 18, 19 cardiospheres, ou de cellules souches cardiaques positifs c-Kit (SCC) 20 dans les cœurs ischémiques chaque montré des effets bénéfiques de la fonction cardiaque dans les études à long terme. Néanmoins, vaste à long terme de suivi et de méta-analyse rétrospective ont montré que la thérapie de cellules souches apporte un bénéfice important à certains patients, mais pas dans d&#39;autres avec une série de résultats imprévisibles 21. Il est possible que ces limitations nécessiteront la conception de protocoles spécifiques de délivrance de cellule pour chaque individu et de chaque maladie. Dans des modèles de souris et de rat, des études à long terme ont montré que l&#39;injection de cellules n&#39;a pas d&#39;améliorer encore la fonction cardiaque (12 mois). En effet, les greffes de cardiomyocytes souches embryonnaires humaines dérivées de cellules (CSEh-CM) ont été largement isolés du myocarde hôte par une couche de tissu fibreux 22,23. Des résultats similaires ont été observés après transplantation de myoblastes squelettiques intramyocardique dans le cœur de souris ayant subi un infarctus 24. Furthermore, la capacité à long terme de cellules souches mésenchymateuses allogènes pour préserver la fonction cardiaque en l&#39;infarctus a été limité par la transition d&#39;un état ​​à un immunoprivilégiés immunogène après différenciation 25. Prenant en considération les défis et les perspectives énoncées ci-dessus, nous montrons ici comment offrir cellules par injection intra-myocardique chez la souris. Nous observons que les cellules sans propriétés contractiles des cardiomyocytes ne sont pas connectés avec le myocarde hôte et forment une masse homogène avec une barrière fibreuse mince. Bien que dans certains cas, ce résultat peut être avantageux, l&#39;analyse qui suit peut être utile de comprendre comment la prise de greffe de cellules peut être modulée pour générer des structures du myocarde fonctionnellement connectés ainsi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="560">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Isolator</td>
			<td style="width:115px;">Pfi systems</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Quotation needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:115px;">Vet Tech Solutions</td>
			<td style="width:88px;">HE006</td>
			<td style="width:255px;">For small animals</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">medetomidine</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">atipamezole</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Hair removal cream</td>
			<td style="width:115px;">Commercial shops</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:115px;">NVS</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Leica MZFLIII microscope</td>
			<td style="width:115px;">Leica</td>
			<td style="width:88px;">Model S6E</td>
			<td style="width:255px;">With swing arm stand TS0</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:103px;">Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner</td>
			<td style="width:115px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:88px;">RS series</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:115px;">Jeol</td>
			<td style="width:88px;">JSM-6610</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Blunt scissors</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">14084-09</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Minivent</td>
			<td style="width:115px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:88px;">73-0043</td>
			<td style="width:255px;">Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Forceps</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">11052-10</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Retraction system</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">18200-20</td>
			<td style="width:255px;">Kit for animals up to 200grams</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">30G 12mm; &#189; inch</td>
			<td style="width:115px;">BBraun</td>
			<td style="width:88px;">A210</td>
			<td style="width:255px;">Fine yellow</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">microliter syringe</td>
			<td style="width:115px;">ESSLAB</td>
			<td style="width:88px;">81201</td>
			<td style="width:255px;">Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">6-0 silk suture</td>
			<td style="width:115px;">Ethicon</td>
			<td style="width:88px;">W1614T</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts

Des études antérieures ont montré que la capacité des cellules favorise l&#39;amélioration de la fonction cardiaque par la libération de cytokines et de facteurs qui augmentent la revascularisation du tissu cardiaque et la survie cellulaire. En outre, des observations ont révélé que les cellules souches spécifiques, tels que les cellules souches cardiaques, les cellules souches mésenchymateuses et cardiospheres ont la capacité d&#39;intégrer au sein du myocarde environnant en se différencier en cardiomyocytes, les cellules musculaires lisses et les cellules endotheliales. Ici, nous présentons les matériaux et les méthodes susceptibles de fournir de manière fiable les cellules non contractiles dans la paroi ventriculaire gauche de la souris immunodéplétion. Les étapes marquantes de cette procédure microchirurgicale impliquent l&#39;anesthésie et l&#39;injection de l&#39;analgésie, intratrachéale intubation, incision pour ouvrir le coffre et exposer le coeur et la livraison des cellules par une aiguille stérile de calibre 30 et une seringue de précision microlitre. Le traitement des tissus comprenant de coeur récolte, embedding, de sectionnement et coloration histologique a montré que l&#39;injection intra-myocardique de cellules produit une petite dommages dans la zone épicardique, ainsi que dans la paroi ventriculaire. Les cellules non contractiles ont été retenues dans la paroi du myocarde de souris immunodéprimées et sont entourés par une couche de tissu fibreux, de nature à l&#39;abri de la pression cardiaque et de la charge mécanique.

