Wir danken der Magdi Yacoub Institute (MYI) zum Tragen mikroskopische Analyse und die Projekte mit Herz Reparatur, die Techniker und die Manager der unsere Tieranlage. Diese Arbeit wurde von der British Heart Foundation (BHF), Projekt PG/10/019 Zuschuss unterstützt. MPS wird von der BHF MYI und unterstützt. TP ist ein BHF-Research Excellence Fellow. NR eine NH &amp; MRC Australien Fellow.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit internationalen (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments) und nationale (UK Home Office, Act 1986) Bestimmungen durchgeführt. Die hier beschriebenen Verfahren sind Teil unseres Arbeitsplan nach britischem Lizenz Behörden und wurden nicht zum Zwecke der Aufnahme durchgeführt. 1. Herstellung von Zellen Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer bestimmten Zelllinie (Human Embryonic Kidney, HEK293-Zellen) zu Demonstrationszwecken. Zell-spezifische Protokolle müssen für wachsende und schließlich differen pluripotente oder adulte Stammzellen in spezifische Zelllinien verwendet werden. <ol><li> Wachsen Zellen in DMEM-Medium (hohe Glucose, 4,500 mg / l) mit 1% Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin, 1% Antibiotikum Pen / Strep und 10% fötalem Rinderserum (FBS). Ein 10-cm-Platte sollte in der Regel 01.03 aufgeteilt und Medien ergänzt Frisch alle zwei Tage. </li><li> Gönnen Zellen leicht mit trypsin 1x und resuspendieren in DMEM-Medium, wie in einem 1:1 beschrieben. </li><li> Zählen von Zellen in einem Hämozytometer-Kammer und sammeln 3 x 10 6 Zellen in ein separates Röhrchen. </li><li> Zentrifuge in einem Ausschwingrotor bei 100 g für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen und waschen das Zellpellet mit sterilem Phosphatpuffer 2x. </li><li> Resuspendieren in PBS 1x in einer Konzentration von 10 6/50 &amp;mgr; l zur Injektion in den linken Ventrikel des immunodepleted Mäusen. </li></ol> 2. Prächirurgische AGB <ol><li> Aufrechterhaltung immunodepleted Mäusen (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) mit sterilem Futterpellets und Wasser in einem temperaturgeregelten Isolator (22 ° C; Tabelle 1) vor jeder Operation. </li><li> Führen Chirurgie immunodepleted Mäuse unter einer Steril. Reinigen Sie die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol und Autoklavieren chirurgische Werkzeuge (Zange und Schere). </li><li> Schalten Sie Heizkissen für die Chirurgie und für die Wiederherstellung. Heizkissen sind wichtigum die Abnahme der Körpertemperatur auftreten, während und nach der Operation zu blockieren. </li><li> Einen sauberen und autoklaviertem Käfig auf die Rückgewinnung-Heizkissen. </li><li> Transportieren Sie die Mäuse in ihrem ursprünglichen Käfige aus dem Isolator zu dem Operationssaal in einen sterilen Beutel autoklaviert. </li><li> Wiegen Sie die Maus und nach dem Körpergewicht inject subkutan (sc) eine Lösung, Medetomidin und Ketamin-Hydrochlorid in 0,9% steriler Kochsalzlösung verdünnt, um die Maus zu betäuben enthält, sowie auf die Muskeln entspannen (Medetomidin 1 mg / kg Ketamin-Hydrochlorid 75 mg / kg). </li><li> Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig, wenn sie vollständig betäubt (innerhalb von 1-2 min, keine Zehen Prise Reflex nach Stimulation) </li><li> Bewerben Enthaarungscreme auf der linken Seite der Brust und den Hals-Bereich. Nach einer angemessenen Zeit (ca. 2-5 min), wischt die losen Haare mit einem mit Wasser nass Gewebe. