Biz bu kağıt üzerinde anlayışlı yorumlar için Alison Philbrook, Belinda Barbagallo ve Michael Francis teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen Araştırma MLL layık bir R15 ALAN ödül 1R15NS070172-01A1 tarafından desteklenmiştir.

1. Coverslip Hazırlanışı: Asit Yıkama ve pişirin <ol><li> En az 2 gün önce Diseksiyon (aşama 2) için, lamelleri hazırlamak için aşağıdaki adımları başlar. Yağlar ve tamamen temiz lamelleri kaldırmak için asit yıkama aşamasını gerçekleştirir. </li><li> Dikey lamelleri pozisyonları ve birbirlerine dokunmadan onları engelleyen porselen tutucu Yük lamelleri. 2 M hidroklorik asit (HCI) ile dolu bir cam kap içine histoloji tutucu ve lamelleri batırılır. Porselen tutucu mevcut değilse, alternatif olarak, 100 mm cam Petri kabı alt kapağı ve 2 M HCl lamelleri daldırın 20 lamelleri yatay ~ yayıldı. </li><li> Bir çeker ocak içinde külbütör tablasına (asit içinde daldırılmış lamelleri ile) cam kaba yerleştirin ve oda sıcaklığında en az 5 saat boyunca hafif sallanan sağlar. Alternatif olarak, asitle temizleme, gece boyunca aynı koşullar altında lamelleri. </li><li> Porselen tutucu yüklenen aktarılarak damıtılmış H2O (DH 2 O) ile yıkayın lamelleridH 2 O ile dolu temiz bir cam histoloji kaba 2 M HCI gelen lamelleri ile Alternatif olarak, lamelleri ile cam petri 2 M HCI süzün ve dH 2 O ile doldurun </li><li> Tekrar dH 2 O boşaltılarak ve taze dH 2 O ile cam kap dolum yıkayın 3 hızlı yıkar toplam tekrarlayın. </li><li> Rocker üzerine (lamelleri ile ve dH 2 O) cam kap dönerek uzun yıkama rejimi başlayacaktı. Oda sıcaklığında 10-30 dakika boyunca hafifçe çalkalanarak izin verme. Sonra, dH 2 O süzün ve taze dH 2 O eklemek En az on yıkama toplam tekrarlayın. Alternatif olarak, bir gecede yıkamaya devam. </li><li> 350 ° C&#39;ye ısıtılmış fırın içine yıkanmıştır lamelleri. Porselen tutucu kullanıyorsanız, dH 2 O-dolu cam kabı tutucusunu çıkarın ve sonra doğrudan fırına lamelleri ile yerleştirmeyiniz. Bir cam Petri kullanıyorsanız, dH 2 O süzün ve sobala içine lamelleri ile cam tabak yerleştirinör. </li><li> En az beş saat veya gece boyunca 350 ° C lamelleri pişirin. </li><li> Pişirme işlemi tamamlandıktan sonra, ince forseps ile porselen tutucudan lamelleri çıkarın ve steril 100 mm ebadındaki bir cam Petri kabı içine yerleştirin. Başlangıçta cam Petri kabındaki porselen tutucuya yerleştirildi değil lamelleri bırakın. </li></ol> 2. Civciv Diseksiyon ve DRG&#39;ler İzolasyonu <ol><li> Bereketli Kaldır (hafif hafif sallanarak 37-38,5 ° C&#39;de tutulan) inkübatör Beyaz Livorno civciv yumurta düzenledi. NOT: Önceki çalışmalarda DRG&#39;ler 2,8,11-13,16 izolasyonu için embriyonik gün 7-10 kullandık. </li><li> Laminar akış içinde seçilen yumurta yerleştirin. Steril çözümleri ve araçları ile laminer akış kaputu aseptik koşullarda, aşağıda listelenen tüm işlemleri yürütmek. 37 ° C su banyosunda Pre-sıcak tüm çözümleri. </li><li> Plastik 100 mm Petri kabı içine yumurta ve yer içeriğini çatlak. Başka bir 100 mm Petri kabı embriyo transferi için standart forseps kullanın. </li><li&gt; Pasteur pipet kullanarak, ıslak mendil tutmak için Petri 1x PBS ısındı ekleyin. Ince forseps ile boyun kısma embriyo başını kesmek. Başka bir temiz 100 mm petri vücudu aktarın. </li><li> Sıcak F12HS10 ekleme (Ham&#39;ın F12, 10 mM HEPES, 100 birim / ml penisilin / ml streptomisin,% 10 cenin sığır serumu, 0.1 mg) ıslak doku tutmak için Pasteur pipeti ile çanak. Sırt tarafında (Şekil 1A) üzerine embriyo konumlandırmak için forseps kullanabilir. </li><li> Laminer akış kaputu bir binoküler stereovision mikroskop üzerine embriyonik doku içeren 100 mm plastik Petri kabı yerleştirin. Kalp, akciğer ve diğer organlara maruz gelişen dermis kısma boyun kuyruk dikey bir orta hat kesi yapmak için ince forseps kullanın. Alternatif olarak, iç organların maruz küçük gözyaşı bir dizi yapmak. </li><li> Yavaşça steril ince forseps 2 set kullanın: a) boyun kavramak ve b) kuyruk doğru kalbe hemen üstün aortu veya diğer doku tutun ve çekin,hayvan iç çıkarma. </li><li> Dokuya Pasteur pipeti ile sıcak F12HS10 uygulanır. Gelişmekte kaburga, omurga kolonu ve DRG&#39;ler (Şekil 1B-1D) maruz kalan kardiyovasküler, solunum veya sindirim