This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.

NOT: Aşağıdaki prosedürler Hayvan Bakımı Kanada Konseyi tarafından onaylanan esaslara uygun olarak vardır. Tüm çabalar işlemler sırasında ağrı ve hayvanların sıkıntı en aza indirmek için yapılır. Filtre 1. Kaplama Not: Kültür filtre malzemeleri, çok-delikli plakalara yerleştirilir zaman, iki bölme tanımlanmaktadır: En iyi bölme elemanının üzerine bölgedir ve alt bölme, ekin Şekil 1A.ab aşağıdaki biridir. Eksplantlar bunlar filtrenin üst tarafına takmak üst bölmesine tohumlanır; Birçok aksonlar filtreden büyümesi ve alt bölme Şekil 1A.c içinde, filtrenin alt tarafında uzanır. (Örneğin kaplama çözeltisi, yıkama, kültür ortamı, vb uygulanması için) standart çalışma hacimleri alt bölme boyunca 2 ml ve üst bölmesi için 1 ml ve &quot;olarak protokolde de ifade olacak, Standart hacimleri &quot;. Eklemek ve kuyunun tarafı arasındaki boşluğa pipet ucu yerleştirerek alt bölme ile başlayarak çözüm ekleyin. Filtrenin alt sıkışmış olması kabarcıklarını önlemek için bir çözüm dağıtım yapılırken, bir tarafa ekleme yatırın. <ol><li> Filtreleri kaplama bir gün önce kaplanması başlayın. Steril doku kültürü kaputu altında, 6-çukurlu bir plaka içerisinde alan 24 mm filtre ekler yerleştirin. Alt bölmesine 2 mi ve üst 1 ml: Standart miktarlar kullanılarak oda sıcaklığında 1 saat için su içinde poli-D-lisin (1 mg / ml) ile inkübe ekler. </li><li> Aspire poli-D-lisin ve su ile bir kere yıkayın. Aspire su, kapağını kapatın ve kaput O / N kurumaya plakaları bırakın Sıvıların aspirasyon sırasında, doğrudan filtre altında hapsolur sıvı kalıntısı kaldırmak için emin olun. </li><li> Ertesi sabah, suda laminin (10 ug / ml) seyreltin ve sıcak karışım 37 ° C&#39;de Cel 1 saat laminin ile uçlar inkübestandart birimleri kullanarak 37 ° C&#39;de l inkübatör. </li><li> Aspire laminin ve su içinde kolajen (0.1 mg / ml) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. Bu durumda, üst bölmesinin alt bölmesi için 2 ml ve 2 ml kullanın. </li><li> Aspire kollajen ve steril su ile bir kez yıkanır. ADIM 3 &#39;de tarif edildiği gibi filtre, hemen kültür ortamı ve DRG eksplantlar almaya hazırdır. </li></ol> 2.. Diseksiyon Embriyonik Dorsal kök ganglion (DRG) Eksplantlarındaki <ol><li> Avertin (250 mg / kg) bir IP enjeksiyonu ile 13 günlük bir hamile bir dişi fare anestezisi. 10-15 dk bekleyin ve kornea ve pedal çekme reflekslerinin olmaması için kontrol edin. Refleksleri bir kez servikal çıkık gerçekleştirin. </li><li> % 70 etanol ile tüm cerrahi aletler ve kadın karın dezenfekte edin. Araçlar kurumasını bekleyin. Karın cildi tutun ve karın boşluğuna maruz deri ve kas tabakaları kesti. </li><li> Serviks ve yumurtalıklardan ayırarak rahim kaldırmak. Bir Steri içindele kaput, makas ile rahim embriyolar kaldırmak ve buz-soğuk L15 medya ile dolu bir Petri kabındaki onları toplamak. Buz üzerinde tutmak. NOT: Gebeliğin 17,18 13 gün embriyo elde etme ile ilgili daha fazla ayrıntı için önceki teknik raporlara bakın. </li><li> Mikroskop altında, bir tarafta embriyo yatıyordu ve baş kaldırmak için küçük yaylı makas kullanın. Yan kenarları boyunca bir kesi göğüs, karın, bacak ve kuyruk atmak için emin olun. Tüm visseral organlar kadar ventral yan yattı ve kaldırmak omurgayı içeren geri tutun. </li><li> Küçük yaylı makas ile, orta hat boyunca ventral tarafında omurga keserek tüm omurilik maruz. Forseps bir çift (# 3) ile karkas basılı tutun ve onun en rostral yönü ile omurilik