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem OP-Panel in Rückenlage. AusSicht des Chirurgen eine vertikale Position erreicht, Schwanz-Kopf nach unten. </li><li> Spritzen Sie Analgetikum Lösung bei 0,1-0,2 g / g in steriler Kochsalzlösung (Buprenorphin) verdünnt in die hinteren Gliedmaßen subkutan und decken den rasierten Bereich mit der aseptischen Lösung Povidoniod mit einem Wattestäbchen. </li><li> Fokus des Mikroskops (2,5 fach Objektiv) auf den Hals-Bereich. </li></ol> 3. Chirurgische AGB <ol><li> Mit stumpfen Schere einen ventralen Mittellinie Hautschnitt von etwa 0,5 bis 1 cm Länge, die etwas unterhalb des Ringknorpels. Trennen Sie die Haut von Bindegewebe um die Speicheldrüsen zu visualisieren. </li><li> Teilen Sie die Speicheldrüsen auf ihren natürlichen Mittellinie Division durch gleichzeitiges Ziehen jedes Teil seitlich mit Pinzette und Magnet Brust Retraktor und setzen die Luftröhre. </li><li> Ziehen Sie die Zunge sanft zur Seite, um den Kehlkopf aus. Schieben Sie die Intubationstubus vorsichtig in die Luftröhre. Die Rohrspitze ist durch die angezeigte l sichtbararynx und Luftröhre. Wichtiger ist, wenn das Rohr in, aber nicht deutlich sichtbar ist, ist es in der Speiseröhre. Entfernen Sie es und ändern Sie die Position der Rohrspitze. </li><li> Schließen Sie den Schlauch an den Lüftungs Maschine. Stellen Sie das Schlagvolumen bei 200 ul und 150 Hub / min. Befestigen Sie die Lüftungsschlauch auf dem OP-Panel mit einer Band. </li><li> Mit stumpfen Schere und Pinzette, machen Sie eine vertikale Schwanz zum Kopf 1 - bis 1,5 cm langen Hautschnitt über der linken Thoraxbereich. </li><li> Lösen Sie die Haut vor den Bindegewebs-/ Muskelschichten und die großen und kleinen Brustmuskeln ohne Einschnitte. </li><li> Führen Thorakotomie zwischen der dritten und vierten Rippen sich wie folgt: <ol><li> Perforieren die Zwischenrippenmuskelschicht durch Kneifen und Kratzen mit kleinen, abgerundeten Pinzette. </li><li> Sobald die Zwischenrippenmuskelschicht ist perforiert, legen Sie die Brust Retraktor bis maximal öffnen Sie die Brusthöhle. Die oberen und mittleren Teile des linken Ventrikels (LV) mit darüberliegenden Vorhof (Atrium) sindjetzt sichtbar. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine Präzisionsspritze mit Zellen. Die Spritze ist in der Lage, eine Menge an Volumen von 10 ul für jede Injektion zu liefern. Werfen Sie einen 30 G Nadel an der Spitze der Spritze. </li><li> Fix mit Band eine kleine Kunststoffkanüle (von einem Introcan-W 20 G) an der Nadel, so dass nur 1 mm ausgesetzt, einschließlich der offenen Spitze der Nadel. Dadurch wird die Nadel aus Perforieren des gesamten linken ventrikulären Wand und die Injektion der Zellen in die linke Herzkammer Hohlraum zu verhindern. </li><li> Mit Hilfe eines 5X Ziel, visualisieren bei dieser Vergrößerung der linken Herzkammer und injizieren die Zellen in der linken Herzkammerwand in 5 verschiedenen Standorten (jeweils 10 ul Injektion wird für insgesamt 106 Zellen injiziert liefern). Wenn die Einspritz erfolgreich ist, wird eine weiße Fläche und die Abwesenheit von großen Rückspülung der Zellen sichtbar ist (wenn die Einspritz nicht erfolgreich war, würde das Tier von der funktionalen Analyse ausgeschlossen werden.) </li><li> Entfernen