Wir danken der Magdi Yacoub Institute (MYI) zum Tragen mikroskopische Analyse und die Projekte mit Herz Reparatur, die Techniker und die Manager der unsere Tieranlage. Diese Arbeit wurde von der British Heart Foundation (BHF), Projekt PG/10/019 Zuschuss unterstützt. MPS wird von der BHF MYI und unterstützt. TP ist ein BHF-Research Excellence Fellow. NR eine NH &amp; MRC Australien Fellow.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit internationalen (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments) und nationale (UK Home Office, Act 1986) Bestimmungen durchgeführt. Die hier beschriebenen Verfahren sind Teil unseres Arbeitsplan nach britischem Lizenz Behörden und wurden nicht zum Zwecke der Aufnahme durchgeführt. 1. Herstellung von Zellen Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer bestimmten Zelllinie (Human Embryonic Kidney, HEK293-Zellen) zu Demonstrationszwecken. Zell-spezifische Protokolle müssen für wachsende und schließlich differen pluripotente oder adulte Stammzellen in spezifische Zelllinien verwendet werden. <ol><li> Wachsen Zellen in DMEM-Medium (hohe Glucose, 4,500 mg / l) mit 1% Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin, 1% Antibiotikum Pen / Strep und 10% fötalem Rinderserum (FBS). Ein 10-cm-Platte sollte in der Regel 01.03 aufgeteilt und Medien ergänzt Frisch alle zwei Tage. </li><li> Gönnen Zellen leicht mit trypsin 1x und resuspendieren in DMEM-Medium, wie in einem 1:1 beschrieben. </li><li> Zählen von Zellen in einem Hämozytometer-Kammer und sammeln 3 x 10 6 Zellen in ein separates Röhrchen. </li><li> Zentrifuge in einem Ausschwingrotor bei 100 g für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen und waschen das Zellpellet mit sterilem Phosphatpuffer 2x. </li><li> Resuspendieren in PBS 1x in einer Konzentration von 10 6/50 &amp;mgr; l zur Injektion in den linken Ventrikel des immunodepleted Mäusen. </li></ol> 2. Prächirurgische AGB <ol><li> Aufrechterhaltung immunodepleted Mäusen (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) mit sterilem Futterpellets und Wasser in einem temperaturgeregelten Isolator (22 ° C; Tabelle 1) vor jeder Operation. </li><li> Führen Chirurgie immunodepleted Mäuse unter einer Steril. Reinigen Sie die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol und Autoklavieren chirurgische Werkzeuge (Zange und Schere). </li><li> Schalten Sie Heizkissen für die Chirurgie und für die Wiederherstellung. Heizkissen sind wichtigum die Abnahme der Körpertemperatur auftreten, während und nach der Operation zu blockieren. </li><li> Einen sauberen und autoklaviertem Käfig auf die Rückgewinnung-Heizkissen. </li><li> Transportieren Sie die Mäuse in ihrem ursprünglichen Käfige aus dem Isolator zu dem Operationssaal in einen sterilen Beutel autoklaviert. </li><li> Wiegen Sie die Maus und nach dem Körpergewicht inject subkutan (sc) eine Lösung, Medetomidin und Ketamin-Hydrochlorid in 0,9% steriler Kochsalzlösung verdünnt, um die Maus zu betäuben enthält, sowie auf die Muskeln entspannen (Medetomidin 1 mg / kg Ketamin-Hydrochlorid 75 mg / kg). </li><li> Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig, wenn sie vollständig betäubt (innerhalb von 1-2 min, keine Zehen Prise Reflex nach Stimulation) </li><li> Bewerben Enthaarungscreme auf der linken Seite der Brust und den Hals-Bereich. Nach einer angemessenen Zeit (ca. 2-5 min), wischt die losen Haare mit einem mit Wasser nass Gewebe. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem OP-Panel in Rückenlage. AusSicht des Chirurgen eine vertikale Position erreicht, Schwanz-Kopf nach unten. </li><li> Spritzen Sie Analgetikum Lösung bei 0,1-0,2 g / g in steriler Kochsalzlösung (Buprenorphin) verdünnt in die hinteren Gliedmaßen subkutan und decken den rasierten Bereich mit der aseptischen Lösung Povidoniod mit einem Wattestäbchen. </li><li> Fokus des Mikroskops (2,5 fach Objektiv) auf den Hals-Bereich. </li></ol> 3. Chirurgische AGB <ol><li> Mit stumpfen Schere einen ventralen Mittellinie Hautschnitt von etwa 0,5 bis 1 cm Länge, die etwas unterhalb des Ringknorpels. Trennen Sie die Haut von Bindegewebe um die Speicheldrüsen zu visualisieren. </li><li> Teilen Sie die Speicheldrüsen auf ihren natürlichen Mittellinie Division durch gleichzeitiges Ziehen jedes Teil seitlich mit Pinzette und Magnet Brust Retraktor und setzen die Luftröhre. </li><li> Ziehen Sie die Zunge sanft zur Seite, um den Kehlkopf aus. Schieben Sie die Intubationstubus vorsichtig in die Luftröhre. Die Rohrspitze ist durch die angezeigte l sichtbararynx und Luftröhre. Wichtiger ist, wenn das Rohr in, aber nicht deutlich sichtbar ist, ist es in der Speiseröhre. Entfernen Sie es und ändern Sie die Position der Rohrspitze. </li><li> Schließen Sie den Schlauch an den Lüftungs Maschine. Stellen Sie das Schlagvolumen bei 200 ul und 150 Hub / min. Befestigen Sie die Lüftungsschlauch auf dem OP-Panel mit einer Band. </li><li> Mit stumpfen Schere und Pinzette, machen Sie eine vertikale Schwanz zum Kopf 1 - bis 1,5 cm langen Hautschnitt über der linken Thoraxbereich. </li><li> Lösen Sie die Haut vor den Bindegewebs-/ Muskelschichten und die großen und kleinen Brustmuskeln ohne Einschnitte. </li><li> Führen Thorakotomie zwischen der dritten und vierten Rippen sich wie folgt: <ol><li> Perforieren die Zwischenrippenmuskelschicht durch Kneifen und Kratzen mit kleinen, abgerundeten Pinzette. </li><li> Sobald die Zwischenrippenmuskelschicht ist perforiert, legen Sie die Brust Retraktor bis maximal öffnen Sie die Brusthöhle. Die oberen und mittleren Teile des linken Ventrikels (LV) mit darüberliegenden Vorhof (Atrium) sindjetzt sichtbar. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine Präzisionsspritze mit Zellen. Die Spritze ist in der Lage, eine Menge an Volumen von 10 ul für jede Injektion zu liefern. Werfen Sie einen 30 G Nadel an der Spitze der Spritze. </li><li> Fix mit Band eine kleine Kunststoffkanüle (von einem Introcan-W 20 G) an der Nadel, so dass nur 1 mm ausgesetzt, einschließlich der offenen Spitze der Nadel. Dadurch wird die Nadel aus Perforieren des gesamten linken ventrikulären Wand und die Injektion der Zellen in die linke Herzkammer Hohlraum zu verhindern. </li><li> Mit Hilfe eines 5X Ziel, visualisieren bei dieser Vergrößerung der linken Herzkammer und injizieren die Zellen in der linken Herzkammerwand in 5 verschiedenen Standorten (jeweils 10 ul Injektion wird für insgesamt 106 Zellen injiziert liefern). Wenn die Einspritz erfolgreich ist, wird eine weiße Fläche und die Abwesenheit von großen Rückspülung der Zellen sichtbar ist (wenn die Einspritz nicht erfolgreich war, würde das Tier von der funktionalen Analyse ausgeschlossen werden.) </li><li> Entfernen Sie den Aufroller. Schließen Sie die Brustwand by umschließt die beiden getrennten Rippen mit zwei Maschen von 6-0 Seidenfaden. </li><li> Befeuchten Sie die Brustmuskeln und die Haut mit einem Wattestäbchen in PBS 1x durchnässt und legte sanft die Muskeln wieder in die Ausgangsposition mit der Zange. </li><li> Schließen Sie die Haut mit 3-4 Stichen von 6-0 Seidenfaden. Naht der Kehle Schnitt mit 2-3 Stichen, um die Haut zu schließen. </li><li> Inject Atipamezol (1 mg / kg Endkonzentration), um die betäubende Wirkung zurück. </li><li> Sobald die Maus selbstständig zu atmen beginnt, nehmen Sie den Schlauch aus der Luftröhre und setzen Sie die Maus auf die rechte Seite. Die Maus wird erwartet, dass innerhalb von Minuten wiederherstellen. </li><li> Wenn die Maus beginnt sich zu drehen und zu Fuß, legen Sie sie in der warmen Erholungskäfig (kleine IVC-Käfig mit geschlossenen gefilterte oben) für eine Stunde. </li><li> Lassen Sie die Tiere über Nacht in einem geregelten beheizten Feld (37 ° C). </li><li> Füllen Sie eine Schüssel mit Wasser und Pellet Essen zur Erholung während der ersten 2 Tage nach der Operation zu unterstützen. </li></ol> Zehn Herzen mit Zellen und 10 Kontroll nicht gespritzt Herzen injiziert werden histologisch wie folgt analysiert: <ol><li> Führen Analyse der transplantierten Zellen von 1 Woche nach Injektion (Fig. 1 und 3). <ol><li> Nach Euthanasie durch Überdosierung von Isofluran, durchströmen die Herzen mit 20 ml 4% Paraformaldehyd (PFA), um das Gewebe zu beheben. Entwässern der festen Gewebe in steigenden Prozentsätzen von Ethanol (70-100%) und in Paraffinblöcke einbinden. </li><li> § die Herzen in Paraffin mit einem Mikrotom in 5 um und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin für die morphologische Analyse. </li><li> Visualisieren Bindegewebe durch die Verwendung Masson Trichrome Fleck. </li><li> Analysieren Sie die Bilder unter einem Dia-Scanner-Mikroskop (1A, 2A, 3A, 3B und 3C) und zu visualisieren, das gesamte Herz in kurzen Achse mit einem digitalen Mikroskop-Dia-Scanner (Figures 1B und 1C). </li></ol></li><li> Nachdem die obigen Analysen entparaffinieren Herzgewebe in Xylol rehydrieren Proben durch Eintauchen in abnehmProzente Ethanol (100% Wasser) und Verfahren für die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wie folgt: <ol><li> Inkubieren entparaffinierten Blöcke mit 1% Gerbsäure in 0,1 M Phosphatpuffer für 1 Stunde. </li><li> Entwässern Proben bei der Erhöhung der Prozentsätze Ethanol (25-100%). </li><li> Trockenproben mit HMDS (Hexamethyldisilazan). </li><li> Montieren Sie die Proben auf Stubbs mit Acheson Silber Dag und überziehen sie mit Gold-Palladium. </li><li> Anwendungsbeispiel in einem analytischen Rasterelektronenmikroskops (Fig. 2B). </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In diesem Manuskript haben wir gezeigt, wie man intramyokardialen Injektion von Zellen in murinen Herzen durchzuführen. Als Beweis dieser Methodik haben wir HEK293-Zellen verwendet. Es ist wichtig zu betonen, dass HEK293-Zellen sind nicht in einer Zelltherapie Studie verwendet und damit die Ergebnisse des Manuskripts für die direkte Übersetzung zu einem therapeutischen Ansatz nicht geeignet sind. Die Tatsache, dass HEK293-Zellen nicht kontraktilen Zellen und nicht in anderen Zelltypen zu trans Aufmerksamkeit konzentriert sich jedoch auf technische Aspekte, wie den Eigenschaften der Zellen geliefert werden und der Verabreichungsweg. Es wurde berichtet, dass eine Route intramyokardialer neigt Zellcluster im Herzgewebe eingebettet 24,26 bewirken, während die intrakoronare Route konnte homogenere Verteilung an der Stelle der Verletzung bereitzustellen. Für Kardiomyozyten Ersatz, sollte die ideale Spenderzelle die elektrophysiologischen, strukturellen und kontraktilen Properti ausstellenn von Herzmuskelzellen und sollte in der Lage, die strukturell und funktionell in das Wirtsgewebe integriert werden, was die Notwendigkeit für eine Zelldifferenzierungsprogramms vor der Transplantation verwendet werden können. Die Eckpunkte für eine erfolgreiche Operation kann wie folgt zusammengefasst werden: <ol><li> Anesthetize Mäuse mit injizierbaren Verbindungen Verlangsamung der Herzfrequenz und erleichtern die Zellinjektion </li><li> Führen intratracheale Kanülierung Mäuse Lungen Funktionalität begünstigen. </li><li> Führen Thorakotomie vermieden Muskel Inzision Brustmuskel Funktionalität für eine richtige Atmung aufrecht zu erhalten. </li><li> Nach Darstellung des Herzens, beobachten die linke Herzkammer unter dem Mikroskop sichtbar zu machen, ob Injektion aufgetreten ist (als eine blasse Farbe sichtbar). </li><li> Verwenden eine dünne Nadel und eine Präzisionsspritze umfangreiche Perforation des Herzgewebes zu verhindern und um die gewünschte Menge an Material bzw. einzuspritzen. </li><li> Steckt die Nadel mit einer Kunststoffrohrsystem auszusetzen our den Spitzenteil. Dies würde die Einführung der Nadel zu einer bestimmten Tiefe in den linken Ventrikel (0,5 mm) zu ermöglichen, die Vermeidung Injektion in die