tutmak için ikinci bir çift kullanın. </li><li> Yavaş yavaş ve nazikçe vertebra boşluğundan kablosunu çekin ve ultra-ince forseps (# 5) kullanılarak omurilikten DRG&#39;ler çimdik. Grup DRG&#39;ler üzerinde toplanacakyemeğin alt. </li><li> Onun açılış büyütmek için kesilmiş bir 200 ul pipet ile aspire göre gruplandırılmış DRG&#39;ler toplayın. Bir tüp içinde DRG&#39;ler yerleştirin ve DRG toplama bitene kadar buz üzerinde bırakın. NOT: DRG&#39;ler bu uç duvarlarına sopa yok, çünkü (standart sarı ipuçları kıyasla) Beyaz / saydam ipuçları tercih edilir. Medya ile Flushing ipuçları kullanmadan önce daha da duvarlara yapışmasını DRG&#39;ler engeller. </li></ol> Filtreler 3. Tohum ve sırt kök ganglion Eksplantlarından Bakım <ol><li> Standart birimleri kullanarak kaplanmış ekler için 37 ° C de tam DRG ortam ekleyin. NGF içermeyen üst bölmesi tutarken, NGF&#39;nin 15 ng / ml &#39;si ile alt bölme ortamı Ek. Not: NGF etkili bir filtre boyunca yayılır ve konsantrasyonu saat içinde dengeye da, doğrudan tohumlama yapılmadan önce alt bölüme NGF uygulanması önemli ölçüde b aksonal verimini artırır gözledikFiltrenin ottom yüzeyi. </li><li> Açıklığını büyütmek için kesilmiş bir ucu ile bir 1000 ul pipet kullanarak filtrelere tüpten DRG&#39;ler aktarın. </li><li> DRG&#39;ler toplama önce uç 2-3x içine medya çizin. Bu, ucun iç tarafına yapışmasını engeller. Aynı ucu, tüm kuyuları için yeniden kullanılabilir. (Standart mavi ipuçları karşı) renksiz ipuçları kullanımı ucu yüzeye DRG yapışmasını azaltır. </li><li> , DRG&#39;ler aktarmak 800 ul pipet ayarlamak için. Aspire filtrenin üst tarafında medya yaklaşık 200 ul, sonra DRG içeren tüp gidin ve yukarı ve aşağı küçük bir hacim pipet - dibine battı DRG&#39;ler tekrar süspansiyon. Bütün hacmi ve ucun ortasında ucu daldırarak pipet DRG&#39;ler aspire. </li><li> Bir kez tüm uçlar yüklenir, plaka kapağını kapatın ve plakayı 10x girdap, her girdap arasındaki kaput bankta hafifçe dokunarak. Bu hareketler yardım ederek akson verimi artırmak DRG eksplantlarında lavabo vefiltreye takın. Bu aynı zamanda farklı eksplantlardan aksonlar üst üste kalmamak eşit explant&#39;larını dağıtmak yardımcı olur. NOT: Bir önceki adımlarda açıklandığı eksplant tohumlama prosedür belirgin olarak alt-tabaka (% 75&#39;e kadar) için eksplant eklenme genel hızını artırır. En önemlisi, pipetleme prosedür kolayca ortam yüzeyinde yüzen yerine ucun altına batmakta eksplantlar engeller. </li><li> Biyokimyasal analizler için, filtre başına (30 civarında) bir embriyo tohum DRG&#39;ler. Morfolojik analizler için, yarım veya bir embriyo (10-15) DRG&#39;ler üçüncü birini kullanın. Bir borunun tüm DRG (30, 15, ya da 10 DRG olup olmadığı), tek bir kuyunun içine ekilir, böylece bu karar, tüpler içine DRG&#39;ler toplama önce yapılmalıdır. </li><li> Her 2-3 günde bir ortam değiştirme, 37 ° C&#39;de bir hücre kuluçka makinesi içinde kültürleri koruyun. Ortamı değiştirmek ilk üst bölmesini aspire, alt bölmesi izledi. Standart hacimde taze ortam eklemealt bölme ile başlayan s. Not: kurutma hücre / aksonlar önlemek için, aynı anda birden fazla 3 uçlar ortamı değişmez. NGF varlığında filtreleri üzerinde yetiştirilen DRG&#39;ler kültür içinde 2 gün sonra 2 mm&#39;ye kadar ulaşan, uzun aksonlar uzanacaktır. </li></ol> 4. Trophic Faktörü Çekilme Tedavi NGF çekilmesi bu ilk çekilmesinden sonra yaklaşık 12 saat belirir (IF faz kontrast ve β-III-tubulin tarafından belirlenir) aksonal parçalanma ile aksonal dejenerasyon