Sie den Aufroller. Schließen Sie die Brustwand by umschließt die beiden getrennten Rippen mit zwei Maschen von 6-0 Seidenfaden. </li><li> Befeuchten Sie die Brustmuskeln und die Haut mit einem Wattestäbchen in PBS 1x durchnässt und legte sanft die Muskeln wieder in die Ausgangsposition mit der Zange. </li><li> Schließen Sie die Haut mit 3-4 Stichen von 6-0 Seidenfaden. Naht der Kehle Schnitt mit 2-3 Stichen, um die Haut zu schließen. </li><li> Inject Atipamezol (1 mg / kg Endkonzentration), um die betäubende Wirkung zurück. </li><li> Sobald die Maus selbstständig zu atmen beginnt, nehmen Sie den Schlauch aus der Luftröhre und setzen Sie die Maus auf die rechte Seite. Die Maus wird erwartet, dass innerhalb von Minuten wiederherstellen. </li><li> Wenn die Maus beginnt sich zu drehen und zu Fuß, legen Sie sie in der warmen Erholungskäfig (kleine IVC-Käfig mit geschlossenen gefilterte oben) für eine Stunde. </li><li> Lassen Sie die Tiere über Nacht in einem geregelten beheizten Feld (37 ° C). </li><li> Füllen Sie eine Schüssel mit Wasser und Pellet Essen zur Erholung während der ersten 2 Tage nach der Operation zu unterstützen. </li></ol> Zehn Herzen mit Zellen und 10 Kontroll nicht gespritzt Herzen injiziert werden histologisch wie folgt analysiert: <ol><li> Führen Analyse der transplantierten Zellen von 1 Woche nach Injektion (Fig. 1 und 3). <ol><li> Nach Euthanasie durch Überdosierung von Isofluran, durchströmen die Herzen mit 20 ml 4% Paraformaldehyd (PFA), um das Gewebe zu beheben. Entwässern der festen Gewebe in steigenden Prozentsätzen von Ethanol (70-100%) und in Paraffinblöcke einbinden. </li><li> § die Herzen in Paraffin mit einem Mikrotom in 5 um und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin für die morphologische Analyse. </li><li> Visualisieren Bindegewebe durch die Verwendung Masson Trichrome Fleck. </li><li> Analysieren Sie die Bilder unter einem Dia-Scanner-Mikroskop (1A, 2A, 3A, 3B und 3C) und zu visualisieren, das gesamte Herz in kurzen Achse mit einem digitalen Mikroskop-Dia-Scanner (Figures 1B und 1C). </li></ol></li><li> Nachdem die obigen Analysen entparaffinieren Herzgewebe in Xylol rehydrieren Proben durch Eintauchen in abnehmProzente Ethanol (100% Wasser) und Verfahren für die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wie folgt: <ol><li> Inkubieren entparaffinierten Blöcke mit 1% Gerbsäure in 0,1 M Phosphatpuffer für 1 Stunde. </li><li> Entwässern Proben bei der Erhöhung der Prozentsätze Ethanol (25-100%). </li><li> Trockenproben mit HMDS (Hexamethyldisilazan). </li><li> Montieren Sie die Proben auf Stubbs mit Acheson Silber Dag und überziehen sie mit Gold-Palladium. </li><li> Anwendungsbeispiel in einem analytischen Rasterelektronenmikroskops (Fig. 2B). </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In diesem Manuskript haben wir gezeigt, wie man intramyokardialen Injektion von Zellen in murinen Herzen durchzuführen. Als Beweis dieser Methodik haben wir HEK293-Zellen verwendet. Es ist wichtig zu betonen, dass HEK293-Zellen sind nicht in einer Zelltherapie Studie verwendet und damit die Ergebnisse des Manuskripts für die direkte Übersetzung zu einem therapeutischen Ansatz nicht geeignet sind. Die Tatsache, dass HEK293-Zellen nicht kontraktilen Zellen und nicht in anderen Zelltypen zu trans Aufmerksamkeit konzentr...

