We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.

Yumurtalık Kanseri Hücre Hatları 1. Geleneksel Kültür (Yapışık Koşullar) NOT: hücrelerin ve medyanın tüm taşıma steril doku kültürü kaputu yer almalıdır <ol><li> Geleneksel hücre kültürü ortamı hazırlayın. 1 DMEM: 1 kullanarak F12 (+ L-glutamin + 15 mM HEPES), ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye. 0.45 um vakum filtresi kullanılarak filtre solüsyonu. </li><li> Interest.Remove hücre hattı ultra düşük dondurucu veya sıvı azot hücrelerin flakon geleneksel isim, tarih ile etiketlenmiş polistiren 75cm 2 doku kültürü şişesi ve geçiş numarasını hazırlayın. 5 dakika için 37 ° C su banyosu içine yerleştirmek suretiyle defrost. </li><li> 3 mL (yukarıda hazırlanmıştır), geleneksel, hücre kültür ortamı ihtiva eden 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine şişe transfer süspansiyon. 400 x g hızında 5 dakika süreyle 4 ° C&#39;de santrifüj süspansiyon. Bu arada, şişeye 16 ml geleneksel hücre kültür ortamı ekleyin. </li><li>Süpernatant aspire. Pelet ve transfer süspansiyon şişeye gevşetmek için yukarı ve aşağı 2 ml geleneksel hücre kültür ortamı pipetlemeyin hücreleri kullanarak. Yavaşça kaya şişeye eşit olarak 37 ° C ve% 5 CO2 ile nemlendirilmiş ayarlanmış hücre kültürü kuluçka makinesi içinde cells.Place balon dağıtmak. % 80 izdiham ulaşılana kadar günlük hücreleri izleyin. </li><li> 2 hücre kültürü kaputu: hücreler bir kez% 80 birleşen kültürünü 1 bölün. Süpernatant aspire ve (kalsiyum ve magnezyum olmadan) sıcak fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkama (PBS). 1.5 mi tripsin,% 0.25 -EDTA ekleyin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edilir. </li><li> 2 yeni polistiren 75cm 2 şişeler hazırlayın ve her şişeye 16 ml geleneksel hücre kültür ortamı ekleyin. Yeni şişelere her bir 4 ml geleneksel hücre kültür ortamı ve kısım eşit hacimleri içinde tripsinize tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Nemlendirilmiş hücre kültürü kuluçka makinesi içinde yer şişeler 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 ayarlanır. % 80 izdiham ulaşılana kadar günlük hücreleri izleyin. Hücreleri bölmek devam ve-80 veya sıvı azot içinde kültür veya dondurma ve mağaza. </li></ol> Yüzer veya Yapışık hücreleri kullanarak Yumurtalık Kanseri Hücre Hatları gelen çok hücreli küreler 2. Nesil NOT: hücrelerin ve medyanın tüm taşıma steril doku kültürü kaputu yer almalıdır. 2 geleneksel kültür yöntemleri altında hücre hatları kültürleme sonra - 3 pasajlar (bölüm 1) Aşağıdaki adımlarla devam edin. <ol><li> Kök hücre ortamını hazırlayın. 1 DMEM: F12 (+ L-glutamin + 15 mM HEPES), ve% 1 nakavt, serum yerine (100 U bir son konsantrasyon / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin),% 1 penisilin / streptomisin ile takviye 1 kullanın % 0.4 sığır serum albümini ve% 0.1 ensülin transferin selenyum. 0.45 um vakum filtresi kullanılarak filtre solüsyonu. </li><li> 20 ng / ml, 10: n, nihai konsantrasyon, insan rekombinan epidermal büyüme faktörü (EGF) ve insan rekombinant temel fibroblast büyüme faktörü (FGF) ile Ek kök hücre ortamıg / ml idi. NOT: Büyüme faktörleri doğru kullanımdan önce kök hücre ortama taze eklenmelidir. </li><li> Şamandıra TIC kültürü oluşturun. Geleneksel yapışkan kültür koşullarında yetiştirilen% 80 konfluent hücreler balon çıkarın. Geride yapışkan nüfus bırakarak ortamı ve yüzen hücreleri (tek ve agregalar) toplamak ve 50 ml polipropilen santrifüj tüpüne aktarılır. 400 x g hızında 5 dakika süreyle 4 ° C&#39;de santrifüj süspansiyon. NOT: Yüzen hücreler ve agrega belirgindir 24-72 saat yapışan hücreler, geleneksel kültür altında şişeye bağlanmıştır sonra. Yaklaşık olarak 1.0,% 80 konfluent plaka alma kaynaktan - 5.0 x 10 5 canlı yüzen hücreler, hücre hattı ile ilgili olarak, tahmin edilebilir. Bu çalışmada, bir% 80 konfluent yapışkan kültürden toplanan yüzen hücrelerin ortalama sayısı olduğu: OVCAR5 5.0 ACI-23, 4.8 x 10 5 x 10 5, CAOV3 3.5 X 10 5 ve TGS- 1.0 x 10 5 3. Transferi üzerine, çok hücreliBu biraz hücre hattı bağımlı olmasına rağmen, geleneksel ve Flatör TIC kültüründe ular sfero oluşumu bir kaç gün içinde ortaya çıkar. Örneğin, ACI-23 hücre agrega daha çabuk CAOV3 hücrelerini oluştururlar. </li><li> Bununla birlikte, adı, tarih ve hücre çizgisinin kanal adedi ile etiketlenmiş bir ultra düşük bağlantı yüzeyi polistiren 75 cm2&#39;lik doku kültür şişesi hazırlayın. Şişeye büyüme faktörleri ile takviye edilmiş hücre ortamı kök ml 10 ekleyin. </li><li> Santrifüj pelet gevşetmek için aşağı hücre ortamı kök ml 6 ekleme ve yukarı pipetleme ve düşük bağlanma şişeye tam, aspire medya ve transfer pelet bir kez. Nemlendirilmiş hücre kültürü kuluçka makinesi içinde yer şişeler 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 ayarlanır. Sfero oluşumunu gözlemlemek için 3 gün - her 2 hücreleri izleyin. </li><li> Geleneksel TIC kültürü oluşturun. Geleneksel yapışkan kültür koşullarında yetiştirilen% 80 konfluent hücreler balon çıkarın. Aspire medya ve sıcak PBS ile yıkayın. 