neden olur. Tam parçalanma 36 saat ile elde edilir. Dejenerasyon deney tasarımına göre, son kullanıcı tarafından seçilecek olan ilerlemeye bırakılır ne kadar. <ol><li> 2 günlük aksonal genişleme safhasından sonra, NGF yoksun ve herhangi bir geri kalan (ya da endojen olarak üretilen) NGF&#39;ye ayırmak için anti-NGF antikoru (1 ug / ml) içeren ortam için, üst ve alt bölmeleri ortam değiştirin. </li><li> Izin vermek için hücre kuluçka makinesi (37 ° C) plakaları Dönüşİstenen zaman miktarı için devam etmek için NGF çekilmesi kaynaklı dejenerasyon. </li><li> Western blot ile muayene için protein ekstraksiyon (6. adım) devam etmek veya doğrudan IF (adım 7) tarafından filtreleri incelemek. </li></ol> 5.. Aksonal Kesisi Wallerian Hastalığı tetikleyebilecek Bu prosedür, hücre gövdesinden ayrılmış filtrenin alt tarafındaki aksonlar bırakır, ama aksi halde sağlam. Bundan sonra, bu aksonlar hızla Wallerian dejenerasyon başlatmak. İlk kesilerinden sonra 3 saat olarak görünen (IF faz kontrast veya β-III-tubulin kanıtladığı) aksonal parçalanma; 9 saat ile, aksonlar tamamen parçalanmış ve filtre ayrılır. Dejenerasyon deney tasarımına göre, son kullanıcı tarafından seçilecek olan ilerlemeye bırakılır ne kadar. <ol><li> Bir hücre kazıyıcı ile, DRG yetiştirilen eksplantlar ihtiva eden filtrenin üst kısmı kazıyın. X-, Y-ve dairesel olarak hareket eden kazıyıcı göre en malzemesinin tamamen çıkarılmasını sağlamaktarifi. </li><li> Filtreden kazınır ve NGF (10 ng / ml) ihtiva eden önceden ısıtılmış tam DRG eden 1 ml&#39;lik ortam ile değiştirin olan yüzen eksplantları ihtiva eden üst bölmesinden ortamı atın. </li><li> Wallerian dejenerasyon, son kullanıcı tarafından seçilen bir zaman miktarı için devam etmesi için kuluçka makinesi (37 ° C) hücre plaka geri dönün. </li><li> Western blot ile muayene için protein ekstraksiyon (6. adım) devam etmek veya doğrudan IF (adım 7) tarafından filtreleri incelemek. </li></ol> Aksonal 6 Numunelerin. Protein Ekstraksiyonu <ol><li> Laemmli numune tamponu 75 ul ile toplama tüpleri (1.5 mi) doldurun. Filtrelerin tüm set aksonları hasat sırasında buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> PBS içinde DRG eksplant ile uygulanan filtre yıkayın ve filtrenin üst tarafını kazıyın. , Plakadan elemanını çıkartın bir pamuk uçlu aplikatör ile filtrenin üst kısmı temizlenir ve üst ve alt tarafı herhangi bir ek PBS aspire. </li><li> Insert ters yerleştirinbankta aşağı ve keskin bir neşter kullanılarak ucun dışarı filtre kesti. Forseps, aşağıdan yukarıya ile filtre tutun. Makas ile filtrenin merkezine çevresi bir kesim yapın. </li><li> Toplama tüpünün üstüne koyun filtre ve forseps ile, tüp aşağı filtrenin ortasına basın. Bunu yaparken, bir huni oluşturmalıdır. Bu Laemmli numune tamponu içinde kalmasını, böylece tüpün altına huni şekilli filtre itin. </li><li> 4 dakika için kaynatma ile tüpler tam protein ekstraksiyonu. Tüpün üst içine baş aşağı yerleştirin forseps kullanarak ve kısa bir spin (15 saniye için 2,000 xg) sahne filtreyi kaldırmak. Kurutulmuş filtreler atın. </li><li> Ilgi konusu proteinleri tespit etmek için western blot ardından SDS-PAGE ile protein aksonal preparasyon 10 ul giderin. NOT: Bir referans olarak, 2 gün boyunca büyütüldü ve RIPA 100 ul içinde lize 20 eksplantlar bir akson hazırlama tamponu 4-6 &#39;lik bir protein konsantrasyonuna sahip olacaktır lizisug / ul. </li></ol> Filtreler Aksonlar 7. İmmünofloresan Sınavı Aşağıdaki adımlar, β-III-tübülin