Biz kurbağa yetiştiriciliği ve embriyo hazırlanmasına yardımcı için yaptığı yardım için Radek Sindelka ve Cas Bresilla teşekkür ederim. Bu çalışma HLS Laura Jacox için hibe R01DE021109 yoluyla NIH tarafından finanse edildi Harvard Üniversitesi&#39;nde Herschel Smith Yüksek Lisans Bursu ve F30 bireysel burs hibe F30DE022989-01 NIDCR aracılığıyla tarafından finanse edildi.

1.. Hazırlanması Reaktifler <ol><li> 10x MBS: Barth Salin (MBS) solüsyonu 17 Modifiye 10x 1 L hazırlayın. Tablo 1, Kimyasalları, malzemeler ve talimatlarına bakın. Tüm çözümler için distile su kullanın. Tam çözünme gerçekleşene kadar, bir karıştırma çubuğu kullanılarak, bir cam kapta karıştırılır. Bütün çözeltiler, oda sıcaklığında yapılmalıdır. </li><li> 1x MBS: 1x MBS 1 L için damıtılmış su içinde 900 ml 10x MBS çözeltisi 100 ml seyreltin. 1 M CaCl2 çözeltisi 0.7 ml ilave edilir. </li><li> 0.1x MBS: İnceltilmiş 1x MBS 0.5x MBS çözeltisi 1 L ve 0.1x MBS çözeltisi 2 L hazırlamak. 0.1x MBS çözelti 1 L için, 10 mg / ml gentamisin solüsyonun 1 ml. Gentamisin ile 0.1x MBS çözelti, uzun süreli embriyo kültürü için kullanılacaktır. </li><li> Ficoll / MBS: 0.5x MBS çözeltisi 500 ml Ficoll 400 15 gram ekleyin. Kuvvetlice karıştırın. Bir karıştırma çubuğu ilave edin ve tam olarak Ficoll (birkaç saat) eriyene kadar karıştırılır. </li><li> % 70 etanol:% 70 etanol kullanılarak% 100 etanol ile seyreltilirdistile su. </li></ol> 2. Cam Çalışma Araçlar hazırlanması <ol><li> İğne hazırlama: Bir iğne çektirmenin yükleyin kılcal boru. <ol><li> İğne çektirmesi ayarları: Tablo 2&#39;de gösterilen ayarlara göre iğne çekin. Özel reaktifler ve ekipman Tablo açıklandığı gibi ayarları bir Sutter Instrument Co Model P-80/PC mikropipet çektirmesi ve kılcal borulama için vardır. Ancak, bu ayarlar Sutter iğne çektirmenin özgüdür ve diğer makineler için ayarlanması gerekir. Makinenin üretici tarafından belirtildiği gibi ayarlar, bir rampa testi kullanılarak belirlenebilir. </li><li> Prosedür için hazırlık 4-6 iğneler çekin. İğneler, tipik olarak 2-3 mm uzunluğunda olan, cam ucunun esnek, saç benzeri kısım tamamen çıkarılır şekilde kesilmesi gerekmektedir. Ucu, nispeten sert, ancak bir kesme aracı olarak kullanılmak üzere hala yeterince dar olmalıdır. Şekil 1A ideal iğne fotoğrafa bakın. </li&gt; <li> Merkezine doğru bir kil şeritli bir Petri kabındaki iğneler saklayın. , Kil içine her iğne mili basın yerde tutmak ve uzak alt ve yanlardan kırılgan keskin ucunu tutmak için. </li></ol></li><li> Ek araçlar için, uzun standart desen forseps, bir Bunsen beki, ve 3-4 cam Pasteur pipetler (Boyut 5 ¾) bir çift cam kapak fişleri edinin. </li><li> Pipet aracı: Bir pipet aracı yapmak için, Bunsen beki ışık ve ucu erir ve delik tamamen mühürler, kapalı, yuvarlak ucunu oluşturan, öyle ki, onu dönerken alev mavi parçası haline bir cam Pasteur pipet ucu yerleştirin . Yuvarlak, kapalı uç, daha sonra işlem sırasında embriyolar tutan kil çanak depresyonlar yapmak için kullanılır. Şekil 1B bakınız. </li><li> Cam köprüler:, cam köprüler yapmak dikkatlice kapak kayma cam 3 mm parçalar 3 mm kopmak uzun standart desen forseps kullanın. T kapak kayma parçasını tutarkenDört kenarlar aşağıya yumuşatmak ve eğri kadar weezers, küçük bir cam kubbe oluşturan, alev içinde cam yerleştirin. Kenarları artık keskin olmalıdır. Şekil 1C bakın. </li><li> Onları takarak cam kapak kayma köprüleri depolamak, bir Petri kabı alt astar, modelleme kil, aşağı kenarları. Köprünün üst toprak yüzeyi üzerinde kalacak şekilde köprüler yerleştirin. Çıkarmak zor olabilir, çünkü köprü sonları ve tamamen kil köprü embed yok bu çok zor gibi itmeyin. Bir alev veya% 70 etanol ile Sterilizasyon sonrasında, köprüler deneme deney tekrar edilebilir. </li></ol> 3. Embriyo Operasyon için hazırlık <ol><li> Modelleme kil ile küçük 60 mm plastik Petri hattı. Kullanımlar arasında, bulaşık ve kil yüzey damıtılmış su ile iyice yıkandı ve daha sonra% 70 etanol ile edilmektedir. NOT: kullan, kırmızı, beyaz ya da sarı, yerel bir satın alınabilir Van Aken Plastalina kil modelleme,y ya da sanat mağaza. Bir bültenleri kalıntısı nedeniyle siyah kil tavsiye edilmez. </li><li> % 3 Ficoll 0.5x MBS çözeltisi ile çanak doldurun. Daha yüksek tuz konsantrasyonu, doku ayrışmayı önler, ve polisakarit Ficoll pozisyonda yüz tutan yardımcı çözelti, kalınlaştırmak için yardımcı olur. </li><li> Bir sahne 20 embriyo vücudunun derinliği