1.5 ml tripsin% 0.25 EDTA ekleyin ve inkübe 3-5oda sıcaklığında Min. </li><li> Adı, tarih ve hücre çizgisinin kanal adedi ile etiketlenmiş bir ultra düşük bağlantı yüzeyi polistiren 75 cm2&#39;lik doku kültür şişesi hazırlayın. Şişeye, tarif edildiği gibi, EGF ve FGF ile desteklenmiş hücre ortamı, sap ml 10 ekleyin. </li><li> Tripsin ile şişeye hücre ortamı kök ml 6 ekleyin. Pipetleyin hücre çözümü yukarı ve aşağı ve kap yüzeyinden hücreleri gevşetmek için çalışmayın. Hücrelerinin tüm hacmi aktarın 10 hücre ortamı kök ml içeren ultra düşük bağlanma şişesi için. Nemlendirilmiş hücre kültürü kuluçka makinesi içinde yer şişe 37 ° C ve% 5 CO2 ayarlanır. </li><li> Ml, 20 ng / nihai konsantrasyonlar, 10 ng / ml hücre ortamı ve taze EGF ve FGF kök ml ilave 2 ile 72 saat - TIC kültürler, 48 ek. </li><li> % 80 izdiham ulaşana - 60 kadar hücreleri izleyin. 2 yeni ultra düşük bağlanma şişelere eşit hacimlerde yerleştirerek ve 18 ml&#39;lik son bir hacim elde etmek için taze kök hücre ortamı ekleyerek Bölünmüş kültürleri. Alternatifly santrifüj 400 x g&#39;de 5 dakika boyunca 4 ° C &#39;de, tüm süspansiyon. Kök hücre medyada tekrar süspansiyon hücreleri EGF ve FGF ile desteklenmiş ve yeni ultra-düşük bağlanma şişeler içine eşit dağıtmak. Hücreler, geçiş için tek hücre süspansiyonları ayrışması gerekir gerekmez. NOT: Bu noktada kültürler bölünmüş ve kültüre, dondurulmuş ya da deneysel olarak analiz için manipüle edilebilir devam edebilir. 60 -% 80 izdiham hücreleri aşağıdaki konsantrasyonlar ACI-23 için elde edildi: 8.0 Geleneksel Yapışkan x 10 6, Geleneksel TIC için 4,0 x 10 6, ve Floater TIC kültürleri için 5.0 x 10 6. Bu hücre çizgisi bağlı olabilir, ancak biz 5 - ki bu kültür 10 gün CD133 + ALDH + hücrelerinin yüzdesi olarak TIC zenginleştirme için en uygun ilk 3 günü içinde düşük, 5 tepe - 10 gün ve yine azalır 14 gün. </li></ol> İlköğretim Epitel Yumurtalık Kanseri Hücre Hatları ve çok hücreli küreler 3. NesilKemorezistans Hasta ASSİT gelen NOT: Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı bu protokol için elde edilmiştir. Hücrelerin ve medyanın tüm taşıma steril doku kültürü kaputu yer almalıdır. <ol><li> Geleneksel hücre kültür ortamı ile 1: 1 sıvı plaka asit. Bölüm 1 &#39;de tarif edildiği gibi ortam hazırlamak ve çeşitli geleneksel polistiren 75 cm2 doku kültürü şişeleri 10 ilave edin. </li><li> Asit sıvısı genellikle 1 L steril vakumlu şişelerde sağlanır; Vakum kapağını çıkarın. Dikkatlice 37 ° C ve% 5 CO2 ile nemlendirilmiş ayarlanmış hücre kültürü kuluçka makinesi içinde 10 mi, geleneksel araçları ve yer ihtiva eden şişeye sıvı 10 mi Ascites ekleyin. Tam bir medya değişikliği yapmadan önce, 96 saat - 72 rahatsız bırakın. % 80 izdiham - hücreler 60 ulaşana kadar 3 gün - her 2 ortamı değiştirmek </li><li> Bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi bölüm 1. Başlangıç ​​TIC kültürlerinde tarif edildiği gibi 2 - hücreleri 60 ulaştıklarında% 80 izdiham, 1 ayrıldı. NOT: ascit mevcut eritrositlerbunlar yapışkan olmayan olarak es birinci medya değişiminden sonra kaldırılır. Daha hassastır ve tripsin çok az maruz kalma ile asansör gibi mevcut olan herhangi bir fibroblast büyük ölçüde tripsin ile muamele edildikten sonra kaldırılır. Yumurtalık kanseri hücrelerinin arılığı, CA-125 (MUC16) için bir antikor kullanarak akış sitometri analizi ile tespit edilmiştir. </li></ol> TIC İşaretlerinin Sitometrisi Onay için Hücreleri 4. boyanması <ol><li> TIC kültürleri toplayın. 50 ml polipropilen santrifüj tüpü içine şişenin içeriğini aktarın. 400 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje süspansiyonlar yer alır. Aspire medya ve sıcak PBS ile yıkayın. Yığınları parçalamak ve tek tek hücreler içine ayrışmasına kadar 37 ° C de 5 dakika ve en fazla pipetleme ve - 2 ml Enzimatik olmayan ayrıştırma çözeltisi ekleyin 3 inkübe edin. Hücre ortamı kök ml 4 ekleyin. </li><li> Yapışkan kültürler toplayın. Aspire medya ve sıcak PBS ile yıkayın. 