tespiti ile örneklenen filtre ekler ilgili boyama IF gerçekleştirmek için genel manipülasyonlar özetlemektedir. Sabitleme, inkübasyon süresi, konsantrasyon ve diğer ayrıntılar diğer antijen-antikor çifti için optimize edilmelidir. <ol><li> Insertlerin aşağıdaki yıkama ve inkubasyon için iyice temizlendi, daha önce kullanılmış, 6 oyuklu plakalar, kullanmaktadır. </li><li> Kısaca, PBS içinde ekler yıkayın. Karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde taze hazırlanmış% 4 paraformaldehid içinde tespit edin. </li><li> Tespit edildikten sonra, kazıma ve filtrenin alt yüzeyine sadece büyümüş aksonlar toplamak için ucun üst tarafını temizleyin. IF standart inkubasyon ile devam edin. </li><li> Hafif sallama ile oda sıcaklığında 1 saat için, standart miktarlar kullanılarak, (TBS,% 0.05 Tween 20,% 5 kaymağı alınmış süt) bloke etme çözeltisi olarak ekler inkübe edin. </li><li> Transfer standardı birimleri kullanılarak, tampon (anti-β-III-tubulin, 1:5,000) engelleme seyreltilmiş birincil antikora ekler. Nazik çalkalama ile 4 ° C&#39;de O / N-(~ 18 saat) inkübe edin. </li><li> PBS (oda sıcaklığında 2 X 10 dakika) içinde iki kez ilk antikoru yıkanır. </li><li> Transfer standardı birimleri kullanılarak, (1:2,000 keçi anti-fare) blokaj tamponunda seyreltilmiş floresan-konjuge sekonder antikor ile ekler. Hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 2 saat boyunca ışıktan kapalı inkübe edin. </li><li> PBS (oda sıcaklığında 3 x 10 dakika) &#39;de ikincil antikor 3 kez yıkayın. </li><li> IF tamamlandıktan sonra, dışarı eklemek çıkarmak son yıkama PBS uzak dökün ve bir pamuk uçlu aplikatör ile filtrenin üst tarafını temizlemek. Üst ve alt taraftan sıvı aspire. </li><li> Yeri bankta baş aşağı yerleştirin ve keskin neşter ile ekin dışarı filtre kesti. </li><li> , Forseps ile filtre tutun yukarı olumsuz ve mikroskopi slayt üzerine yerleştirin. Bir lamel ve floresan uyumlu mou ile Yerleşiminting ortamı. Işıktan kaplı soğuk odada kuru düz, olsun. Incelemek ve bir floresan mikroskop kullanılarak görüntü yakalayabilir. Not: 4 ° C&#39;de saklanan ve ışıktan korunan, bu preparatlar floresans kaybıyla hafta içinde tutulabilir. </li><li> İSTEĞE BAĞLI: Seçenek olarak ise, IF insertin kaldırılmış filtreler üzerinde gerçekleştirilebilir. Bunu yapmak için, kazıma ve doğrudan tespit sonrası filtrelerin üst tarafını temizlemek. <ol><li> Bir altı plaka altındaki keskin bir neşter ve yer filtreleri akson-up ile uçlar dışarı filtreler alın. </li><li> 7,4-7,8 ve 7,11 belirtildiği gibi Daha sonra, IF için inkübasyonlar gerçekleştirin. Bu alternatifin avantajı, örneğin, kuluçka hacimleri (7,1-7,11 gösterildiği gibi filtreler doğrudan ekler üzerinde lekeli kullanılan 3 ml kıyasla) 500 ul aşağı gidebilir, çünkü, reaktifleri kaydeder olmasıdır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).</li><li>Rasband, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axon+initial+segment+and+the+maintenance+of+neuronal+polarity.">The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).</li><li>Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration+as+a+therapeutic+target+in+the+CNS.">Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS.</a> Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).</li><li>Torre, E. R., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+local+protein+synthesis+within+dendrites+using+a+new+cell+culture+system+that+permits+the+isolation+of+living+axons+and+dendrites+from+their+cell+bodies.">Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies.</a> J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).</li><li>Zheng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+role+for+intra-axonal+protein+synthesis+during+axonal+regeneration+from+adult+sensory+neurons.">A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).</li><li>Willis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+transport+and+local+translation+of+cytoskeletal,+injury-response,+and+neurodegeneration+protein+mRNAs+in+axons.">Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons.</a> J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).</li><li>Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+process-localized+mRNAs+from+cultured+rodent+hippocampal+neurons.">Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).</li><li>Schoenmann, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration+is+regulated+by+the+apoptotic+machinery+or+a+NAD+-sensitive+pathway+in+insects+and+mammals.">Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals.</a> J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).</li><li>Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XIAP+regulates+caspase+activity+in+degenerating+axons.">XIAP regulates caspase activity in degenerating axons.</a> Cell Rep. 4, 751-763 (2013).</li><li>Ure, D. R., Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures.">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li><li>Minis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+transcriptomics-Dissection+of+the+mRNA+composition+in+the+axonal+compartment+of+sensory+neurons.">Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons.</a> Dev. Neurobiol. , (2013).</li><li>Niekerk, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+in+axons+triggers+retrograde+transport+of+the+RNA-binding+protein+La.">Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins:+roles+in+neuronal+development+and+function.">Neurotrophins: roles in neuronal development and function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).</li><li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow.">Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog,+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres.">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .</li><li>Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+Plating,+and+Maintenance+of+Dorsal+Root+Ganglion+Neurons+for+Monoculture+and+for+Coculture+with+Dorsal+Horn+Neurons.">Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li><li>Leach, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+primary+motor+and+sensory+neurons+in+defined+media+on+electrospun+poly-L-lactide+nanofiber+scaffolds.">The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthetic+pathways+delays+axonal+degeneration+after+axotomy.">Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy.</a> J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu teknik uyarlama dikkate almak için önemli parametreler, incelenecek olan nöron popülasyonu, alt-tabakanın, filtrenin gözenek boyutu ve yüzey alanı bulunmaktadır. Tüm bu parametreler elde edilen nörit hazırlama özgüllüğü, kalite ve miktar etki edecek, ve son kullanıcı tarafından dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Bu protokolde yer alan örneklerde, DRG nöronlarının kullanımı, böylece, saf (özel) aksonal hazırlama vermek için sadece aksonlar uzanan avantajına sahiptir. <p class=...