Herzkammer. </li><li> Schließen der Brust und den Raum zwischen den Rippen sorgfältig Exposition der Lunge auf externen Druck zu vermeiden. </li></ol> Diese Technik hat ein hohes Maß an Erfolg, wenn postoperative gesundheitlichen Bedingungen priorisiert werden. Die Tiere müssen intensiv überwacht werden jeden Tag bis zu einer Woche auf Anzeichen von Leiden und Schmerzen. Die Injektion von schmerzlindernden Verbindungen, um Schmerzen zu kontrollieren, müssen nach Bedarf postoperativ verabreicht werden. Die topische Anwendung von Schmerzlinderung, wie Lidocain, können ebenfalls verwendet werden. Die Blutung sollte durch sorgfältige chirurgische Techniken verhindert werden. Wenn jedoch vorkommen, kann durch Pressen oder Ligation von Gefäßen angehalten werden. Wir haben festgestellt, dass die Tiere erholen besser und schneller, wenn in einem Heizkasten gelassen bei 37 ° C für 12-20 Stunden nach der Operation. Diese Behandlung wird eine schnelle Abnahme der Körpertemperatur zu blockieren, nochnormalerweise nach dem chirurgischen Eingriff und Verwaltung der Narkose auftreten. Postoperative Infektionen auftreten, sollte aber weniger als 1% betragen. Aseptische Verfahren müssen strikt eingehalten werden, um eine Infektion zu verhindern. Lokale Infektion kann unter Anwendung von Antibiotika behandelt werden. Wichtig ist, dass Dehydratisierung durch subkutane Injektion von Kochsalzlösung gesteuert werden. Es ist bevorzugt, injizierbare über inhalierten Narkose verabreichen, wie Isofluran. Tatsächlich beobachteten wir, dass Injektionsanästhesie verringerte Herzschlag, was eine leichtere und weniger Blutungen Injektion ohne Tier Beschwerden. Obwohl invasive, ist die Injektion kleiner Mengen von Zellen (25-50 &amp;mgr; l) in Mäusen und sicher durchführbar. Wir hatten weniger als 1% Mortalität durch Injektion von 50 ul 5 HEK293-Zellen in unterschiedlichen Bereichen des linken Herzkammerwand (10 &amp;mgr; l / Injektion). Diese Methode gewährleistet die Anwesenheit der Zellen in mehreren Bereichen des Herzwand, die wichtig ist,Stammzelltherapie, wenn ausgedehnte Bereiche von ischämischem Schaden müssen von den Zellen abgegeben werden, erreicht. Weniger invasive Operation durchzuführen, wurden verschiedene Protokolle wurden kürzlich veröffentlicht, obwohl ihre Reproduzierbarkeit in verschiedenen Labors hat noch nicht verifiziert werden. So kann beispielsweise Zellinjektion durch enge Brust-Technik mit hochauflösenden 27-Echokardiographie durchgeführt werden. Die Verwendung dieses Systems erfordert eine hohe Bedienerfähigkeiten deutlich in einem zweidimensionalen Bild sichtbar mit der Wand des linken Ventrikels und die Nadel in einer bestimmten Position während des normalen systolischen / diastolischen Zyklen aufrechtzuerhalten. Der Vorteil dieser Methode ist die Implantation der Zellen in die Maus Myokard zu gewünschten Positionen in einer klinisch relevanten Zeitrahmen nach Myokardinfarkt Induktion. Allerdings ist diese Vorgehensweise nicht möglich, mit Chirurgie wie Myokardinfarkt Induktion oder transaortale Streifenbildung aufgrund der erhöhten Sterblichkeit der Tiere, sich in einer zweiten Operation 27. Interessant ist, Hamdi und Kollegen verglichen Direkt intramyokardialen Injektion gegen Lieferung von Zellen in einem Gelfoam bauen auf der epikardialen Bereich 28. Sie beobachteten, dass die Überlagerung der Zelle zu konstruieren, auf das Epikard zu einer besseren Funktionalität Transplantat gegenüber intramyokardialer Zellinjektion und berichtet, dass dieses Verfahren ist reproduzierbar, benutzerfreundlich und für die Tiere 28 weniger traumatisch. Ein wichtiges Merkmal der Zelle Injektionsexperimenten ist die Rückverfolgung der Zellen und ihr Überleben. Wir haben gezeigt, dass HEK293-Zellen sind leicht zu unterscheiden durch ihre Morphologie zu erkennen im Vergleich zu Herzzellen. Diese Zellen überlebten die Injektion (Daten nicht gezeigt) und in das Gewebe von einer Woche nach der Operation erhalten. Um Zellen für Langzeitstudien zu verfolgen und deren Transplantation in das Gewebe der Auslieferung sowie in anderen Geweben zu analysieren, sind verschiedene Techniken in Gebrauch, einschließlich Fluoreszenzmarkierung und eine FISHnalyse im Sex-Mismatch Transplantationsversuche 29. Wichtig ist, dass in-vivo-Bildgebung eine wichtige Rolle spielen auf in vitro-Analysen in zukünftigen Studien. Tatsächlich besteht ein Vorteil der in-vivo-Bildgebung über histologischen Methoden der Verfolgung von Zellen in Langzeitstudien bei denselben Tieren ohne die Notwendigkeit der Euthanasie 29. Bei dieser Methode können die Zellen mit Biolumineszenz-Reagenzien, Eisenteilchen und spezifischen Reportergene mit Positronenemissionstomographie (PET) und Magnetresonanz (MRI) abgebildet werden, markiert werden. Die Analysen zeigten, dass noncontractile Zellen wie HEK293-Zellen, bevorzugt in dem Bereich, wo sie injiziert wurden, durch eine dünne Kollagengewebe umgeben gruppiert. Obwohl die pathophysiologischen Mechanismen, die zu der Bildung von fibrotischen Gewebe in einem immunodepleted Maus unbekannt sind, kann die Kollagengewebe um die transplantierten Zellen sichtbar vergleichbar mit dem Endpunkt eines seinGewebe-Implantat kompatibel. In diesem Fall kann das exogene Material von den Entzündungszellen entfernt werden und wird in einer dichten Schicht von fibrotischen Bindegewebe, die sie von den umgebenden Geweben isoliert eingekapselt ist. Ähnlich zu den im Endstadium Phasen der Wundheilung, ist dies Granulationsgewebe gefäß und sichert das Überleben der implantierten Materials. Technisch wird das hier beschriebene Verfahren erfolgreich war, obwohl intramyokardialer Nadelinjektion erzeugt einen kleinen Bereich der Beschädigung des umgebenden Gewebes. Obwohl die Herzfunktion Messungen waren nicht das Ziel dieser Überprüfung sollten zukünftige Studien untersuchen, ob kleinere Gewebeschäden können