3 mi Enzimatik olmayan ayrıştırma çözeltisi ilave edin ve 3 inkübe - 37 ° C &#39;de 5 dak. Geleneksel hücre 3 ml eklekültür ortamı pipetlemeyin yukarı ve aşağı defalarca şişeden hücreleri ayırmak için santrifüj tüpüne toplamak ve. </li><li> Santrifüj TIC ve 400 x g&#39;de 5 dakika boyunca yapışkan süspansiyonlar hem. Süpernatant atılır ve% 3 fetal sığır serumu içeren 1 ml PBS içinde, her pelletini. RT 30 dakika inkübe edin. Bu arada, tripan mavisi kullanarak canlı hücre sayısı. Sferoidler tek hücre içine ayrışmış doğrulamak için mikroskop altında hücrelerin uyun. </li><li> Tazminat 1) boyanmamış (boyanmamış kontrol) tazminat, 2) ALDH (tek leke pozitif kontrol) tazminat, 3) CD133 (tek leke pozitif kontrol), 4: Aşağıdaki kültür koşulları her biri için Etiket 5 x 1,5 ml Eppendorf tüpleri ) ALDH + CD133 (deneysel test örneği), ve 5) FL-1 ve FL-4 kanalları, sırasıyla) içinde DEAB + ALDH (eşiğe için negatif kontroller. </li><li> 400 x g hızında 5 dakika süreyle 4 Santrifüj süspansiyonlar - tüplere 1. yaklaşık 5 x 10 5 hücre her dağıtın. Aspire supernata500 ul Aldefluor Deney Tamponu nt ve tekrar süspansiyon peletler. Deneysel negatif kontrol için tüp # 5 10 ul DEAB (ALDH inhibitörü) ekleyin. </li><li> Tazminat pozitif kontrol ve karıştırmak için fiske için tüp # 2 Aldefluor reaktif aktif 5 ul ekleyin. Deneysel analiz için tüp # 4 Aldefluor reaktif aktif 5 ul ekleyin. Flick tüpü karıştırın ve hemen DEAB içeren tüp # 5 (250 ul) içine tüp içerisinde 4. hücrelerin yarısı hacmi aktarmak için. </li><li> Flick tüpler iyice karıştırın. Işıksız bir ortamda 37 ° C &#39;de, 45 dakika - 30 seyahati inkübe edin. Flick tüpler yarıya kuluçka dönemi boyunca hücreler dibe gibi. Santrifüj 400 x g&#39;de 5 dakika boyunca bütün tüpler. 500 ul Aldefluor Testi Tampon aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> CD133 boyama ile borular için (# 3 ve # 4), doğrudan Aldefluor deney tamponu içine CD133-APC 01:11 ekleyin. Işıksız bir buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. 400 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje CD133 tüpleri. Ile bir kez yıkayınDeney tamponu Aldefluor 500 ul. Sırasıyla 500 ul Aldefluor deney tamponu içinde yeniden süspanse hücreleri. </li><li> Hücre süzgeç kapağı ile bireysel polistiren yuvarlak dipli tüpler içine filtre süspansiyonları. Tüm hacim kapağı içinden süzülmüş emin olun. </li><li> Hücre popülasyonu analiz etmek sitometrede bir akış yararlanın. Tazminat kontrolleri ayarlama boruları # 1-3 kullanın. Hücresel enkaz dışlamak için emin olmak, hücrelerin ileri kullanarak ve yan dağılım parametreleri, kapı. ALDH + ve CD133 + sırasıyla, FL-1 ve FL-4 kanallarını kullanarak çift hücreleri oluşturulması. </li><li> Bir sitometrik analiz programını kullanarak, kültür koşulları bu iki marker için yüksek boyama olmalıdır EFT-zengin kültürler gibi EFT hücrelerin yüzdesini gelişmiş onaylayın. Not: CD133 ve ALDH ek olarak, diğer markersof yumurtalık kanseri TIC akış sitometresi yeteneklerine bağlıdır herhangi bir örnekte kullanılan işaretlerin sayısı ile analiz edilebilir. </li></ol> 5. İn vivo </em&gt; Subkutan enjeksiyonları Hücre Populasyonlarının tümörgenezine Onaylanır NOT: Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı bu protokol için elde edilmiştir. 3 kafeslerde deneysel gruba yaş 8 hafta ve enjeksiyon öncesinde bir kaç gün için gelmesini bekleyin - atimik kadın çıplak farelere 6 dağıtın. NIH Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi göre insani deneysel kurallar altında fareler izleyin; kilo kaybı veya fazla% 20 kazanç, bir deri bir kemik görünüm, ishal ya da dermatit dahil olmak üzere vücut ağırlığı, fiziksel görünümünü izlemek ve CO 2 asfiksi bu kriterlere uyan fareler euthanize. <ol><li> 1 ml PBS içinde Bölüm 2. Hücreleri, her bir hücre popülasyonu içinde tarif edildiği gibi kültür toplayın. Tripan mavisi testi kullanılarak canlı hücreleri saymak. </li><li> 15 ml santrifüj tüpleri hazırlayın. Üç kez için tedbirler, her bir tüp içine 2 ml PBS içerisinde seyreltilmiş 1.5 x 10 6 canlı hücreleri eklemek (0.5 ml bir hacimde 5 x 10 5 hücre deri altından f doğru enjekte edilecektirHer bir farenin sıska). Sadece kontrol fareleri için 0.5 ml PBS hazırlayın. </li><li> 27 G iğne kullanılarak, grup başına 3 Farelerin oluşturduğu her bir sağ böğrüne TIC kültürleri Şamandıra, ya da PBS, geleneksel yapışkan kültürler, geleneksel TIC kültürlerden 0.5 ml&#39;lik hücre süspansiyonu subcutaneouslyinject. Orijinal kafesleri sonrası enjeksiyon fareler dönün. </li><li> Fareler tartılır ve uzunluğunu ve genişliğini kurulması, Vernier kumpas weeklyby kez iki boyutta herhangi bir aşikar tümörleri ölçmek. NOT: Tümör gecikme süresi genellikle 20 - hücre hattı bağlı 50 gün. </li><li> Standart yöntemlerle (V = (genişlik) 2 x uzunluk / 2) tümör ıslak hacim hesaplayın. NOT: Bu çalışma, sadece, benzer koşullar altında yetiştirilen tikler in vivo seri Pasajlanması başkaları 11,20 tarafından tamamlanmıştır ilk nesil için yapışık hücrelere karşı tikler tümörigenikliğini karşılaştırıldı rağmen. </li></ol>