hakkında, kil sığ, 2-3 mm depresyonlar yapmak için yakılmış Pasteur pipet aracını (bkz. Şekil 1) kullanın. Çanak her iki tarafında, yanı sıra 20-30 depresyon, 1-2 mm olun, yani 40-60 çöküntü toplam vardır. Forseps ile kilin içine harfleri oyarak, bir tarafı LOF / GOF, ve diğer yan yabani tip etiketleyin. </li></ol> 4. Hastaların ameliyattan Embriyo Hazırlık <ol><li> Elde ve kültür Ksenopus standart yöntemler kullanılarak 17 embriyolar laevis&#39;den. Kurbağa yetiştiriciliği ayrıntılı bir açıklaması için, Sive vd. 17&#39;ye bakınız lütfen <ol><li> Önce deneme obta için kırk sekiz saatdişi kurbağa yumurta ve in vitro fertilizasyon gerçekleştirin. </li><li> Bir hücre aşamasında veya 2 hücreli aşamada 2 hücrelerine 0,5-1 başlıklı membran GFP mRNA&#39;nın ng, ayrıca istenen herhangi bir mRNA veya anti-sens morfolino-tadil edilmiş antisens oligonükleotidler (&quot;morpholinos&quot;) enjekte edilir. Bir hücre aşamasında, yaklaşık 70-90 dakika sürer. 1-3 nl bir toplam hacim enjekte edilir. (Örneğin GFP veya RFP RNA gibi) bir flüoresan protein için RNA kodlama bölgesinin yerine, bir FITC etiketli morfolino veya floresan ile etiketlenmiş dekstran enjekte edebilir. Floresan doku nakli iyileşir ve baş kalır olup olmadığını belirlemek için çok önemlidir. </li><li> Kapaklı bir mRNA mMessage mMachine SP6 ya da T7 kiti kullanılarak bir doğrusallaştırılmış plasmid hazırlanabilir. Morpholinos tasarlanmış ve Gen Araçlar LLC aracılığıyla sipariş edilebilir. Arzu edilen etki için gerekli morfolino miktarı, her gen için 18 tespit edilmelidir. </li><li> Bu aşamaya gelene kadar, 19-20, 48 saat boyunca 15 ° C &#39;de enjekte edilen embriyolar saklayın. (Fya da sonraki tüm adımlar, sahne embriyolar Nieuwkoop ve Faber 19 Xenopus Laevis&#39;den olan Normal tabloya göre.) NOT: Ameliyat gününde, her ikisi de bir alıcı ve verici embriyolar nakli en iyi şekilde çalışması için, diğer bir aşamada içinde olmalıdır. Bununla birlikte, morpholinos (&quot;morphants&quot;), enjekte edilmiş embriyolar, bazen daha yavaş yabani tür daha geliştirmek veya kontrol morphant embriyolar, bu morphant ve yabani tip embriyolar her ikisi de aynı aşamada gerekli deneyler koordine etmek adrestir. Morphants önce edilen prosedüre, 12-24 saat boyunca daha yüksek bir sıcaklıkta muhafaza edilmesi gerekebilir. Embriyolar eşleşen aşamalarında bulunabilir olasılığını arttırmak için, embriyolar çeşitli sıcaklıklarda muhafaza edilebilir. Deneyden önceki yirmi dört saat, bir 15-18 ° C&#39;de 18-20 ° C ve yabani tip embriyoların bir kaç yemekler, yer ve morphants içine embriyolar bölmek gerekir </li></ol></li><li> Transplantasyon deney, REM gününde15&#39;ten ° C inkübatör embriyolar ove ve Nieuwkoop ve Faber 19 göre onları sahneye. Onlar geç neurula (evre 19) daha genç iseler aşamasına 19 gelinceye kadar, 1-2 saat oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Bir flüoresan mikroskop altında enjekte edilen embriyolar Screen. Deney için üniforma, parlak floresan göstermek embriyolar seçin. </li><li> Çalışma alanının yakınında yığılmayı ve olası kirleri çıkarmak. % 70 etanol ile çalışma yüzeyi, Stereomikroskopta ve tüm araçlar aşağı silin. </li><li> Embriyolar aşamada 19 indiğinizde, bir stereo mikroskop altında # 5/45 Dumont forseps kullanarak vitellin membran kaldırmak. <ol><li> Donör ve alıcı embriyoların her birinin 20-30 vitellin membran çıkarın. </li><li> İlk birkaç yüz nakli deneyleri için, tek bir, her durum için bir kaç embriyo ile uygulama gerekir. Yöntem, zor ve hızlı ve başarılı bir şekilde, daha büyük bir ölçekte kullanılabilecek önce dikkatli bir uygulama gerektirir. Bir u çalışabilir/ deneme 20 nakli yapıyor p. </li></ol></li><li> Bir plastik kullanarak işletim çanak içine host embriyolar hareket açıklığı bir embriyo (en azından birkaç milimetre) daha geniş olacak şekilde kesilmiş ucu ile transfer pipet mezun oldu. Embriyolar yüzey gerilim patlayacak gibi, kabarcıklar veya su yüzeyine embriyolar dokunmamak için dikkatli olun. </li><li> Kil embriyonun posterior, kil çöküntü içine embriyolar eklemek için # 5/45 forseps kullanın. Yavaşça depresyon çıkıntılı, embriyonun üst çeyrek, kafa bırakarak forseps kullanılarak embriyonun bazlar etrafında kil kapatın. </li><li> Tüm ana embriyoların çöküntüler içinde sabitlendikten sonra, plakanın diğer tarafına taşımak ve girintiler içine verici embriyolar eklemek başlar. Kendi kuyularda