Zelltherapie Analysen stören. Weiterhin wäre es wichtig zu untersuchen, ob die in der Injektionsstelle erzeugt Verletzungen durch die Nadel verursacht wird, durch die Menge der injizierten Zellen oder durch eine Kombination von beiden. Unterstützung unserer Ergebnisse wurde gezeigt, dass transplantation von Mischpopulationen von differenzierten humanen embryonalen Stammzellen (hES), die 20-25% Kardiomyozyten (hES-CM) in die gesunde Herzen von immungeschwächten Mäusen (NOD-SCID) führte zu einer schnellen Bildung von Transplantaten, in der die Herzmuskelzellen wurde organisiert und gereift über die Zeit und die Bevölkerung wurde noncardiomyocyte 23 verloren. Interessanterweise beobachteten die Autoren, dass die HES-CM weitgehend vom Host Myokard durch eine Schicht aus faserigem Gewebe, das die Bildung eines elektro Syncytium 22,23 verhindert isoliert. In einer anderen Studie, Kehat et al. Festgestellt, dass hES-CM erfolgreich ging im Ventrikel bei Schweinen mit komplettem Herzblock. Diese Studie zeigte, dass die transplantierten Zellen überlebten, funktioniert, und integriert in Wirtszellen, Nachweis für ihre Fähigkeit, als biologische Alternative zu elektronischen Herzschrittmacher 30 funktioniert. Diese zwei diskordanten Ergebnisse können durch den Unterschied in der Struktur und Funktion ho vereinbarenst und Geberarten. Tatsächlich ist es möglich, daß der Wirkungsgrad der Kopplung von transplantierten Kardiomyozyten kann auf die relative Schlagfrequenz von Host-und Spenderzellen abhängen. Van Laake Studie 23 konnte die Bildung von funktionellen Übergänge aufgrund der unterschiedlichen Schlagfrequenz des menschlichen Kardiomyozyten (60-100 bpm) gegen Nagetier Kardiomyozyten (300-600 bpm) beeinträchtigt werden. Dies wäre der Fall bei Schweinen gegenüber menschlichen Transplantationsversuche nicht, wie in Kehat Analyse 30 beschrieben. Die Länge der Beobachtungszeit ist ein weiterer Störfaktor. hES-CM in die Nagetier-Herz transplantiert nach Myokardinfarkt induzierte Verbesserung der Herzfunktion nur für die kurzfristige Zeitpunkten (4 Wochen). Doch nach 12 Wochen, die Herzfunktion nicht weiter trotz Transplantatüberleben 23 getragen. Die Autoren stellten fest, daß Transplantatgröße (erhöhte Menge von Zellen) wurde mit verbesserter Langzeit kardialen surv zugehörigenival-und Funktionsverbesserungs 31 zeigt an, dass Langzeitanalysen gegen kurz-oder mittelfristige Analysen sollten in zukünftigen Studien, ohne dass eine erhöhte Anzahl von Zellen für die Injektion durchgeführt werden. In der vorliegenden Studie, bleiben mehrere Fragen über die Art der Zellen transplantiert werden, die Auswahl der Host-Spenderspezies getestet werden und eine detaillierte Auswertung der Herzrhythmuspotential der Zellen. Im Idealfall, Stammzellen in den Herzmuskel implantiert für den Austausch oder die Schrittmacherfunktion sollte funktionell Paar mit den übrigen Muskelzellen. In einem Rattenmodell für Herzinfarkt, Fernandes et al. Verwendet 32 Programmierte elektrische Stimulation (PES), um Herzrhythmusstörungen Anfälligkeit zu bewerten, zeigt eine erhöhte Induzierbarkeit von ventrikulären Arrhythmien in Myoblasten injiziert Herzen verglichen mit den Kontrollen. In derselben Studie wurde Injektionen von Knochenmark abgeleiteten autologen Zellen nicht in einer erhöhten inducibil führenkeit von ventrikulären Rhythmusstörungen im Vergleich zu Kontrollen, damit was die Autoren zu dem Schluss, dass die Myoblasten wies eine spezifische arrhythmogene Risiko. In einer anderen Studie, Knochenmark-abgeleiteten Zellen (BMC) in Clustern innerhalb der Infarktnarbe oder Grenzzone effizient gepfropft, zeigte aber keine elektronisch evozierte Ca-Transienten 33. Interessanterweise Wei et al. Zeigten, dass mesenchymale Stammzellen (MSC) nicht die elektrophysiologischen Eigenschaften von reifen Herzmuskelzellen während der Überlebenszeit in den Infarktherzen erwerben. Sie können jedoch die elektrische Anfälligkeit lindern und fördern nicht ventrikuläre Arrhythmien 34. Die Wirksamkeit und das Auftreten von Rhythmusstörungen Stammzellentherapie hängt von den Zellen als auch auf den Lieferrouten. In der Tat, in Rattenherzen nach MI 35, intramyokardialen BMC Injektionen, obwohl Verbesserung der Herzfunktion, erhöht in Folge ventrikuläre Kontraktionen und ventrikuläre tachycardua für die ersten 14 Tage. Wenn die intrakoronare Route verwendet wurde, ventrikuläre Arrhythmie Auftreten deutlich verringert. In klinischen Studien ist die proarrhythmischen Funktion der injizierten Zellen schwierig zu beurteilen, wie die meisten der Patienten erhalten Beta-Blocker als Mittel für ischämische Herzerkrankungen angegeben. Behandlung mit Beta-Blockern kann eine Potential pro-arrhythmischen Effekt der transplantierten Zellen zu maskieren. Tierexperimentelle Studien sind daher von entscheidender Bedeutung, um die Grundlagen der proarrhythmischen Reize in der Stammzelltherapie zu beurteilen. Zusammenfassend zeigen unsere Daten demonstriert die Machbarkeit von intramyokardialen Zell-Injektion in Mäusen, aber auch die Notwendigkeit für eine detaillierte Analyse über die Sicherheitsbedingungen der Zelltransplantation. Beim Menschen wurde gezeigt, dass Zellinjektion mit pro-Arrhythmien zugeordnet 36-38, Restenose 39, 40 beschleunigte Atherosklerose und koronare Hindernis 41. Die Grundlagenforschung wird in Zukunft wichtig sein, klinische Appchungen zu verstehen, welche Zellen geliefert werden sollen, der Art der Lieferung, die Mechanismen der Zell-vermittelten myokardialen Funktion reparieren, und das Design einer allogenen gegenüber autologen Zelltransplantation Protokoll, das die ganze Bevölkerung profitieren. Wegen der hohen Kosten, die mit großen klinischen Studien, die Reproduzierbarkeit der Effizienz und Wirksamkeit der Transplantation Protokollen muss in präklinischen Modellen, wie sie hier beschrieben behandelt werden.