Nöronların aksonal bölmesi somato-dendritik bölmesinden fonksiyonel bağımsızlık büyük derecesini gösterir. Projeksiyon nöronlarının olarak, aksonlar nöronal protein 1,2 çoğunu içerir. Son çalışmalar erken aksonal disfonksiyon nörodejeneratif hastalıklar ve nöropsikiyatrik bozuklukların 3 ortak bir özelliği olarak görünür olduğunu göstermiştir çünkü akson fizyolojisi ve fizyopatolojisi çalışma nörobilim toplumda ivme kazanmıştır. Bu normal ve patolojik koşullar altında akson-özel mekanizmaların daha iyi anlaşılması disfonksiyonu sürücü erken olaylara ışık tutacak gibi görünmektedir. Mevcut protokol biyokimyasal için uygundur ve immünositokimyasal analizleri saf aksonal büyük miktarda malzeme elde etmek için gözenekli bir membran (filtre) taşıyan kültür ekler nasıl kullanılacağı açıklanır. Filtrenin kullanılması aksonal biyoloji ilk Steward tarafından yürütülen çalışma ekler veayrıca bugünkü yapılandırmasına Twiss ve arkadaşları 5 tarafından geliştirilen meslektaşları 4. ve. Bu teknik çalışılan nöronların nüfus için karşılamak için her durumda hafif modifikasyonlarla, akson ve dentrit biyoloji farklı yönlerini grup ile mevcut anda kullanımda, yapılan tedaviler ve biyokimyasal analizler type 6-9 kullanılır. Bu protokol uygulamaları gibi çeşitli tüm alternatifleri karşılamak niyetinde değil, bir çok uygulama için uygun olan basit bir yaklaşım sağlamaz. Özellikle, burada açıklanan protokol geri ve trofik faktörlerin 9 yoksun zaman daha hızlı dejenere az aksonlarını üretilen biyokimyasal analizler için aksonal verim maksimize ve literatürde tarif aksonal dejenerasyon-diğer kaplamalar incelemek için en uygun olan bir üçlü kaplama kullanır. Bu prosedürde, nöronal hücre gövdeleri filtre wh üstünde izole edilmiş durumdaIle aksonlar gözeneklerinden geçmek ve taban yüzeyi boyunca büyür. Filtrenin alt yüzeyi üzerinde büyür (glia ve nöronal hücre gövdesi yabancı maddelerden arındırılmış) Saf akson biyokimyasal analizler için toplanabilir ya da in situ sabit ve imünositokimyasal teknikler 9 ile incelenebilir. Prosedür, arka kök gangliyon (DRG) embriyonik duyu nöronlarının kullanımına dayanır. Bu faktörün yoksun zaman hızlı bir şekilde geçmesi için dejenerasyon Embriyonik DRG&#39;ler yaygın olarak sinir büyüme faktörü (NGF) tutulan zaman, bu hücrelerden nevritlerin in vitro olarak hızlı ve sağlam bir büyüme geçmesi için aksonal biyoloji incelemek için kullanılır ve. Bu yöntem ile toplanan tüm neurites saf aksonlar, böylece de, DRG nöronları, dendrit yoksundur. Filtre uçlar aksonlarını incelemek için kullanılan diğer yöntemlere göre büyük bir avantaj oluşturmaktadır. Süreçleri olanlardan hücre soma meydana ayırt etmek için mikroskobu kullanımına dayanan çalışmalarXons sınırlı biyokimyasal bilgi sağlar. Başka bir örnek olarak, bölmeli kültür sistemleri (örneğin, 10 ya da Campenot odaları mikroakışkan cihazları 11) görüntüleme yaklaşımlara ve hücre bölmelerine ayırıcı tedavisi için yararlı olan, ancak gerekli biyokimyasal analizler için bu tekniklerin kullanımı engelleyen, aksonal malzemenin sadece küçük miktarlarda sağlamak numunenin, nispeten büyük miktarlarda. Dahası, bunların kullanımı önemli eğitim gibi özel cihazlar gerektirir ve zaman alıcı vardır. Genellikle Eksplantlardan aksonlarını izole etmek için kullanılan başka bir yaklaşım elle akson numune toplama önce (nöronal hücre gövdeleri içeren) bir eksplant merkezi kaldırmaktır. Bu akson zenginleştirilmiş preparatlar büyük miktarlarda üretmek de, bu hazırlanmasında aksonlar glia saran ve hızlı bir şekilde (en az bir deneyin bir örneği olarak) 6 kuyu art arda 20 eksplant bedenlerini çıkarılması olabilir, zaman alıcı ve fizibilite limitte. Buna karşılık olarak, burada sunulan yöntem daha sonra western blot, immünopresipitasyon 6, kuzey blot 5 kütle spektrometrisi 6, RNA saflaştırma gibi sık bütün hücre lizatları analiz etmek için kullanılan hemen hemen her türlü biyokimyasal tekniği ile analiz edilebilir ve bol saf aksonal preparatlar üretir 7,12,13, ve diğerleri. Protokol, daha da IF ile incelemeye filtrenin alt tarafına büyüyen aksonlar düzeltmek için mümkün olduğu gibi, (IF) teknikleri bağışıklık uygulanabilir. Hiçbir hücre gövdeleri son hazırlık var çünkü bu yaklaşım büyük ölçüde aksonal özgü süreçlerin analizini kolaylaştırır. Hücre gövdeleri yüksek immunofluorescent sinyal çoğu muayene ve bu akson gibi ince yapılarından kaynaklanan bir zayıf sinyal analizi çürüten bu yana bu önemli bir avantajdır. Aksonal dejenerasyon ar çalışma kültürü yöntemiyle İki uygulamalarıe tarif; gelişim budama ve yaralanma