Verschiedene Zellabgabe-Protokolle in murinen und Rattenmodellen von kardiovaskulären Erkrankungen, die mit dem Ziel der Umsetzung der Effizienz, Wirksamkeit und Sicherheit dieser experimentellen Verfahren in menschlichen Patienten getestet. In kleinen Nager Herzen, ist intramyokardialen Zellabgabe die praktikabelste Methode der Zellabgabe 1,2, während in der Rattenherzantegrade und retrograde 3 4 intrakoronare Infusion Zelle kann ebenfalls verwendet werden. Beide Methoden haben Grenzen und Vorteile. Zell Lieferung über die intrakoronare Route hat theoretischen Vorteile gegenüber der direkten intramuskuläre Injektion in die Förderung der weltweiten Verbreitung Zelle 3, aber es hat auch die Gefahr, dass Herzkranzembolie 3,5. Einschränkungen bei der Lieferung intramyokardialen sind mit mechanischen Verletzungen, akute Entzündungen und Herzmuskelschäden 6,7 verbunden. Beim Menschen werden die Zellen für die Reparatur von Herz intramyokardiale Injektion durch eine endokardiale oder epikardiale chirurgischen zugenähern oder durch intrakoronare arteriellen Linie 8. Injection von transvaskuläre Routen ist bei Patienten mit akutem Infarkt und Herzmuskel reperfundierten geeignet, kann aber nicht möglich sein, im Falle von Totalverschlüssen oder schlechte Fluss innerhalb der Gefäße des Gebietes erfolgen 9. Direkte Injektion in die Herzkammerwand durch transendokardialen oder transepikardialen Injektion technisch möglich je nach Patient Gesundheitszustand. Tatsächlich hat es sich gezeigt, dass diese Technik sicher 10,11, obwohl für transepikardialen Injektion eine offene Brustchirurgie notwendig ist und für ein elektro transendokardialen nähert Zuordnung für jeden Patienten erforderlich ist, um lebensfähige Stellen von ischämischen oder vernarbten Herzmuskel 9 unterscheiden. Wichtig ist, dass in der Zelltherapie-Studien die Auswahl der besten Zelle zu trans wird noch untersucht. Kurzzeitanalysen (4 Wochen) zeigten, dass die Injektion von Herzstammzellen definiert als cardiospheres <sbis&gt; 12 oder Side Population Zellen aus Knochenmark 13 induziert Herz funktionelle Erholung in Maus und Ratte 14 15 Modelle von Myokardinfarkt durch eine Verringerung der Narbengröße und Zelltod. Die allogene Transplantation von cardiospheres in einem Rattenmodell Myokardinfarkt ohne Immunsuppression wurde festgestellt, um sicher zu sein, förderte Herzregeneration und verbessert die Herzfunktion durch Stimulation der körpereigenen Reparaturmechanismen 15. Lin-/c-kit + adulte Progenitorzellen im Herzen wurde gezeigt, dass selbst erneuernde, klonogenen und multi in vitro und in vivo, und wenn in einem ischämischen Rattenherzen injiziert rekonstituiert große Teile des verletzten Myokard-Wand 16 und hatte die Fähigkeit, leitende und mittelgroße Koronararterien 17 zu bilden. Diese viel versprechenden Daten angeheizt Phase I und II der klinischen Studien am Menschen: Injektion von autologen und allogenen mesenchymalen Stammzellen (MSC) 18, 19 cardiospheresOder c-Kit positive Herzstammzellen (CSC) 20 in ischämischen Herzen der Menschen zeigten jeweils positiven Auswirkungen auf die Herzfunktion in Langzeitstudien. Dennoch umfangreiche Langzeit-Follow-up-und retrospektive Meta-Analyse zeigte, dass die Stammzelltherapie einen wesentlichen Nutzen für einige Patienten, in anderen aber nicht mit einer Reichweite von 21 unvorhersehbare Ergebnisse. Es ist möglich, dass diese Einschränkungen wird das Design von spezifischen Protokollen der Zellabgabe für jeden einzelnen und jede Erkrankung erfordern. In Maus-und Rattenmodellen zeigten Langzeitstudien, dass Zellinjektion nicht weiter Herzfunktion (12 Monate) zu verbessern. Tatsächlich Transplantate von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten (hES-CM) wurden weitgehend von der Host-Myokard durch eine Schicht von fibrotischen Gewebes 22,23 isoliert. Ähnliche Ergebnisse wurden nach der Transplantation von intramyokardialen Skelettmyoblasten in das Herz des infarzierten Mäusen 24 beobachtet. Furthermore, die langfristige Möglichkeit der allogenen MSCs Funktion in der Infarkt Herzen bewahren durch Übergang von einer immun eine immunogene Zustand nach Differenzierung 25 begrenzt. Unter Berücksichtigung der Herausforderungen und Perspektiven oben dargelegt, zeigen wir hier, wie man Zellen durch intramyokardialen Injektion in Mäusen zu liefern. Wir beobachten, dass Zellen ohne Herzmuskelkontraktionseigenschaften nicht mit dem Host-Myokard verbunden und bilden eine zusammenhängende Masse mit einer dünnen fibrotischen Barriere. Obwohl in einigen Fällen dieses Ergebnis kann vorteilhaft sein, kann die folgende Analyse nützlich sein, um zu verstehen, wie Zelltransplantations kann moduliert werden, um funktionsfähig verbunden myokardialen Strukturen sowie zu erzeugen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="560">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Isolator</td>
			<td style="width:115px;">Pfi systems</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Quotation needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:115px;">Vet Tech Solutions</td>
			<td style="width:88px;">HE006</td>
			<td style="width:255px;">For small animals</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">medetomidine</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">atipamezole</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Hair removal cream</td>
			<td style="width:115px;">Commercial shops</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:115px;">NVS</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Leica MZFLIII microscope</td>
			<td style="width:115px;">Leica</td>
			<td style="width:88px;">Model S6E</td>
			<td style="width:255px;">With swing arm stand TS0</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:103px;">Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner</td>
			<td style="width:115px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:88px;">RS series</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:115px;">Jeol</td>
			<td style="width:88px;">JSM-6610</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Blunt scissors</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">14084-09</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Minivent</td>
			<td style="width:115px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:88px;">73-0043</td>
			<td style="width:255px;">Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Forceps</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">11052-10</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Retraction system</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">18200-20</td>
			<td style="width:255px;">Kit for animals up to 200grams</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">30G 12mm; &#189; inch</td>
			<td style="width:115px;">BBraun</td>
			<td style="width:88px;">A210</td>
			<td style="width:255px;">Fine yellow</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">microliter syringe</td>
			<td style="width:115px;">ESSLAB</td>
			<td style="width:88px;">81201</td>
			<td style="width:255px;">Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">6-0 silk suture</td>
			<td style="width:115px;">Ethicon</td>
			<td style="width:88px;">W1614T</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts

Frühere Studien haben gezeigt, dass Zellabgabe fördert Verbesserung der Herzfunktion durch Freisetzung von Zytokinen und Faktoren, die Herzgewebe Revaskularisation und das Überleben der Zelle zu erhöhen. Darüber hinaus sind weitere Beobachtungen zeigten, dass bestimmte Stammzellen, wie Herzstammzellen, mesenchymale Stammzellen und cardiospheres haben die Fähigkeit, innerhalb der umgebenden Myokard durch Differenzierung in Kardiomyozyten, glatte Muskelzellen und Endothelzellen zu integrieren. Hier präsentieren wir die Materialien und Methoden, um zuverlässig zu liefern noncontractile Zellen in der linken Herzkammerwand der immunodepleted Mäusen. Die wesentlichen Schritte dieser mikrochirurgischen Verfahren beinhalten Anästhesie und Analgesie Injektion, intratracheale Intubation, Schnitt, um die Truhe zu öffnen und setzen das Herz und die Lieferung von Zellen durch eine sterile 30-Gauge-Nadel und einer Präzisionsmikroliter-Spritze. Gewebeverarbeitung, bestehend aus Herz Ernte, embedding, Schneiden und histologische Färbung zeigte, dass intramyokardialer Zellinjektion erzeugt eine kleine Beschädigung in der epikardialen Fläche, als auch in der Herzkammerwand. Noncontractile Zellen in die Wand des Myokards immunsupprimierten Mäusen erhalten und wurden durch eine Schicht aus faserigem Gewebe, wahrscheinlich von Herz Druck und mechanischer Belastung zu schützen, umgeben ist.