<ol>
	<li>Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K., Herzog, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latest+research+and+treatment+of+advanced-stage+epithelial+ovarian+cancer.">Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 10, 211-224 (2013).</li><li>Ushijima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+for+recurrent+ovarian+cancer-at+first+relapse.">Treatment for recurrent ovarian cancer-at first relapse.</a> J Oncol. 2010, 497429 (2010).</li><li>Erickson, B. K., Conner, M. G., Landen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+fallopian+tube+in+the+origin+of+ovarian+cancer.">The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer.</a> Am J Obstet Gynecol. 209, 409-414 (2013).</li><li>King, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+ovulation+on+fallopian+tube+epithelial+cells:+evaluating+three+hypotheses+connecting+ovulation+and+serous+ovarian+cancer.">The impact of ovulation on fallopian tube epithelial cells: evaluating three hypotheses connecting ovulation and serous ovarian cancer.</a> Endocr Relat Cancer. 18, 627-642 (2011).</li><li>Flesken-Nikitin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+surface+epithelium+at+the+junction+area+contains+a+cancer-prone+stem+cell+niche.">Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche.</a> Nature. 495, 241-245 (2013).</li><li>Paik, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+epithelial+cells+are+concentrated+in+the+distal+end+of+the+fallopian+tube:+a+site+for+injury+and+serous+cancer+initiation.">Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation.</a> Stem Cells. 30, 2487-2497 (2012).</li><li>Connor, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+A+contentious+hypothesis+now+moving+forward.">Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward.</a> Cancer Lett. 344, 180-187 (2014).</li><li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+stem+cells+and+drug+resistance.">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nat Rev Cancer. 5, 275-284 (2005).</li><li>Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor-like+cells+contribute+to+the+aggressive+behavior+of+human+epithelial+ovarian+cancer.">Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer.</a> Cancer Res. 65, 3025-3029 (2005).</li><li>Szotek, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+side+population+defines+cells+with+stem+cell-like+characteristics+and+Mullerian+Inhibiting+Substance+responsiveness.">Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11154-11159 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+ovarian+cancer-initiating+cells+from+primary+human+tumors.">Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors.</a> Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).</li><li>Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+stem-like+cells+from+a+human+ovarian+cancer+cell+line.">Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line.</a> Mol Cell Biochem. 363, 257-268 (2012).</li><li>Kryczek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+aldehyde+dehydrogenase+and+CD133+defines+ovarian+cancer+stem+cells.">Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells.</a> Int J Cancer. 130, 29-39 (2012).</li><li>Meng, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+/CD24-+ovarian+cancer+cells+demonstrate+cancer+stem+cell+properties+and+correlate+to+survival.">CD44+/CD24- ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival.</a> Clin Exp Metastasis. 29, 939-948 (2012).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+human+ovarian+cancer+stem+cells+unravels+the+mechanisms+for+repair+and+chemoresistance.">Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance.</a> Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+characteristics+of+CD44+CD117++ovarian+cancer+stem+cells+in+three+dimensional+basement+membrane+extract+scaffold+versus+two+dimensional+monocultures.">Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures.</a> BMC Cell Biol. 14, 7 (2013).</li><li>Guo, R., Wu, Q., Liu, F., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+the+CD133++subpopulation+of+the+human+ovarian+cancer+cell+line+OVCAR3.">Description of the CD133+ subpopulation of the human ovarian cancer cell line OVCAR3.</a> Oncol Rep. 25, 141-146 (2011).</li><li>Curley, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+expression+defines+a+tumor+initiating+cell+population+in+primary+human+ovarian+cancer.">CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer.</a> Stem Cells. 27, 2875-2883 (2009).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+CD133+and+tumorigenicity+of+CD133++ovarian+cancer+cells.">Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ ovarian cancer cells.</a> Oncogene. 28, 209-218 (2009).</li><li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroid+cells+with+stem+cell-like+properties+contribute+to+tumor+generation,+metastasis+and+chemotherapy+resistance+through+hypoxia-resistant+metabolism.">Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism.</a> PLoS One. 9, e84941 (2014).</li><li>Silva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival.">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).</li><li>Jaggupilli, A., Elkord, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD44+and+CD24+as+cancer+stem+cell+markers:+an+enduring+ambiguity.">Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity.</a> Clin Dev Immunol. 2012, 708036 (2012).</li><li>Irollo, E., Pirozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133:+to+be+or+not+to+be,+is+this+the+real+question.">CD133: to be or not to be, is this the real question.</a> Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).</li><li>Ma, I., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+aldehyde+dehydrogenase+in+normal+and+cancer+stem+cells.">The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells.</a> Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).</li><li>McLean, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ovarian+carcinoma&#8211;associated+mesenchymal+stem+cells+regulate+cancer+stem+cells+and+tumorigenesis+via+altered+BMP+production.">Human ovarian carcinoma&#8211;associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production.</a> J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).</li><li>Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+as+cellular+vehicles+for+prodrug+gene+therapy+against+tumors.">Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors.</a> Biochimie. , (2014).</li><li>Brabletz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT+and+MET+in+metastasis:+where+are+the+cancer+stem+cells.">EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).