embriyolar güvence işlemi tekrarlayın. </li></ol> 5. Yüz Nakli Cerrahisi Sahne <ol><li> Bıçak Kesme: kaldırılması için bir kesme bıçağı olarakdonör EAD doku, uygun bir şekilde kırık cam kılcal iğne (adım 2.3 ve bkz. Şekil 1) kullanın. NOT: Bir doğrudan parmakları arasında kılcal (bu küçük elleri olan insanlar için iyi çalışır) ya da bir bir böcek pim tutucu iğne monte edebilirsiniz tutabilir. Bir iğne tutucu içine yüklenen Electrosharpened tungsten iğneler 17 yerine bir kılcal tüp iğnenin kullanılabilmektedir. Belirli Reaktifler ve Ekipmanları Tablo önerilen pin sahipleri ve tungsten iğneler bakın. </li><li> Bir stereomikroskop altında, çimento bezinin solundaki embriyonun kafası içine iğne takın. Bu kafa ile, embriyo dışından geçer ve ön bağırsağa böylece iğne, derin olarak yerleştirilen olmalıdır. Tüm EAD nakli için, kesik foregut için embriyonun dışarıdan uzanmalıdır. Ektoderm sadece nakli için, kesikler sığ olmalı ve sadece ektoderm boyunca uzanır. <ol><li> Sağ tarafına soldan iğne Flickçimento bezinin tüm genişliği boyunca, baş. Hareket temiz bir kesim verir gibi vuruşunu önemlidir. Kesim bir gösteri için teknik ve Şekil 2B bir özeti için Şekil 2A bakın. Çimento bezi ve gözleri kesimler için önemli yerler vardır. Kesim sırası sonucu etkilemez ve kullanıcının tercihine veya ellilik bağlı olarak değişebilir. </li></ol></li><li> Çimento bezinin sol sınırında, bir önceki kesme başında iğne yerleştirin ve sol gözün alt ulaşana kadar yukarıya doğru iğneyi fiske. Bu, sol gözün alt çimento bezinin sol sınır dikey parçasını oluşturur. </li><li> Çimento bezinin sağ sınırında iğne yerleştirin ve sağ gözün alt ulaşana kadar yukarıya doğru iğneyi fiske. Bu, sağ göz altına çimento bezinin sağ sınır dikey parçasını oluşturur. </li><li> Tam olarak doku, Flic tüketim içindoku serbest bir yatay kesim oluşturarak, sağ göz alt sol gözün tabanından iğne k. Keser EAD eksplant olarak ektoderm ve endoderm dahil olmak üzere, foregut için embriyonun dışarıdan uzanabilir. Alternatif olarak, sığ kesik ektoderm okunur EAD nakli için de kullanılabilir. EAD doku çıkarıldığında, çimento bezinden uzanan, ön bağırsağa embriyonun dışarıdan dikdörtgen bir delik olmalıdır için sadece bir gözde (yukarıdan aşağıya) altında. Delik sağ göz (yan yana) iç sınırına sol gözünün iç sınırına kadar uzanmalıdır. Şekil 2BB bakın. </li><li> Nazikçe iğnenin ucunda kesilmiş doku itin ve host embriyolar içeren çanak kısmına tampon aracılığıyla kaldırın. Yüzey havaya doku maruz bırakmayın ya da hasar görecektir. </li><li> Donör için olduğu gibi, ev sahibi embriyo aynı doku tüketim. Konak EAD eksplant atın veya yerleştirilmek kaydedinkarşılıklı nakli için, donör yüzüne t. </li><li> # 5/45 forseps kullanılarak elde edilen konak deliğe donör eksplant yerleştirin. </li><li> Donör doku doğru yerleştirildiğinden ve tam olarak takıldığında, dikkatle yerine nakli tutmak için embriyonun yüzünde (Şekil 1 ve Şekil 2BC bakınız) bir cam köprü yerleştirin. Köprünün uçları yerde tutarak, kil içine girmelisiniz. Köprü hafifçe nakli o kafası dışarı yapışmasını veya derin başının içinde yatan olmadan, ev sahibi kafası ile aynı hizada olacak şekilde nakledilen doku, basınç uygulamak gerekir. Baş hafifçe kapak kayma tarafından basık, ama çok fazla baskı ile embriyonun zarar vermemek için dikkatli olmak olabilir. Nakli 5 dakika içinde yapılmalıdır. NOT: Deneyimli bir araştırmacı, 2-3 saat boyunca, deney başına yaklaşık yirmi nakli gerçekleştirebilmektedir. Bu dönemde embriyolar aşamada 20-22 ilerleme olacaktır. Yüz nakli Tamamlanıyoraşamada 21 veya 22 s at sonuçlarını etkilemez. (Aşamalarında 22-26 at) sonradan nakli yapılan ancak kret-serbest EAD orta hat bölge yüzüne kranial nöral krest hamle olarak daralmış gibi daha zor olabilir. Nakilleri genelinde tutarlılık önemlidir. </li></ol> 6. Yüz Nakli Sonrası operasyon Kurtarma <ol><li> Şifa genellikle 2-3 saat sürer. Cam köprü yerinde tutan verici doku ile kil çöküntüler içinde rahatsız oda sıcaklığında embriyolar bırakın. </li><li> Nakli iyileşmiş sonra, dikkatli, cam köprüleri kaldırmak forseps kullanarak embriyoların tabanı etrafında kil çıkarın ve bir plastik nazikçe depresyonların dışında embriyoların vakum transfer pipet mezun kullanın. </li><li> Yarım gentamisin temiz 0.1x MBS ile dolu etiketli uygun bir Petri kabı içine embriyolar koydu. </li><li> Bu w, aşama aşama 40 larva besleme gelene kadar, birkaç gün boyunca 15 ° C ya da 18 ° C &#39;de embriyolar büyümektavuk yüz fenotipleri attı olabilir. <ol><li> Gentamisin 0.1x MBS Çözelti günlük değiştirilmesi gerektiğini ve herhangi bir ölü embriyolar diğer embriyoları kirlenmesini ve ölümü önlemek için derhal kaldırılmalıdır. </li><li> Ağız aşamada 40 açılır. Aşamada 40-41 anda, biri nakledilen doku flüoresanını görüntüleyerek yerinde iyileşmiş kalmasını kontrol etmelisiniz. Nakilleri bazen düşebilir, bu yüzden bir bütün attı embriyolar yerine donör doku emin olmalısınız. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Syndromes of the head and neck. , (1990).</li><li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Craniofacial+birth+defects:+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention.">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis.">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positioning+the+extreme+anterior+in+Xenopus:+cement+gland,+primary+mouth+and+anterior+pituitary.">Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary.</a> Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+antagonists+Frzb-1+and+Crescent+locally+regulate+basement+membrane+dissolution+in+the+developing+primary+mouth.">The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth.</a> Dev. 136, 1071-1081 (2009).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental Biology. , (2010).</li><li>Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus.">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).</li><li>Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoiogenetic+neural+inducing+activity+of+the+presumptive+neural+plate+of+Xenopus+laevis.">Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).</li><li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus+ectoderm:+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer.">Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).</li><li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeogenetic+neural+induction+in+Xenopus.">Homeogenetic neural induction in Xenopus.</a> Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).</li><li>Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triple+origin+of+skull+in+higher+vertebrates:+a+study+in+quail-chick+chimeras.">The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras.</a> Dev. 117, 409-429 (1993).</li><li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+:+I.">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I.</a> Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).</li><li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+II.+The+prosencephalic+neural+plate+and+neural+folds:+Implications+for+the+genesis+of+cephalic+human+congenital+abnormalities.">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities.</a> Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).</li><li>Lievre, A. L., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+development+of+cranial+sensory+ganglia+and+the+potentialities+of+their+component+cells+studied+in+quail-chick+chimeras.">The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras.</a> Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).</li><li>Kennedy, A., Dickinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis:+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes.">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).</li><li>Trainor, P., Tam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+paraxial+mesoderm+and+neural+crest+of+the+mouse+embryo-+codistribution+in+the+craniofacial+mesenchyme+but+distinct+segregation+in+the+branchial+arches.">Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches.</a> Dev. 121, 2569-2582 (1995).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. , (2000).</li><li>Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpholino+injection+in+Xenopus.">Morpholino injection in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kritik Adımlar ve Sınırlamalar: EAD yüz nakli işlem süresi ve yoğun çalışır. Bu mükemmel uygulama, sürekli elleri ve maharet gerektirir. Yüz nakli protokol verimli kaldırmak ve nakli doku için araştırmacının becerisine dayanır. Bir konağın yüzüne nakli eklemek için çok uzun sürerse, konak yüz sözleşme ve iyileştirmeye başlayacak. Forseps ince yüz bölgesini genişletmek için kullanılabilir. Önemli yara daralma oluştu Ancak, nakli de iyileşme olmaz ve konağın yüz deliğe s...