Wir injizierten HEK293-Zellen, die unterscheidbar von der Herzzellen durch ihre unterschiedliche Morphologie (Fig. 1) sind, mit einer Kopfsteinform im Vergleich zu den länglichen Kardiomyozyten (Fig. 1A). HEK293-Zellen waren zu Hämatoxylin Farbstoff (blaue Farbe) reaktiven Vergleich zu Kardiomyozyten (rosa Farbe), wahrscheinlich wegen ihrer erhöhten Kerngehalt (Abbildung 1A). Zur weiteren Unterscheidung der injizierten Zellen aus dem Wirtsgewebe wurden HEK293-Zellen ...

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Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Intramyokardialer Zellabgabe in murinen Modellen von kardiovaskulären Erkrankungen, wie Hypertonie oder Myokardinfarkt, wird häufig verwendet, um das therapeutische Potential von verschiedenen Zelltypen in der Regenerationsstudien getestet. Daher wird eine ausführliche Beschreibung und eine klare Visualisierung dieses chirurgische Verfahren helfen, die Grenzen und Vorteile der Herz-Kreislauf-Zelle therapeutische Analysen in kleinen Nagern zu definieren.

Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

intramyocardial-cell-delivery-observations-in-murine-hearts

Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K Aufrufe.  Imperial College London.  Intramyokardialer Zellabgabe in murinen Modellen von kardiovaskulären Erkrankungen, wie Hypertonie oder Myokardinfarkt, wird häufig verwendet, um das therapeutische Potential von verschiedenen Zelltypen in der Regenerationsstudien getestet. Daher wird eine ausführliche Beschreibung und eine klare Visualisierung dieses chirurgische Verfahren helfen, die Grenzen und Vorteile der Herz-Kreislauf-Zelle therapeutische Analysen in kleinen Nagern zu definieren. 

Serie: Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Forschung

Medizin

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Injection of Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently used for the first time in patients who had symptomatic heart failure. In all patients, cardiac function of the left ventricle (LV) improved significantly, as manifested by consistent reduction of the LV volume and wall stress. Here we describe this novel treatment procedure and the methods used to quantify its effects on LV wall stress and function.
Algisyl-LVR is a biopolymer gel consisting of Na+-Alginate and Ca2+-Alginate. The treatment procedure was carried out by mixing these two components and then combining them into one syringe for intramyocardial injections. This mixture was injected at 10 to 19 locations mid-way between the base and apex of the LV free wall in patients.
Magnetic resonance imaging (MRI), together with mathematical modeling, was used to quantify the effects of this treatment in patients before treatment and at various time points during recovery. The epicardial and endocardial surfaces were first digitized from the MR images to reconstruct the LV geometry at end-systole and at end-diastole. Left ventricular cavity volumes were then measured from these reconstructed surfaces.
Mathematical models of the LV were created from these MRI-reconstructed surfaces to calculate regional myofiber stress. Each LV model was constructed so that 1) it deforms according to a previously validated stress-strain relationship of the myocardium, and 2) the predicted LV cavity volume from these models matches the corresponding MRI-measured volume at end-diastole and end-systole. Diastolic filling was simulated by loading the LV endocardial surface with a prescribed end-diastolic pressure. Systolic contraction was simulated by concurrently loading the endocardial surface with a prescribed end-systolic pressure and adding active contraction in the myofiber direction. Regional myofiber stress at end-diastole and end-systole was computed from the deformed LV based on the stress-strain relationship.

This article describes procedures for implanting a novel hydrogel in failing hearts and quantifying its effect on left ventricular wall stress and function. These procedures have been successfully applied in dogs and humans.

Reduktion der linksventrikulären Wandspannung und Verbesserung der Funktion in Failing Herzen mit Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Ultraschall-geführte Transthorakale intramyokardiale Injection in Mäuse

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. While these therapies lead to the rapid restoration of blood flow, these technologies remain limited by restenosis in the case of bare metal stents and angioplasty, or reduced healing and possibly enhanced risk of thrombosis in the case of drug eluting stents. A key pathophysiological mechanism in the formation of restenosis is intimal hyperplasia caused by the activation of vascular smooth muscle cells and inflammation due to arterial stretch and injury. Surgeries that induce arterial injury in genetically modified mice are useful for the mechanistic study of the vascular response to injury but are often technically challenging to perform in mouse models due to the their small size and lack of appropriate sized devices. We describe two approaches for a surgical technique that induces endothelial denudation and arterial stretch in the femoral artery of mice to produce robust neointimal hyperplasia. The first approach creates an arteriotomy in the muscular branch of the femoral artery to obtain vascular access. Following wire injury this arterial branch is ligated to close the arteriotomy. A second approach creates an arteriotomy in the main femoral artery that is later closed through localized cautery. This method allows for vascular access through a larger vessel and, consequently, provides a less technically demanding procedure that can be used in smaller mice. Following either method of arterial injury, a degradable drug delivery patch can be placed over or around the injured artery to deliver therapeutic agents.