</li><li>Latifi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumor+cells+from+the+ascites+of+ovarian+cancer+patients:+molecular+phenotype+of+chemoresistant+ovarian+tumors.">Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors.</a> PLoS One. 7, e46858 (2012).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Cancer+Stem+Cells+Transition+between+Epithelial+and+Mesenchymal+States+Reflective+of+their+Normal+Counterparts.">Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts.</a> Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).</li><li>Malecki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRA-1-60(+),+SSEA-4(+),+Oct4A(+),+Nanog(+)+Clones+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+the+Embryonal+Carcinomas+of+the+Ovaries.">TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries.</a> J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).</li><li>Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).</li><li>Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-initiating+stem-like+cells+in+human+prostate+cancer+exhibit+increased+NF-&#954;B+signalling.">Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-&#954;B signalling.</a> Nat Commun. 2, 162 (2011).</li><li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oct4+and+Nanog+transcription+network+regulates+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 38, 431-440 (2006).</li><li>Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+to+Nanog,+Oct4+and+Sox2+coding+regions+modulate+embryonic+stem+cell+differentiation.">MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation.</a> Nature. 455, 1124-1128 (2008).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+impact+of+the+cancer+stem+cell-related+marker+NANOG+in+ovarian+serous+carcinoma.">Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma.</a> Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada açıklanan protokol kurulan yumurtalık kanseri hücre çizgileri ile ilgili kök hücre özellikleri olan hücreler için kültür zenginleştirmek için etkin ve tutarlı bir yöntem sunulur ve birinci hasta numuneleri için de geçerlidir. Bu yöntem, başarılı bir şekilde hücre çizgileri, çeşitli boyunca tikler için zenginleştirir. Bu fiziksel nüfus içinde olmayan tikler gelen tikleri sıralamak için zaman ayırdığınız olmadan TIC ve / veya tümörijenik fenotip zenginleştirmek koşulları zamanında tanımlanması için izin verir. Bu şekilde, farklı sinyal yollarının nispi seviyeleri, fonksiyonel analizlerin kullanarak çeşitli kültürler tlc geleneksel yapışkan kültürler karşılaştırarak TIC fenotipe katkıları için değerlendirilebilir. Saf TIC nüfus isteniyorsa, izolasyon kolaylıkla protokol akış sitometrisi bir floresan yardımlı veya manyetik ayırma adımı dahil edilmesi ile elde edilebilir. Ancak, akılda tutmak önemlidir TIC marker ifadesiBöyle CD133, CD44, ya da ALDH gibi s, hücre hatları ve hatta aynı tümör Çeşidi hasta numuneleri arasında değişebilir. Örneğin biz ters ACI-23 için geçerlidir ise OVCAR-5 hücreleri, CD44 CD133 için göreceli yüksek ifadesini sahip olduğu bulundu. Bu farelerde tümör başlatılması güveniyor ve TIC varlığı kesin olarak akış sitometri analizine nedenle ilgili olduğunu. Yumurtalık kanseri hücreleri, kök hücre şartlarda yetiştirildiği zaman bu protokol izlenerek, yüksek ALDH aktivitesinin sürekli gözlenmiştir. ALDH Şamandıra TIC koşullarda en yüksek ise İlginçtir, CD133 ifadesi, geleneksel TIC kültür koşullarında yetiştirilen ACI-23 hücrelerinde sürekli yüksektir. Buna TGS-3 ilköğretim asit hücreleri şamandıra TIC koşullar altında CD133 pozitifliği küçük bir artış, ama geleneksel TIC koşullarında ALDH aktivite belirgin bir artış gösterir. Bu bulgular yumurtalık kanseri hücrelerinin heterojenitesini ve yaygın tikler ile ilişkili plastisite vurgulayın. Ayrıca CLA desteğinebu yöntemler, tikler geliştirmek im, TRA-1-60 pozitif hücrelerin zenginleştirilmesi de gözlenmiştir. TRA-1-60 bir Pluripotency belirtecidir ve prostat kanseri TICS 30-32 gibi embriyonal yumurtalık karsinom ve testisler tanımlamak için kullanılmıştır. Bizim yöntem çok sayıda hücre hatları ile başarılı olmuş olmasına rağmen, bu buluşun tadil edilmiş şamandıra koşullarına daha iyi Diğer yumurtalık kanseri hücre popülasyonlarında tikler zenginleştirmek ise standart TIC koşulları, bazı yumurtalık kanseri hücreleri için daha uygun olabilir mümkündür. Bu da yine, hem hasta türetilmiş ve kurulan yumurtalık kanseri hücre hatları içinde beklenen heterojenliğini altını çiziyor. Bu belirteçler yumurtalık kanseri tikler özgü değildir ve oldukça embriyonik kök hücre pluripotensin için önemli faktörleri temsil rağmen hücre yüzey belirteçleri ek olarak Nanog, Sox2, Ekim-4 11 olmak üzere yumurtalık kanseri tikleri karakterize gösterilmiştir çeşitli transkripsiyon faktör vardır ve differentiation 33,34. Biz bu faktörlerin protein düzeylerinde değişiklikler incelenmiş ve Nanog düzeyleri diğerlerine 13,35 yanı sıra CD133, TRA-1-60 ve CD117 ile anlaşarak, TIC kültür koşullarında arttığı bulundu. Bir insan kök hücre işaretleyici cDNA dizisi bundan başka, geleneksel yapışkan koşulları ile karşılaştırıldığında TIC koşullarda CD133, Nanog, Melk ve PODXL genlerinde bir artış göstermiştir. Önemli bir şekilde, hücre yüzey belirteçleri ile olduğu gibi, yumurtalık tikler ilişkili transkripsiyon faktörleri, hücre çizgileri ve hasta örnekleri arasında değişebilir, dikkat edilmelidir. Biz, in vitro olarak doğal olarak yapışkan olmayan ise hücreleri daha tümörijenik olduğu ve kök hücre belirteçlerin daha yüksek seviyelerde olduğunu gözledik (yani, hali hazırda bir yapışkan levha eklemek olmayan hücrelerin yüzer). Kültür, bu tür ACI-23 gibi hücre hatları, genellikle, geleneksel kültür iklimlendirme altında bir istifleme şekilde dikey olarak büyümesi çok uygulanabilir yüzen hücreler ve / veya hücre bilgisiiyonları. Yüzen hücreleri ve agrega gelen tikler başarılı zenginleştirme Bu çalışmada ve OVCAR-3 12 olanlar da dahil olmak üzere oldukça az için geçerli hücre hatları olabilir, ancak bizim bulgular bu daha tümörijenik nüfusu temsil düşündürmektedir. Bu nedenle, ticari bir kök hücre ortamına uyum sağlayamamaktadır hücreleri için, TIC zenginleştirme alternatif bir yöntem olarak hizmet edebilir, standart doku kültür plakaları ve ortam içinde yetiştirilen hücreler &quot;yüzen&quot; nüfus toplanması. Bu yazıda sunulan farklı kültür yöntemlerinin kullanılması TİC nüfus hızlı zenginleşme ve farklı hücreler bu fenotip destek faktörleri ne daha iyi bir anlayış sağlayacaktır. Bu yöntemin Mevcut uygulamalar sinyal yolları hücre bu eşsiz nüfusun yayılmasını desteklemek için çok önemlidir karakterize edici içerir. Bu çalışmaların sonuçları, tümör ilerlemesi ve nüks mekanizmalarını açıklamak için yardımcı olacaktır.