Kraniyofasiyal gelişimi sırasında doğumsal kusurları 1-2, önemli dokuları ve onların sinyal katkılarını altında yatan mekanizmaları anlamak için tespit edilmelidir. Kurbağa Xenopus laevis, ektoderm ve endoderm doğrudan 3-4 yan yana olan &quot;Extreme Anterior Domain&quot; (EAD), gelen ağız ve burun delikleri formu dahil olmak üzere yüzün bir parçası olarak. EAD ayrıca çene ve diğer yüz bölgelerini oluşturan 5 kranial nöral, dahil çevredeki dokuları etkilemek için bir sinyal merkezi olarak görür. Doku gelen konak bölgeyi çıkardıktan sonra, bir ev sahibi embriyo bir donörden nakledilen nerede EAD işlevine katkıda genleri tanımlamak için, bir &#39;yüz nakli&#39; tekniği geliştirildi. Nakilden sonra, yüz gelişme elde değerlendirilir. Böylece, fonksiyon kaybı (LOF) ya da EAD belirli bir genin fonksiyonu (GOF) kazancı etkisi, yerel olarak incelendiğinde burada h geri kalanıead ve vücut vahşi tip dokusu oluşur. Vahşi tip dokuya özgü gen, küresel LOFveya GOF olan embriyoların içine nakledilen olduğu karşılıklı nakli, gerçekleştirilebilir. Transplantasyon sık Xenopus&#39;ta kullanılan ve civciv 6 inceler. Örneğin, Ksenopus nakli homogenetic nöral indüksiyon, lens ve nöral yetkinlik ve nöral krest göç 7-10 ele almıştır. Bıldırcın-civciv kimerik aşılama anterior nöral plaka, anterior nöral sırt, nöral ve kafatası kemikleri 11-14 gelişimini analiz etti. Bu Xenopus kraniofasiyal geliştirme çalışması için ilk nakil tekniktir. Bu teknik olası ağız 5 bazal membran oluşumunu düzenleyen Wnt önleyicileri Frzb1 ve Crescent için yeni bir rolü olduğunu göstermiştir. Xenopus laevis kraniofasiyal geliştirme çalışması için ideal bir model embriyo büyük olarak, harici bir geliştirmend yüz sağlayan, kolayca görülebilir mikromanipülasyon ve gelişim görüntüleme. Yüz gelişimini yatan mekanizmalar kurbağa yapılan bulgular, insan gelişiminin 4,15-16 içgörü sağlamak olduğunu belirten, korunmuş görünür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="559">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Pasteur pipette</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">14672-400</td>
			<td style="width:128px;">Lime Glass&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Size 5 3/4&#8217;&#8217;</td>
			<td style="width:128px;">Cotton Plugged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;">Disposable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:195px;">Graduated Transfer Pipette</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">16001-180</td>
			<td style="width:128px;">Disposable&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Polyethylene</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:195px;">#5/45 forceps</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools by Dupont medical</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">11251-35</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">Angled 45 degrees</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="81" rowspan="3" style="height:81px;width:195px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">11000-20</td>
			<td style="width:128px;">Straight; serrated tip</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Stainless Steel;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">20cm long</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Capillary Tubing (for needles)</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">FHC</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">30-30-1</td>
			<td style="width:128px;">Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">100mm each</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Cover slip&#160;</td>
			<td rowspan="4" style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">48393 252&#160;</td>
			<td style="width:128px;">24x60mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">micro cover glass</td>
			<td style="width:136px;">or&#160;</td>
			<td style="width:128px;">or&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">(for glass bridges)</td>
			<td style="width:136px;">48393 230</td>
			<td style="width:128px;">24x40mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">No.1.5</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F9378</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Needle Puller&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">Needle Puller: discontinued Filament: FB300B</td>
			<td rowspan="3" style="width:128px;">The most similar, currently available&#160; needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:195px;">Model P-80</td>
			<td style="width:101px;">Flaming / Brown micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">(discontinued)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Stereomicroscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zeiss Stemi 1000</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:195px;">Stereomicroscope Lighting by Fostec</td>
			<td style="width:101px;">Fostec</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;">Use a light box with 2 fiberoptic arms.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">26018-17</td>
			<td style="width:128px;">Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Length: 17cm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="101" rowspan="3" style="height:101px;width:195px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">26016-12</td>
			<td style="width:128px;">Jaw opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Length: 12cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:195px;">Tungsten Needles</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">10130-05</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">0.125mm Rod diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Van Aken Plastalina</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Blick&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">#33268-2981</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Modeling Clay- white, red or yellow</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">mMessage mMashine SP6 or T7 Kit</td>
			<td style="width:101px;">Ambion</td>
			<td style="width:136px;">AM1340</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facial transplants in xenopus laevis embryos