Verschiedene Zellabgabe-Protokolle in murinen und Rattenmodellen von kardiovaskulären Erkrankungen, die mit dem Ziel der Umsetzung der Effizienz, Wirksamkeit und Sicherheit dieser experimentellen Verfahren in menschlichen Patienten getestet. In kleinen Nager Herzen, ist intramyokardialen Zellabgabe die praktikabelste Methode der Zellabgabe 1,2, während in der Rattenherzantegrade und retrograde 3 4 intrakoronare Infusion Zelle kann ebenfalls verwendet werden. Beide Methoden haben Grenzen und Vorteile. Zell Lieferung über die intrakoronare Route hat theoretischen Vorteile gegenüber der direkten intramuskuläre Injektion in die Förderung der weltweiten Verbreitung Zelle 3, aber es hat auch die Gefahr, dass Herzkranzembolie 3,5. Einschränkungen bei der Lieferung intramyokardialen sind mit mechanischen Verletzungen, akute Entzündungen und Herzmuskelschäden 6,7 verbunden. Beim Menschen werden die Zellen für die Reparatur von Herz intramyokardiale Injektion durch eine endokardiale oder epikardiale chirurgischen zugenähern oder durch intrakoronare arteriellen Linie 8. Injection von transvaskuläre Routen ist bei Patienten mit akutem Infarkt und Herzmuskel reperfundierten geeignet, kann aber nicht möglich sein, im Falle von Totalverschlüssen oder schlechte Fluss innerhalb der Gefäße des Gebietes erfolgen 9. Direkte Injektion in die Herzkammerwand durch transendokardialen oder transepikardialen Injektion technisch möglich je nach Patient Gesundheitszustand. Tatsächlich hat es sich gezeigt, dass diese Technik sicher 10,11, obwohl für transepikardialen Injektion eine offene Brustchirurgie notwendig ist und für ein elektro transendokardialen nähert Zuordnung für jeden Patienten erforderlich ist, um lebensfähige Stellen von ischämischen oder vernarbten Herzmuskel 9 unterscheiden. Wichtig ist, dass in der Zelltherapie-Studien die Auswahl der besten Zelle zu trans wird noch untersucht. Kurzzeitanalysen (4 Wochen) zeigten, dass die Injektion von Herzstammzellen definiert als cardiospheres <sbis&gt; 12 oder Side Population Zellen aus Knochenmark 13 induziert Herz funktionelle Erholung in Maus und Ratte 14 15 Modelle von Myokardinfarkt durch eine Verringerung der Narbengröße und Zelltod. Die allogene Transplantation von cardiospheres in einem Rattenmodell Myokardinfarkt ohne Immunsuppression wurde festgestellt, um sicher zu sein, förderte Herzregeneration und verbessert die Herzfunktion durch Stimulation der körpereigenen Reparaturmechanismen 15. Lin-/c-kit + adulte Progenitorzellen im Herzen wurde gezeigt, dass selbst erneuernde, klonogenen und multi in vitro und in vivo, und wenn in einem ischämischen Rattenherzen injiziert rekonstituiert große Teile des verletzten Myokard-Wand 16 und hatte die Fähigkeit, leitende und mittelgroße Koronararterien 17 zu bilden. Diese viel versprechenden Daten angeheizt Phase I und II der klinischen Studien am Menschen: Injektion von autologen und allogenen mesenchymalen Stammzellen (MSC) 18, 19 cardiospheresOder c-Kit positive Herzstammzellen (CSC) 20 in ischämischen Herzen der Menschen zeigten jeweils positiven Auswirkungen auf die Herzfunktion in Langzeitstudien. Dennoch umfangreiche Langzeit-Follow-up-und retrospektive Meta-Analyse zeigte, dass die Stammzelltherapie einen wesentlichen Nutzen für einige Patienten, in anderen aber nicht mit einer Reichweite von 21 unvorhersehbare Ergebnisse. Es ist möglich, dass diese Einschränkungen wird das Design von spezifischen Protokollen der Zellabgabe für jeden einzelnen und jede Erkrankung erfordern. In Maus-und Rattenmodellen zeigten Langzeitstudien, dass Zellinjektion nicht weiter Herzfunktion (12 Monate) zu verbessern. Tatsächlich Transplantate von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten (hES-CM) wurden weitgehend von der Host-Myokard durch eine Schicht von fibrotischen Gewebes 22,23 isoliert. Ähnliche Ergebnisse wurden nach der Transplantation von intramyokardialen Skelettmyoblasten in das Herz des infarzierten Mäusen 24 beobachtet. Furthermore, die langfristige Möglichkeit der allogenen MSCs Funktion in der Infarkt Herzen bewahren durch Übergang von einer immun eine immunogene Zustand nach Differenzierung 25 begrenzt. Unter Berücksichtigung der Herausforderungen und Perspektiven oben dargelegt, zeigen wir hier, wie man Zellen durch intramyokardialen Injektion in Mäusen zu liefern. Wir beobachten, dass Zellen ohne Herzmuskelkontraktionseigenschaften nicht mit dem Host-Myokard verbunden und bilden eine zusammenhängende Masse mit einer dünnen fibrotischen Barriere. Obwohl in einigen Fällen dieses Ergebnis kann vorteilhaft sein, kann die folgende Analyse nützlich sein, um zu verstehen, wie Zelltransplantations kann moduliert werden, um funktionsfähig verbunden myokardialen Strukturen sowie zu erzeugen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="560">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Isolator</td>
			<td style="width:115px;">Pfi systems</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Quotation needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:115px;">Vet Tech Solutions</td>
			<td style="width:88px;">HE006</td>
			<td style="width:255px;">For small animals</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">medetomidine</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">atipamezole</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Hair removal cream</td>
			<td style="width:115px;">Commercial shops</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:115px;">NVS</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Leica MZFLIII microscope</td>
			<td style="width:115px;">Leica</td>
			<td style="width:88px;">Model S6E</td>
			<td style="width:255px;">With swing arm stand TS0</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:103px;">Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner</td>
			<td style="width:115px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:88px;">RS series</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:115px;">Jeol</td>
			<td style="width:88px;">JSM-6610</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Blunt scissors</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">14084-09</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Minivent</td>
			<td style="width:115px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:88px;">73-0043</td>
			<td style="width:255px;">Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Forceps</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">11052-10</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Retraction system</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">18200-20</td>
			<td style="width:255px;">Kit for animals up to 200grams</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">30G 12mm; &#189; inch</td>
			<td style="width:115px;">BBraun</td>
			<td style="width:88px;">A210</td>
			<td style="width:255px;">Fine yellow</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">microliter syringe</td>
			<td style="width:115px;">ESSLAB</td>
			<td style="width:88px;">81201</td>
			<td style="width:255px;">Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">6-0 silk suture</td>
			<td style="width:115px;">Ethicon</td>
			<td style="width:88px;">W1614T</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts

Frühere Studien haben gezeigt, dass Zellabgabe fördert Verbesserung der Herzfunktion durch Freisetzung von Zytokinen und Faktoren, die Herzgewebe Revaskularisation und das Überleben der Zelle zu erhöhen. Darüber hinaus sind weitere Beobachtungen zeigten, dass bestimmte Stammzellen, wie Herzstammzellen, mesenchymale Stammzellen und cardiospheres haben die Fähigkeit, innerhalb der umgebenden Myokard durch Differenzierung in Kardiomyozyten, glatte Muskelzellen und Endothelzellen zu integrieren. Hier präsentieren wir die Materialien und Methoden, um zuverlässig zu liefern noncontractile Zellen in der linken Herzkammerwand der immunodepleted Mäusen. Die wesentlichen Schritte dieser mikrochirurgischen Verfahren beinhalten Anästhesie und Analgesie Injektion, intratracheale Intubation, Schnitt, um die Truhe zu öffnen und setzen das Herz und die Lieferung von Zellen durch eine sterile 30-Gauge-Nadel und einer Präzisionsmikroliter-Spritze. Gewebeverarbeitung, bestehend aus Herz Ernte, embedding, Schneiden und histologische Färbung zeigte, dass intramyokardialer Zellinjektion erzeugt eine kleine Beschädigung in der epikardialen Fläche, als auch in der Herzkammerwand. Noncontractile Zellen in die Wand des Myokards immunsupprimierten Mäusen erhalten und wurden durch eine Schicht aus faserigem Gewebe, wahrscheinlich von Herz Druck und mechanischer Belastung zu schützen, umgeben ist.