Yumurtalık kanseri morbidite ve mortalite bu hastalığın son derece tekrarlayan, Kemoterapiye dirençli özellikleri olmanın en önemli nedeni ile ABD&#39;de en ölümcül jinekolojik malignitedir. Bazı durumlarda 1 yararlı olabilir neoadjuvan tedavi önermek için bazı kanıtlar olmasına rağmen, birincil tedavi genellikle, maksimal sitoredüktif cerrahi ve sonraki platin bazlı tedavi içermektedir. Hastaların çoğunluğu birincil tedaviye olumlu yanıt, ama ne yazık ki yarım 18 ay 2 içinde nüks edecektir. En over maligniteler epitel karsinomlar ve yumurtalık veya fallop tüpü 3,4 yüzey epitel kaynaklanabilir. Çeşitli çalışmalar muhtemelen yumurtlama 5,6 aşağıdaki gerekli doku tamirinde yardımcı kadın üreme sistemindeki somatik kök hücrelerin varlığını desteklemektedir. ovul sırasında yumurtalık ve fallop tüpü hem de yüksek proliferatif aktivitetirme (. Gharwan, vd gönderilen yazının) yumurtalık kanseri gelişiminde önemli bir faktör olabilir. tümör oluşturucu hücre türetme belirsizdir fakat bölme kaderlerini veya düzenlemek için mümkün hale getirilmek mutasyonlar yoluyla normal kök hücreleri, projenitör hücreler ya da farklılaşmış hücrelerden ortaya çıkabilir. Bu hücreler aynı zamanda, &quot;kanser hücrelerini başlatan&quot; &quot;kanser kök hücrelerini,&quot; ya adlandırılır ve düşük bağlanma koşullarında tümörijenik, çok hücreli sferoitler dönüşebilir. TIC gelişme hiyerarşik modeli dinamik olabilir, ancak TIC kemoterapi, uzun vadeli kendini yenileme ve çeşitli hücre soyları 7,8 içine ayırt yeteneği sükunet, direniş de dahil olmak üzere, normal kök hücrelerin aynı özellikleri birçok paylaşmak yoktur. Çeşitli çalışmalar, yumurtalık kanserinde tikler varlığını destekleyen ve mevcut çabaları bu hücreler tümör oluşumu 9-11 destekleyen hangi mekanizma (lar) netleştirmek için çalışmalar devam etmektedir. Her bir belirtecin tam katkı belirsizdir ve 11-16 belirli bir hücre tipi olabilir, ancak bazı belirteçler, CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, ve MyD88 dahil olmak üzere gelişmiş tümöre neden olan yumurtalık tikler tanımlamak için önerilmiştir. Evrensel işaretleyici veya belirteçlerin set tümden yumurtalık tikler için kurulmuş olsa da, farklı gruplar yüksek aldehit dehidrogenaz (ALDH) aktivite 13,17-21 ile CD44 +, için CD133 + ve / veya hücreleri seçerek daha sık yumurtalık tikler izole var. CD44 hiyalüronik asit için bir reseptör olarak görev yapar ve yapışma, çoğalma, göç, anjiyojenez ve farklılaşma 22 de dahil olmak üzere tümör ilerlemesi için önemli olan pek çok işlemleri düzenleyen bir zar glikoproteinidir. CD133 olan işlevi henüz belli değil, ancak çalışmalar plazma zarı topoloji 23 organize önermek bir transmembran glikoproteindir. ALDH, aldehitlerin oksidasyonu kataliz eden bir hücre içi enzim, en univers olabiliryüksek etkinlik olarak tikler el işareti, normal kök hücrelerinin ve tiklerin 24 desteklemede ALDH atfedilen doku ve çoklu rolleri çeşitli izole kök hücre tespit edilmiştir. Şu an itibariyle, CD133 ve ALDH1 over tikler 13,21 en tekrarlanabilir belirteçleri olarak görünür. Tikler özelliklerini anlamak için ek olarak, özellikle bu alt popülasyonunu hedef ilaçların belirlenmesi için büyük bir çaba vardır. yumurtalık kanseri ile ilişkili yüksek nüks oranı başarıyla tikleri ortadan kaldırmak için mevcut kemoterapi yetmezliğine bağlı olabilir. Tümör kitlesinin mevcut tedavilere karşı duyarlı olmakla birlikte, TIC dayanıklı ve standart metodları ile tespit edilemez bir yoğunlukta olduğu düşünülmektedir. Terapi direnci ve tümör nüks açıklık mekanizmaları yanıtı ve yumurtalık kanseri olan hastalarda genel sağkalım oranlarını artırmak için hayati öneme sahiptir. Burada, kültür teknikleri inci açıklanmıştırkurulan ve primer over kanseri hücre hatları tikler için zenginleştirmek. Burada tarif edilen kültür koşulları kök hücre nitelikleri 11,12,14,16,20 tik veya küremsi hücrelerinin çoğalmasını uyarmak için birden fazla grup ile kullanılmıştır. Yaygın Tikler zenginleştirilmesi için kullanılan birçok kök hücre kültürü ortamlarının ve ek olmasına rağmen / sferoidler biz EGF ve FGF ile bir serumsuz ortam formül kullanılır, ancak B27 ya da N-2 ek eklenmeden. Yaygın nöronal hücre kültürü ve kök hücreleri için zenginleştirici için kullanılan bu takviyeleri, bir mezenkimal fenotip 25,26 teşvik gösterilen ve bir mezenkimal veya epitel fenotipe sahip TIC daha tümörijenik olup olmadığı konusunda bazı belirsizlik kalır edilmiş 27-29 . Belirsizlikleri ve değişkenleri en aza indirmek için biz epitel yumurtalık kanseri hücreleri ile ilgileniyor çünkü, en yaygın formülü kullanmak için seçti. Düşük bağlanma şişede serumsuz ortam içinde hücrelerin bakımıküremsi oluşumunu kolaylaştıran ve CD133 ekspresyon ve yüksek ALDH aktivitesinin hücrelerin yayılmasını destekler. Çalışmalarımız ayrıca normal yapışık şartlar altında yüzen hücreler de daha tümörijenik TIC nüfusu temsil edebilir olduğunu gösterdi. Atimik çıplak farelere, bu koşullarda çoğalan hücreler tarafından enjeksiyon serumu varlığında bağlı koşullarda yetiştirilen hücreler ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir tümörijenik potansiyeline yol açar. Yumurtalık kanseri başlaması, ilerlemesi, terapötik yanıt ve hastalık nüks içinde tikler rolü ile ilgili çok fazla bilgi bu tekniklerin kullanımı yoluyla elde edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1066">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:308px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:104px;">83.1813.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Aldefluor Kit</td>
			<td style="width:191px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:104px;">1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">CD133-APC</td>
			<td style="width:191px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td style="width:104px;">130-090-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F0291</td>
			<td>Prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Epidermal Growth Factor - human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E9644</td>
			<td>Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">1X Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium)</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:104px;">10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td style="width:191px;">Gemini</td>
			<td style="width:104px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron)</td>
			<td style="width:191px;">Nalgene</td>
			<td style="width:104px;">450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube</td>
			<td style="width:191px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro enrichment of ovarian cancer tumor-initiating cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