Doğumsal kusurları 1 700 her canlı doğumda bir görülür, ancak etyolojisi nadiren nedeniyle kraniofasiyal gelişme sınırlı anlayış bilinmektedir. Sinyal yolları ve dokular gelişen yüzün desenleme sırasında hareket nerede olduğunu belirlemek için, bir &#39;yüz nakli&#39; tekniği kurbağa Xenopus laevis embriyoların geliştirilmiştir. Olası yüz kağıt ürün (&quot;Extreme Ön Alan&quot; (EAD)) ihtiva eden bir bölge tailbud aşamada bir verici embriyo kaldırılır ve eşdeğer bölgesi kaldırıldı ki aynı aşaması bir dizi embriyo, transplante edilir. Bu, bir ana bilgisayar veya donor dokusu, bir gende bir kayıp ya da fonksiyon kazancı ve / veya bir soy etiket içeren bir kimerik bir yüz oluşturmak için de kullanılabilir. Yüz bölgesi kolayca büyük ve gibi şifa sonra, gelişme sonuç izlenen ve vericiden veya çevredeki konak dokularının içindeki sinyal yolunun rollerini işaret edilir. Ksenopus, yüz gelişimi için değerli bir model birmikromanipülasyon için ccessible. Geliştirme hızla meydana geldiği çoğu embriyolar, kısa bir süre boyunca, tahlil edilebilir. Kraniofasial süreçler Xenopus ve memeliler arasında korunmuş görünen bu yana kurbağa bulguları, insan gelişimi ile ilgili bulunmaktadır.