Nous avons injecté des cellules HEK293, qui sont distinguables des cellules cardiaques par leur morphologie différente (figure 1), avec une forme de pavé par rapport aux cardiomyocytes allongés (Figure 1A). Cellules HEK293 ont été plus réactif à l&#39;hématoxyline colorant (de couleur bleue) par rapport à des cardiomyocytes (de couleur rose), probablement en raison de leur contenu nucléaire augmenté (figure 1A). Pour distinguer en outre les cellules injecté...

Watch this Scientific Journal Video about Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts at JoVE.com

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Fourniture de cellules intra-myocardique dans des modèles murins de maladies cardio-vasculaires telles que l&#39;hypertension ou de l&#39;infarctus du myocarde, est largement utilisé pour évaluer le potentiel thérapeutique de différents types de cellules dans les études de régénération. Par conséquent, une description détaillée et une visualisation claire de cette intervention chirurgicale aideront à définir les limites et les avantages des analyses thérapeutiques de cellules cardiovasculaires chez les petits rongeurs.

Intramyocardique cellulaire livraison: Observations aux coeurs murins

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

intramyocardial-cell-delivery-observations-in-murine-hearts

Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K vues.  Imperial College London.  Fourniture de cellules intra-myocardique dans des modèles murins de maladies cardio-vasculaires telles que l'hypertension ou de l'infarctus du myocarde, est largement utilisé pour évaluer le potentiel thérapeutique de différents types de cellules dans les études de régénération. Par conséquent, une description détaillée et une visualisation claire de cette intervention chirurgicale aideront à définir les limites et les avantages des analyses thérap...

Vidéo: Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Ligature de l&#39;artère coronaire et injection intramyocardique dans un modèle murin d&#39;infarctus

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Recherche

Médecine

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Injection of Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently used for the first time in patients who had symptomatic heart failure. In all patients, cardiac function of the left ventricle (LV) improved significantly, as manifested by consistent reduction of the LV volume and wall stress. Here we describe this novel treatment procedure and the methods used to quantify its effects on LV wall stress and function.
Algisyl-LVR is a biopolymer gel consisting of Na+-Alginate and Ca2+-Alginate. The treatment procedure was carried out by mixing these two components and then combining them into one syringe for intramyocardial injections. This mixture was injected at 10 to 19 locations mid-way between the base and apex of the LV free wall in patients.
Magnetic resonance imaging (MRI), together with mathematical modeling, was used to quantify the effects of this treatment in patients before treatment and at various time points during recovery. The epicardial and endocardial surfaces were first digitized from the MR images to reconstruct the LV geometry at end-systole and at end-diastole. Left ventricular cavity volumes were then measured from these reconstructed surfaces.
Mathematical models of the LV were created from these MRI-reconstructed surfaces to calculate regional myofiber stress. Each LV model was constructed so that 1) it deforms according to a previously validated stress-strain relationship of the myocardium, and 2) the predicted LV cavity volume from these models matches the corresponding MRI-measured volume at end-diastole and end-systole. Diastolic filling was simulated by loading the LV endocardial surface with a prescribed end-diastolic pressure. Systolic contraction was simulated by concurrently loading the endocardial surface with a prescribed end-systolic pressure and adding active contraction in the myofiber direction. Regional myofiber stress at end-diastole and end-systole was computed from the deformed LV based on the stress-strain relationship.

This article describes procedures for implanting a novel hydrogel in failing hearts and quantifying its effect on left ventricular wall stress and function. These procedures have been successfully applied in dogs and humans.