TIC kültür koşullarında yetiştirilen aynı hücreler TIC toplumlarda ortak sfero morfolojisi, yüzen görüntüleyebilen ise, yumurtalık kanseri hücre hatları ve bağlı serum gösterisi, arnavut kaldırımlı morfolojisi varlığında geleneksel yapışık kültür koşullarında yetiştirilen birincil asit hücre hattı kurdu. Şekil 1 A görüntülenen aydınlık görüntüler açıkça kültür koşullarında morfolojik farklılıklar göstermektedir. Şekil 1B geleneksel yapışık koşullarında ACI-23 ve TGS-3 EFT kültürleri şarjı sonra elde farklılaştırılmış morfolojileri gösterir. Tipik yapışık hücreleri benzeyen, sadece 24 saat yapışık koşullarda geri tohumlama sonra, çok hücreli parçacıklarının büyük çoğunluğu ayrıştırmak ve yüzeye takmak. Analiz over tikler iki ortak belirteçleri kullanılarak gerçekleştirildi sitometri TIC koşullar akış kök hücre belirteçleri ile hücreler için zenginleştirmek olduğunu doğrulamak için - CD133 expression, ve ALDH aktivitesi. Şekil 2&#39;de gösterilen nokta araziler düşük bağlanma, serumsuz koşullarda CD133 + hücrelerinin artan oranda dikkat çekmektedir. Benzer şekilde, ALDH enzimin aktivitesi, geleneksel yapışkan kültür koşullarına göre, bu koşullar altında daha yüksektir. Geleneksel yapışık kültürler CD133 + hücreleri, sfero oluşumunu geliştirmek koşullar altında yüzde artar içermesine rağmen. Bir pluripotency işaretleyici analizi, TRA-1-60, EFT koşullar tikler, Şekil 2 B için zenginleştirmek olduğunu ileri destek vermektedir. Şekil 2 C Niceliklendirilmesi çift pozitif (CD133 + ALDH +) ACI-23 hücreleri büyük ölçüde TIC arttırıcı koşullar altında yetiştirilen kültürler sınırlı olduğunu göstermektedir. TIC koşullarda kültür içinde beş gün sonra, ACI-23 hücrelerinde cereyan eden farklı transkripsiyon faktörleri, protein düzeylerindeki değişiklikler incelenmiştir. Işaretleyici her bir progresif artışs yapışık kültüründe görülen nispeten düşük seviyelerde, Şekil 2 D kıyasla TIC koşulları şamandıraya geleneksel görülmektedir. İlginç çeşitli koşullarda yetiştirilen bir insan asit hücre çizgisi şamandıra TIC koşullarda hiçbir boyama mevcut, Şekil 2 E az geleneksel TIC koşullarında en yüksek işaretleyici fenotip görüntüler. TIC kültür koşulları tümör gelişimini atimik çıplak farelerin kohortlarda her koşulda elde edilen canlı hücrelerin eşit sayıda subkütan enjeksiyonlar yoluyla doğrulanmıştır. 3 gösteren Şekil ki ACI-23 (A, B) ve OVCAR-5 (C) hücreleri ile ilgili geleneksel yapışkan kültürler TIC kültürlerden daha az tümör oluşturucu edildi. Şamandıra TIC kültürler geleneksel yapışık veya geleneksel TIC kültürlerin daha zaman kısa bir süre içinde büyük tümörler ürettiği unutmayın. Bunlar data bile yumurtalık TIC belirteçleri mütevazı bir artış, dramatik bir fenotipik değişiklik olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, diğer hücre hatları (gösterilmemiştir) geleneksel bir EFT kültürleri, geleneksel yapışkan ve bir şamandıra TIC kültür hücreleri daha tümörijenik idi. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52446/52446fig1highres.jpg" /> Farklı kültür koşulları Şekil 1. Sferoid gelişme. (A) kurulan yumurtalık kanseri hücre hatları (ACI-23, OVCAR-5 ve CAOV3) ve serum içermeyen düşük bağlanma şişelerinde büyütülmüştür primer bir hastada elde edilen asit hücreleri (TGS-3) kök hücre ortamı hali hazırda çok-hücreli küreler oluşturur. Görüntüler TIC koşullarda 96 saat içinde sferoitleri oluşan aynı hücreler ise, geleneksel yapışık kültür koşulları ACI-23 epitel arnavut morfolojisi korumak OVCAR-5, CAOV3 ve TGS-3 hücreleri göstermektedir. Ölçek çubuğu 100 um. 24 saat maruz kaldıktan sonra (B)Geleneksel yapışık kültür koşullarına, TIC kültür morfolojisi, orijinal yapışık morfoloji benzeyen bir farklılaşmış fenotip görüntüler. Ölçek çubuğu 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52446/52446fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Düşük bağlanma, serumsuz koşullar EFT işaretleri ile hücreleri zenginleştirmek. (A), CD133 antikoru konjüge APC ile ACI-23 hücre analizi Akış sitometrisi serumsuz kök düşük bağlanma şişelerinde CD133 + hücrelerinin, artan bir yüzdesini gösterir Hücre ortamı. Aldefluor deney gösterir kullanarak akış sitometri analizine serumsuz kök hücre ortamı düşük bağlanma şişelerinde kültürlenmiş hücrelerde ALDH aktivitesini arttırdı. CD133 negatif kontrol hiçbir antikor ve ALDH negatif con içeriyorkumanda ALDH inhibitörü (DEAB) mevcudiyetinde aktif alt-tabaka olup. FITC konjuge TRA-1-60 antikoru kullanılarak (B) Analiz ACI-23 hücrelerinde şamandıra TIC koşullarda TRA-1-60 + hücrelerinin en yüksek yüzdesini göstermektedir. Negatif kontrol, hiç antikor içerir. (C) CD133 + ALDH + hücreleri, geleneksel TIC en yüksek ve ACI-23 hücre hattında TİC koşulları Şamandıra. Hata çubukları: ± SEM, N = 6, * p &lt;0.05. (D), Western blot analizi, 5 gün boyunca EFT koşullarında kültürlenmiş ACI-23 hücrelerinde kök hücrelerin transkripsiyonel belirteçleri protein seviyelerinde artış gösteren. Tüm hücre lisatları, (50 ug), bir yükleme kontrolü olarak GAPDH ile analiz edildi. (E) A gibi analiz TGS-3 ilköğretim asit hücrelerinin Temsilcisi nokta araziler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3. Düşük bağlanma, serumsuz koşullar artan tümöre neden olan hücreleri zenginleştirmek. (A), 5 x 10 5 canlı ACI-23 hücreleri, deri altından üç kopya halinde atimik çıplak farelere enjekte edilmiştir. Fareler tartılmış ve haftada iki kez tümörler çap pergeli ile ölçülür. A = Geleneksel yapışık kültür, F = Floater TIC kültürü, S = Geleneksel TIC kültürü. * P &lt;0.05. (B), farklı kültür koşullarında yetiştirilen hücreler kullanılarak, 25 gün sonra, ACI-23 den oluşturulmuş tümörlerin Örnek görüntüler. (C) 5 x 10 5 canlı OVCAR-5 hücreleri deri üçlü olarak atimik çıplak farelere enjekte ve A gibi izlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells at JoVE.com