We describe a surgical technique that produces wire injury in the femoral artery of mice to induce neointimal hyperplasia to serve as a model testing system for the perivascular delivery of therapeutic compounds for the inhibition of restenosis.

Mausmodell der Femoralarterie Draht Verletzung mit Implantation einer Perivaskuläre Drug Delivery-Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Induktion und Beurteilung der Ischämie-Reperfusion Injury in Langendorff-perfundierten Rattenherzen

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

Perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektion und Zelle-Lieferung in einem großen präklinischen Modell

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Eine Ratte Carotis Arterie Druck-kontrollierte segmentale Ballonverletzung mit periadventitialen therapeutischen Anwendung

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly predict human cardiac liabilities, posing a multi-billion-dollar burden on the pharmaceutical industry. Hence, there is a worldwide unmet medical need for better approaches to identify drug cardiotoxicity before undertaking costly and time consuming &#39;first in man&#39; trials. Currently, only immature cardiac cells (human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes [hiPSC-CMs]) are used to test therapeutic efficiency and drug toxicity as they are the only human cardiac cells that can be cultured for prolonged periods required to test drug efficacy and toxicity. However, a single cell type cannot replicate the phenotype of the complex 3D heart tissue which is formed of multiple cell types. Importantly, the effect of drugs needs to be tested on adult cardiomyocytes, which have different characteristics and toxicity responses compared to immature hiPSC-CMs. Culturing human heart slices is a promising model of intact human myocardium. This technology provides access to a complete multicellular system that mimics the human heart tissue and reflects the physiological or pathological conditions of the human myocardium. Recently, through optimization of the culture media components and the culture conditions to include continuous electrical stimulation at 1.2 Hz and intermittent oxygenation of the culture medium, we developed a new culture system setup that preserves viability and functionality of human and pig heart slices for 6 days in culture. In the current protocol, we are detailing the method for slicing and culturing pig heart as an example. The same protocol is used to culture slices from human, dog, sheep, or cat hearts. This culture system has the potential to become a powerful predictive human in situ model for acute cardiotoxicity testing that closes the gap between preclinical and clinical testing results.

This protocol describes how to slice and culture heart tissue under physiological conditions for 6 days. This culture system could be used as a platform for testing the efficacy of novel heart failure therapeutics as well as reliable testing of acute cardiotoxicity in a 3D heart model.

Schneiden und Culieren von Schweineherzen unter physiologischen Bedingungen

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

Verzögerte intramyokardiale Lieferung von Stammzellen nach Ischämie-Reperfusionsverletzung in einem Murine-Modell

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of transplanted cells within the injured myocardium, limiting their therapeutic efficacy. Recently, the use of scaffolding biomaterials has gained attention for improving and maximizing stem cell therapy. The objective of this protocol is to introduce a simple and straightforward technique to transplant bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) using injectable hydroxyphenyl propionic acid (GH) hydrogels; the hydrogels are favorable as a cell delivery platform for cardiac tissue engineering applications due to their ability to be cross-linked in situ and high biocompatibility. We present a simple method to fabricate MSC-loading GH hydrogels (MSC/hydrogels) and evaluate their survival and proliferation in three-dimensional (3D) in vitro culture. In addition, we demonstrate a technique for intramyocardial transplantation of MSC/hydrogels in mice, describing a surgical procedure to induce myocardial infarction (MI) via left anterior descending (LAD) coronary artery ligation and subsequent MSC/hydrogels transplantation.

Stem cell-based therapy has emerged as an efficient strategy to repair injured cardiac tissues after myocardial infarction. We provide an optimal in vivo application for stem cell transplantation using gelatin hydrogels that are able to be enzymatically cross-linked.

Intramyokardiale Transplantation von MSC-Loading injizierbaren Hydrogelen nach Myokardinfarkt in einem Murine-Modell

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...