kaynaklı dejenerasyon modeli bir modeli (genel olarak Wallerian dejenerasyon anılacaktır). Gelişimsel budama modelleme in vivo duyusal nöronlar hedef türetilen NGF miktarlarda ve yeterli nörotrofık ​​destek dejenere 14 almak için başarısız olan sınırlayıcı için rekabet olduğu gerçeğine dayanmaktadır. Bu durum, in vivo olduğu gibi, vücut hücre yıkımı, ardından aksonal dejenerasyon başlatır, kültür ortamı, ikinci NGF çekilmesi ile DRG embriyonik kültürlerde taklit edilebilir. Wallerian dejenerasyona modellemek için, hücre gövdeleri ile filtrenin üst tarafı kazınarak. Fiziksel hücre gövdelerinden ayrıldı ve daha sonra, ilk olarak 1850 yılında 16 olgusunu bilgi A. Waller almıştır Wallerian dejenerasyon 15 olarak bilinen, hızlı ve stereotipik dejeneratif süreci, tabi olmak filtrenin alt tarafına büyümüştü aksonlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">CD-1 mouse, E13 timed pregnancy</td>
			<td style="width:140px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:416px;">In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353102</td>
			<td>1 &#181;m pore size, fits 6-well receiving plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Companion Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353502</td>
			<td>Receiving plates for inserts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td style="width:416px;">Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 &#176;C and thaw overnight at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureCol Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>Can be replaced by DMEM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Serum-Free Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FDU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGF (2.5S, beta subunit)</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLMCNET-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="109" rowspan="2" style="height:109px;width:297px;">Anti-NGF Antibody</td>
			<td style="width:140px;">Prepared in-house</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:416px;">As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. &#38; Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">AN-240</td>
			<td>Commercial option</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Tubulin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRG culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:297px;">Neurobasal Medium 
			2 % B27 Neurobasal Supplement 
			2 mM l-Glutamine 
			1 % Penicillin-Streptomysin 
			10 &#181;M FDU 
			15 ng/ml NGF (bottom compartment only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Laemmli Sample Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:297px;">10 % SDS 
			0.5 M DTT 
			0.5 M Tris (pH 6.8) 
			5 % Glycerol 
			0.01 % (w/v) Bromophenol blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

E13.5 farelerden alınan dorsal kök ganglion eksplantları kültür içinde 2 gün içinde 2 mm&#39;ye kadar ulaşan, filtreler üzerine çok sayıda poli-D-lisin, laminin ve kolajen (Şekil 1B, sol) ile kaplanmış bir sekans büyür. Bu alt-tabaka kombinasyonu özellikle canlı büyümesi verir; Diğer kombinasyonlar oldukça kısadır aksonlarını verim (Şekil 1B, sağ). Ayrıca, filtre üzerinde tutulan DRG&#39;ler plastik Şekil 1C yetişen DRG&#39;ler daha fazl...

Watch this Scientific Journal Video about Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters at JoVE.com

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Biyokimyasal Analiz için Duyu Nöronlar gelen üretim ve Aksonlar izolasyonu gözenekli Filtre Kullanma

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

production-isolation-axons-from-sensory-neurons-for-biochemical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Görüntüleme.  Montreal Neurological Institute, McGill University. This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration. 

Video: Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Hava-faz Electroolfactogram Kayıt Fare Koku Duyu Nöronlar analizi Yanıtları

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Nörobilim

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Morfolojik analiz Drosophila</emGenetik Mozaikler> Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Koku Duyu Nöronlar Cilia Kafesli Bileşiklerin Flash Fotoliz

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Kaldırılması<em&gt; Drosophila</emDuyu Nöronlar ve Epidermal Hücre İmmünofloresan Analizi Larvaların Fileto dan&gt; Kas Dokusu

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...