Wir injizierten HEK293-Zellen, die unterscheidbar von der Herzzellen durch ihre unterschiedliche Morphologie (Fig. 1) sind, mit einer Kopfsteinform im Vergleich zu den länglichen Kardiomyozyten (Fig. 1A). HEK293-Zellen waren zu Hämatoxylin Farbstoff (blaue Farbe) reaktiven Vergleich zu Kardiomyozyten (rosa Farbe), wahrscheinlich wegen ihrer erhöhten Kerngehalt (Abbildung 1A). Zur weiteren Unterscheidung der injizierten Zellen aus dem Wirtsgewebe wurden HEK293-Zellen mit DAPI 2 Stunden vor der Injektion gekennzeichnet. -Markierte Zellen wurden in das Myokardgewebe sichtbar, wie in Fig. 1E gezeigt. Steuerscheinoperierten Mäusen zeigten keine Schäden in der ganzen Herzen (1C) und der Integrität des Gewebes (1D). In einer ganz kurzen Achse des Herzens waren injizierten Zellen als eine homogene Gruppe im Bereich der Injektion (1B) ersichtlich. Die gruppiert cEllen wurden durch eine dünne Schicht von faserigem Gewebe, das als blaue Bereich in der Trichrom-Färbung (Fig. 2A) erschienen umgeben. Die Zellen wurden nicht mit dem Host-Myokardgewebe verbunden, wie durch Rasterelektronenmikroskopie (2B), wahrscheinlich aufgrund ihrer Funktion und noncontractile verschiedenen Zellstruktur dargestellt. Zusätzlich zu den obigen Beobachtungen haben wir festgestellt kleinen Schadstellen, wo die Nadel injiziert wurde (Fig. 3A). Diese Bereiche laufen von der externen epikardialen Schicht des Herzens in die Herzmuskelwand (3A). Injizierten Zellen (grüner Pfeil, 3B) sind in der Nähe des verletzten Bereich (schwarze Pfeile, 3B) vor. DAPI-positiven Zellen waren an der Injektionsstelle (3C, weiße Pfeile) sichtbar. Eine Woche nach der Verletzung war Tunel Assay nicht erhöht apoptotischen Zellen zeigen, an der Stelle der Verletzung, was darauf hindeutet, dass die Nekroseanstatt Apoptose Nadel nach Injektion (Fig. 3D) aufgetreten ist. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51064/51064fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51064/51064fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Histologische Analyse der injizierten Zellen. A) Eine Woche nach der Zellinjektion Herzen wurden in Paraffin eingebettet und für Hämatoxylin-und Eosin-Färbung verarbeitet. Spritzt HEK293-Zellen wurden in die Wand der linken Herzkammer vorhanden ist. Bilder wurden mit einem Stereofluoreszenzmikroskop. B) erhaltenen dreifarbig gefärbten Geweben zeigte, dass die Zellen in der Umgebung gruppiert, wo sie (Pfeil) injiziert. Rechten unteren Felder zeigen die kurze Achse sehen Sie mit der rechten (RV) und linken Ventrikel (LV). Das rote Rechteck zeigt den Bereich, in dem Zellen erhalten (1.5X). Die Bilder wurden mit einer Rutsche-Scanning-Mikroskop aufgenommen. C) Trichrome staining Kontrolle scheinoperierten Herzen. Ganzen Herzen Ansicht mit einem 5fach-Ziel. D) Trichromfärbung der scheinoperierten Mäusen zeigt myokardialen Gewebeintegrität. E) HEK293-Zellen wurden mit DAPI 2 Stunden vor der Injektion gefärbt. Eine Woche nach der Injektion Herzen wurden im Oktober bei 6 um eingebettet und in einem Kryostaten geschnitten. Zellen wurden unter UV in einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Linke und rechte Ventrikel dargestellt. In der rechten Herzkammer, rechte Tafel, die weiße Linie markiert den epikardialen Schicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51064/51064fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51064/51064fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51064/51064fig2.jpg" /> 2. Die Bildung einer fibrotischen Schicht zwischen injizierten Zellen und Wirtsgewebe. A) Trichromfärbung ShowKollagengewebe zwischen HEK293-Zellen und Maus-Herzmuskelgewebe (Pfeile) gebildet. Die Bilder wurden mit einer digitalen Rastermikroskop aufgenommen. B) Die Herzen wurden entparaffiniert und verarbeitet für die Rasterelektronenmikroskopie. Die Bilder wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop aufgenommen und zeigen Kollagenfasern (Pfeile) zwischen den injizierten HEK293-Zellen (links) und dem Host-Myokard (rechte Seite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51064/51064fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51064/51064fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51064/51064fig3.jpg" /> 3. Zellinjektion hergestellt kleine Bereiche von Schäden. A) Trichromfärbung zeigt kleine Schadstellen, wo Nadel wurde (blaue Farbe eingespritzt wird;. Pfeile) B) Paraffinschnitte wurden von Trichrome sta gebeiztining und der Bereich, in dem die Zellen injiziert wird durch schwarze Pfeile angedeutet. Injizierten Zellen (grüner Pfeil) zu sehen waren in der Nähe des verletzten Bereich. C) HEK293-Zellen mit DAPI 2 Stunden vor Injektion gefärbt, an der Injektionsstelle (weißer Pfeil) vorhanden waren. Die Injektionsstelle ist mit einem grünen Pfeil angezeigt und die weiße Linie markiert die offene Herzbeutel-Schicht. D) Tunel Assay auf Paraffinschnitten durchgeführt wird, nicht relevant Fluoreszenz positiven Kerne zu zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51064/51064fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