Réduction du ventricule gauche Stress mur et amélioration de la fonction dans les coeurs défaillants utilisant Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Guidée par échographie transthoracique intramyocardique injection chez la souris

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. While these therapies lead to the rapid restoration of blood flow, these technologies remain limited by restenosis in the case of bare metal stents and angioplasty, or reduced healing and possibly enhanced risk of thrombosis in the case of drug eluting stents. A key pathophysiological mechanism in the formation of restenosis is intimal hyperplasia caused by the activation of vascular smooth muscle cells and inflammation due to arterial stretch and injury. Surgeries that induce arterial injury in genetically modified mice are useful for the mechanistic study of the vascular response to injury but are often technically challenging to perform in mouse models due to the their small size and lack of appropriate sized devices. We describe two approaches for a surgical technique that induces endothelial denudation and arterial stretch in the femoral artery of mice to produce robust neointimal hyperplasia. The first approach creates an arteriotomy in the muscular branch of the femoral artery to obtain vascular access. Following wire injury this arterial branch is ligated to close the arteriotomy. A second approach creates an arteriotomy in the main femoral artery that is later closed through localized cautery. This method allows for vascular access through a larger vessel and, consequently, provides a less technically demanding procedure that can be used in smaller mice. Following either method of arterial injury, a degradable drug delivery patch can be placed over or around the injured artery to deliver therapeutic agents.

We describe a surgical technique that produces wire injury in the femoral artery of mice to induce neointimal hyperplasia to serve as a model testing system for the perivascular delivery of therapeutic compounds for the inhibition of restenosis.

Modèle murin de l&#39;artère fémorale fil des blessures à l&#39;implantation d&#39;un périvasculaire Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Induction et de l&#39;évaluation de l&#39;ischémie-reperfusion dans coeurs de rat Langendorff perfusés

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

Injection de contraste percutanée guidée par échocardiographie intramyocardique et livraison de cellule dans un modèle préclinique grand

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Une blessure de ballon segmental contrôlé par pression d’artère de rat carotide avec l’application thérapeutique periadventitial

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly predict human cardiac liabilities, posing a multi-billion-dollar burden on the pharmaceutical industry. Hence, there is a worldwide unmet medical need for better approaches to identify drug cardiotoxicity before undertaking costly and time consuming &#39;first in man&#39; trials. Currently, only immature cardiac cells (human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes [hiPSC-CMs]) are used to test therapeutic efficiency and drug toxicity as they are the only human cardiac cells that can be cultured for prolonged periods required to test drug efficacy and toxicity. However, a single cell type cannot replicate the phenotype of the complex 3D heart tissue which is formed of multiple cell types. Importantly, the effect of drugs needs to be tested on adult cardiomyocytes, which have different characteristics and toxicity responses compared to immature hiPSC-CMs. Culturing human heart slices is a promising model of intact human myocardium. This technology provides access to a complete multicellular system that mimics the human heart tissue and reflects the physiological or pathological conditions of the human myocardium. Recently, through optimization of the culture media components and the culture conditions to include continuous electrical stimulation at 1.2 Hz and intermittent oxygenation of the culture medium, we developed a new culture system setup that preserves viability and functionality of human and pig heart slices for 6 days in culture. In the current protocol, we are detailing the method for slicing and culturing pig heart as an example. The same protocol is used to culture slices from human, dog, sheep, or cat hearts. This culture system has the potential to become a powerful predictive human in situ model for acute cardiotoxicity testing that closes the gap between preclinical and clinical testing results.

This protocol describes how to slice and culture heart tissue under physiological conditions for 6 days. This culture system could be used as a platform for testing the efficacy of novel heart failure therapeutics as well as reliable testing of acute cardiotoxicity in a 3D heart model.

Découper et cultiver des cœurs de porc dans des conditions physiologiques

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

Retard de l’accouchement intramyocardique des cellules souches après une blessure à l’Ischémie Reperfusion dans un modèle murine

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of transplanted cells within the injured myocardium, limiting their therapeutic efficacy. Recently, the use of scaffolding biomaterials has gained attention for improving and maximizing stem cell therapy. The objective of this protocol is to introduce a simple and straightforward technique to transplant bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) using injectable hydroxyphenyl propionic acid (GH) hydrogels; the hydrogels are favorable as a cell delivery platform for cardiac tissue engineering applications due to their ability to be cross-linked in situ and high biocompatibility. We present a simple method to fabricate MSC-loading GH hydrogels (MSC/hydrogels) and evaluate their survival and proliferation in three-dimensional (3D) in vitro culture. In addition, we demonstrate a technique for intramyocardial transplantation of MSC/hydrogels in mice, describing a surgical procedure to induce myocardial infarction (MI) via left anterior descending (LAD) coronary artery ligation and subsequent MSC/hydrogels transplantation.

Stem cell-based therapy has emerged as an efficient strategy to repair injured cardiac tissues after myocardial infarction. We provide an optimal in vivo application for stem cell transplantation using gelatin hydrogels that are able to be enzymatically cross-linked.

Transplantation intramyocardique d’hydrogels injectables à chargement MSC après l’infarctus du myocarde dans un modèle murin

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...