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Yumurtalık Kanseri Tümör başlatan Hücrelerinin in vitro Zenginleşmeden içinde

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

in-vitro-enrichment-of-ovarian-cancer-tumor-initiating-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

13.7K Görüntüleme.  National Cancer Institute. Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Video: In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Bir In Vitro</emMetastatik Büyüme Tümör Dormansi ve Switch Eğitim> Sistem

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Tıp

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In vitro Mezotelyal Gümrükleme Assay o Yumurtalık Kanseri Metastaz Erken Adımlar modeller

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Üç boyutlu heterotipik<em&gt; In Vitro</emYumurtalık Kanseri Başlatma ve İlerleme sırasında Stromal-Epitel Etkileşimleri&gt; Modelleme

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to direct the motion of microparticles in a surface marker-independent manner. Traditionally, DEP devices include planar metallic electrodes patterned in the sample channel. This approach can be expensive and requires a specialized cleanroom environment. Recently, a contact-free approach called contactless dielectrophoresis (cDEP) has been developed. This method utilizes the classic principle of DEP while avoiding direct contact between electrodes and sample by patterning fluidic electrodes and a sample channel from a single polydimethylsiloxane (PDMS) substrate, and has application as a rapid microfluidic strategy designed to sort and enrich microparticles. Unique to this method is that the electric field is generated via fluidic electrode channels containing a highly conductive fluid, which are separated from the sample channel by a thin insulating barrier. Because metal electrodes do not directly contact the sample, electrolysis, electrode delamination, and sample contamination are avoided. Additionally, this enables an inexpensive and simple fabrication process.
cDEP is thus well-suited for manipulating sensitive biological particles. The dielectrophoretic force acting upon the particles depends not only upon spatial gradients of the electric field generated by customizable design of the device geometry, but the intrinsic biophysical properties of the cell. As such, cDEP is a label-free technique that avoids depending upon surface-expressed molecular biomarkers that may be variably expressed within a population, while still allowing characterization, enrichment, and sorting of bioparticles.
Here, we demonstrate the basics of fabrication and experimentation using cDEP. We explain the simple preparation of a cDEP chip using soft lithography techniques. We discuss the experimental procedure for characterizing crossover frequency of a particle or cell, the frequency at which the dielectrophoretic force is zero. Finally, we demonstrate the use of this technique for sorting a mixture of ovarian cancer cells and fluorescing microspheres (beads).

Contactless dielectrophoresis (cDEP) achieves sorting and enrichment of particles via their intrinsic dielectric properties. Fluidic electrode channels replace metallic electrodes traditional to DEP, suiting cDEP to non-damaging sterile characterization and sorting of biological particles. We demonstrate how to prepare a cDEP microdevice and conduct cell characterization and sorting experiments.

Temassız dielektroforez sayesinde etiket ücretsiz İzolasyon ve Hücreler zenginleştirilmesi

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Katı Örneklerinin From İlköğretim Yumurtalık Kanseri Hücreleri alma için yöntem

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

İnsan Hücre Lines Kemorezistans Yumurtalık Kanser Kök Hücreleri Zenginleştirme

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Vivo ve Ex Vivo Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar içinde

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Methods Article

Yumurtalık Kanseri Tümör başlatan Hücrelerinin in vitro Zenginleşmeden içinde