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Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Intramyokardialer Zellabgabe in murinen Modellen von kardiovaskulären Erkrankungen, wie Hypertonie oder Myokardinfarkt, wird häufig verwendet, um das therapeutische Potential von verschiedenen Zelltypen in der Regenerationsstudien getestet. Daher wird eine ausführliche Beschreibung und eine klare Visualisierung dieses chirurgische Verfahren helfen, die Grenzen und Vorteile der Herz-Kreislauf-Zelle therapeutische Analysen in kleinen Nagern zu definieren.

Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K Aufrufe.  Imperial College London.  Intramyokardialer Zellabgabe in murinen Modellen von kardiovaskulären Erkrankungen, wie Hypertonie oder Myokardinfarkt, wird häufig verwendet, um das therapeutische Potential von verschiedenen Zelltypen in der Regenerationsstudien getestet. Daher wird eine ausführliche Beschreibung und eine klare Visualisierung dieses chirurgische Verfahren helfen, die Grenzen und Vorteile der Herz-Kreislauf-Zelle therapeutische Analysen in kleinen Nagern zu definieren. 

Serie: Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Forschung

Medizin

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Injection of Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently used for the first time in patients who had symptomatic heart failure. In all patients, cardiac function of the left ventricle (LV) improved significantly, as manifested by consistent reduction of the LV volume and wall stress. Here we describe this novel treatment procedure and the methods used to quantify its effects on LV wall stress and function.
Algisyl-LVR is a biopolymer gel consisting of Na+-Alginate and Ca2+-Alginate. The treatment procedure was carried out by mixing these two components and then combining them into one syringe for intramyocardial injections. This mixture was injected at 10 to 19 locations mid-way between the base and apex of the LV free wall in patients.
Magnetic resonance imaging (MRI), together with mathematical modeling, was used to quantify the effects of this treatment in patients before treatment and at various time points during recovery. The epicardial and endocardial surfaces were first digitized from the MR images to reconstruct the LV geometry at end-systole and at end-diastole. Left ventricular cavity volumes were then measured from these reconstructed surfaces.
Mathematical models of the LV were created from these MRI-reconstructed surfaces to calculate regional myofiber stress. Each LV model was constructed so that 1) it deforms according to a previously validated stress-strain relationship of the myocardium, and 2) the predicted LV cavity volume from these models matches the corresponding MRI-measured volume at end-diastole and end-systole. Diastolic filling was simulated by loading the LV endocardial surface with a prescribed end-diastolic pressure. Systolic contraction was simulated by concurrently loading the endocardial surface with a prescribed end-systolic pressure and adding active contraction in the myofiber direction. Regional myofiber stress at end-diastole and end-systole was computed from the deformed LV based on the stress-strain relationship.

This article describes procedures for implanting a novel hydrogel in failing hearts and quantifying its effect on left ventricular wall stress and function. These procedures have been successfully applied in dogs and humans.

Reduktion der linksventrikulären Wandspannung und Verbesserung der Funktion in Failing Herzen mit Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Ultraschall-geführte Transthorakale intramyokardiale Injection in Mäuse

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

Perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektion und Zelle-Lieferung in einem großen präklinischen Modell

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Eine Ratte Carotis Arterie Druck-kontrollierte segmentale Ballonverletzung mit periadventitialen therapeutischen Anwendung

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly predict human cardiac liabilities, posing a multi-billion-dollar burden on the pharmaceutical industry. Hence, there is a worldwide unmet medical need for better approaches to identify drug cardiotoxicity before undertaking costly and time consuming &#39;first in man&#39; trials. Currently, only immature cardiac cells (human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes [hiPSC-CMs]) are used to test therapeutic efficiency and drug toxicity as they are the only human cardiac cells that can be cultured for prolonged periods required to test drug efficacy and toxicity. However, a single cell type cannot replicate the phenotype of the complex 3D heart tissue which is formed of multiple cell types. Importantly, the effect of drugs needs to be tested on adult cardiomyocytes, which have different characteristics and toxicity responses compared to immature hiPSC-CMs. Culturing human heart slices is a promising model of intact human myocardium. This technology provides access to a complete multicellular system that mimics the human heart tissue and reflects the physiological or pathological conditions of the human myocardium. Recently, through optimization of the culture media components and the culture conditions to include continuous electrical stimulation at 1.2 Hz and intermittent oxygenation of the culture medium, we developed a new culture system setup that preserves viability and functionality of human and pig heart slices for 6 days in culture. In the current protocol, we are detailing the method for slicing and culturing pig heart as an example. The same protocol is used to culture slices from human, dog, sheep, or cat hearts. This culture system has the potential to become a powerful predictive human in situ model for acute cardiotoxicity testing that closes the gap between preclinical and clinical testing results.

This protocol describes how to slice and culture heart tissue under physiological conditions for 6 days. This culture system could be used as a platform for testing the efficacy of novel heart failure therapeutics as well as reliable testing of acute cardiotoxicity in a 3D heart model.

Schneiden und Culieren von Schweineherzen unter physiologischen Bedingungen

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Intratracheal Administration of Dry Powder Formulation in Mice

In the development of inhalable dry powder formulations, it is essential to evaluate their biological activities in preclinical animal models. This paper introduces a noninvasive method of intratracheal delivery of dry powder formulation in mice. A dry powder loading device that consists of a 200 &#181;L gel loading pipette tip connected to an 1 mL syringe via a three-way stopcock is presented. A small amount of dry powder (1-2 mg) is loaded into the pipette tip and dispersed by 0.6 mL of air in the syringe. Because pipette tips are disposable and inexpensive, different dry powder formulations can be loaded into different tips in advance. Various formulations can be evaluated in the same animal experiment without device cleaning and dose refilling, thereby saving time and eliminating the risk of cross-contamination from residual powder. The extent of powder dispersion can be inspected by the amount of powder remaining in the pipette tip. A protocol of intubation in mouse with a custom-made light source and a guiding cannula is included. Proper intubation is one of the key factors that influences the intratracheal delivery of dry powder formulation to the deep lung region of the mouse.

Dry powder formulations for inhalation have great potential in treating respiratory diseases. Before entering human studies, it is necessary to evaluate the efficacy of the dry powder formulation in preclinical studies. A simple and noninvasive method of the administration of dry powder in mice through the intratracheal route is presented.

Intratrachealadministration der Trockenpulverformulierung bei Mäusen

In the development of inhalable dry powder formulations, it is essential to evaluate their biological activities in preclinical animal models. This paper ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

Verzögerte intramyokardiale Lieferung von Stammzellen nach Ischämie-Reperfusionsverletzung in einem Murine-Modell

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of transplanted cells within the injured myocardium, limiting their therapeutic efficacy. Recently, the use of scaffolding biomaterials has gained attention for improving and maximizing stem cell therapy. The objective of this protocol is to introduce a simple and straightforward technique to transplant bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) using injectable hydroxyphenyl propionic acid (GH) hydrogels; the hydrogels are favorable as a cell delivery platform for cardiac tissue engineering applications due to their ability to be cross-linked in situ and high biocompatibility. We present a simple method to fabricate MSC-loading GH hydrogels (MSC/hydrogels) and evaluate their survival and proliferation in three-dimensional (3D) in vitro culture. In addition, we demonstrate a technique for intramyocardial transplantation of MSC/hydrogels in mice, describing a surgical procedure to induce myocardial infarction (MI) via left anterior descending (LAD) coronary artery ligation and subsequent MSC/hydrogels transplantation.

Stem cell-based therapy has emerged as an efficient strategy to repair injured cardiac tissues after myocardial infarction. We provide an optimal in vivo application for stem cell transplantation using gelatin hydrogels that are able to be enzymatically cross-linked.

Intramyokardiale Transplantation von MSC-Loading injizierbaren Hydrogelen nach Myokardinfarkt in einem Murine-Modell

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...