Şekil 2BC gösterildiği gibi nakledilen doku tamamen, Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, nakil sonrası ana kafa içine sokulur ve uygun bir embriyonun yüzüne yerleştirilen bir cam köprü sahip olmalıdır. Nakli başarılı olmak için nakledilen donör dokusu düzgün, ev sahibi açılması için ölçekli gerekir. Şekil 3B ve 3C&#39;de görüldüğü gibi, EAD doku, herhangi bir şekilde, baş kısmından itibaren çıkıntı olmamalıdır....

Watch this Scientific Journal Video about Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Xenopus arasında yüz doku &quot;Extreme Anterior Etki&quot; nakli için bir tekniktir embriyolar geliştirilmiştir laevis&#39;den. Doku kraniofasial gelişimi için ve yüz bölgeleri arasındaki etkileşimleri sinyalizasyon için yerel gereksinimleri çalışma izin, başka içine bir gen ekspresyon kökenli taşınmış olabilir.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

facial-transplants-in-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

10.1K Görüntüleme.  Harvard University.  Xenopus arasında yüz doku "Extreme Anterior Etki" nakli için bir tekniktir embriyolar geliştirilmiştir laevis'den. Doku kraniofasial gelişimi için ve yüz bölgeleri arasındaki etkileşimleri sinyalizasyon için yerel gereksinimleri çalışma izin, başka içine bir gen ekspresyon kökenli taşınmış olabilir. 

Video: Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Organizatör ve Hayvan Kutbu eksplantlar Xenopus laevis Embriyolar ve Hücre Yapışma Testi Meclisi diseksiyonu

Biyoloji

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastik gömülmesi ve Xenopus laevis Embriyolar Kesit

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Xenopus laevis Dişiler Yumurta Alınması

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Diseksiyonu<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Sinir Crest için<em&gt; In vitro</em&gt; Eksplantasyon Kültür veya<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantasyon

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Içinde Mikrotubul Dynamics Tedbir plusTipTracker Yazılım Kullanma<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Büyüme Konileri

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Methods Article

Yüz Nakli