organları çıkarmak için forseps kullanın. </li><li> Mikroskop altında, daha kaburga alt lomber vertebral kolon, her iki tarafın birlikte DRG&#39;ler organları kaldırmak ve toplamak için ince forseps kullanabilir. Embriyodan sağlam DRG&#39;ler yolma tarafından DRG&#39;ler toplayın. Kıstırma ve omurilik doğru DRG ulaşmak ve çevre ya da tam tersi doğru DRG ulaşır gelişmekte olan sinir kavrayarak kökleri sahip olamazlar. </li><li> Sıcak F12HS10 dolu bir 35 mm kültür çanak içine bozulmamış DRG&#39;ler yerleştirin. Ince forseps ile sıkıştırarak 35 mm çanak sağlam DRG&#39;ler gelen DRG&#39;ler yapışmış olabilir dorsal veya ventral kökleri gibi, herhangi bir aşırı doku çıkarın. </li><li> Lomber bölgeye üstün DRG&#39;ler elde etmek için, torakal ve Cervi&#39;de ventral yarısında kaldırmakcal omurga. Bu, üst boyun bölgesinde omurilik ekseni ile üst bel bölgesinde bir kesim dik gelişmekte belkemiğinin bir kesim yapılarak yapılır. Sonra, kesik sağ ve vertebral kolonun sol kenarlarında omurilik eksenine paralel hale. Açığa omurilik (Şekil 1E-1F) ortaya embriyo, gelen vertebral kolonun ventral yarısını kaldırın. </li><li> DRG&#39;ler kolay erişim sağlamak için, ince forseps ile omuriliği tutarak torakal ve servikal omurilik çıkarın. Vertebral kolonun üzerinden omurilik kaldırmak için forseps kullanabilir. Bir yaklaşım olarak, göğüs omurilik yivlerin seviyesinde ve servikal alan kaburga üstündür. </li><li> Ince forseps ile sağlam göğüs ve servikal DRG&#39;ler toplayın ve diğer DRG&#39;ler sıcak F12HS10 koyun. DRG&#39;ler yapışabilir aşırı doku çıkarın. </li><li> Yardım etmek F12HS10 ile yeni bir cam Pasteur pipet içini durulayınPipet duvarlarına yapışmasını önlemek DRG&#39;ler. Bir steril 15 ml konik tüp küçük bir petri tüm DRG&#39;ler ve F12HS10 transferi ve hemen 3. adıma geçmek için durulanır pipet kullanın. NOT: Ek embriyolar DRG&#39;lerin sayısını artırmak için disseke edilebilir. DRG&#39;ler Aşama 3 için hazır olana kadar 37 ° C &#39;de F12HS10 tutulmalıdır. </li></ol> 3. Ayrılma, zenginleştirilip, ve Kültürleme DRG Nöronlar - Bölüm 1 <ol><li> Sağlam DRG&#39;ler santrifüj içine yavaşça yer ile konik tüp 2-3 dakika boyunca (200 xg) dönerler. DRG&#39;ler tüpün dibine battı onaylayın. Aksi takdirde, tekrar dönerler. </li><li> Bir pipet kullanarak, yavaşça rahatsız DRG pelet bırakarak F12HS10 çıkarın. DRG&#39;lerin pelet yerinden ayrılmasını, 1x kalsiyum ve magnezyum içermeyen (CMF) 2 ml PBS ilave edin. Tekrar Spin ve sağlam DRG pelet bırakarak CMF PBS kaldırmak. , Bir sonraki aşamada bir şekilde tripsin emdirme ile müdahale edecek F12HS10 fetal sığır serumu, çıkarmak için üç kez olmak üzere toplam bu yıkama işlemi tekrar edin. </li><li> 2 mi PBS ve CMF DRG&#39;ler içeren 15 ml&#39;lik bir tüpe ısıtıldı tripsin 2 ml ilave edilir. 10-15 dakika ayrışmış hücrelere DRG&#39;ler sindirmek için 37 ° C su banyosu içinde yer tüpü. </li><li> İnkübasyon sırasında, F12H + ek ihtiva eden ortam yapmak (Ham&#39;ın F12, 10 mM HEPES 100 birim / ml penisilin, 0,1 mg / ml streptomisin 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mM L-glutamin ve N2) ve sıcak 37 ° C su banyosu içinde. Tipik olarak, toplam 10 mL ortam içinde birincil duyu nöronlarının 4-5 olarak 35 mm&#39;lik kaplara için yeterlidir. Ayrıca çözülme laminin-1 kaplama lamelleri (adım 4) için başlar. </li><li> Görsel yavaşça çiğnemek P1000 pipet ile tripsin çözeltisi içinde DRG&#39;ler ve sağlam DRG&#39;ler yokluğu için inceleyin. DRG&#39;ler sağlam artık gözü ile görülebilecek kadar öğütme devam edilmesi ve / veya bozulmamış DRG&#39;ler ayrışmış kadar 37 ° C su banyosu içinde daha fazla tripsin inkübasyon için izin verir. , Hasar DRG nöronları korumak öğütüldükten sırasında hava kabarcıkları önlemek ve &lt;30 dakika tripsin sindirimi sınırlamak için. </li><li> Centrifugayrışmış DRG&#39;ler içeren ve pelet oluşturmak için 3-5 dakika boyunca 200 xg&#39;de tripsin e tüp. Pelet oluşana kadar gerekirse daha uzun Spin. </li><li> Dikkatle pelet bozmadan tripsin aspire. Topak haline F12HS10 2 ml ilave edilir. Yavaşça P1000 pipet ile DRG&#39;ler çiğnemek. </li><li> 100 mm kültür çanak içine 15 ml konik tüp tüm içeriği aktarın. 10 ml&#39;lik bir toplam için her seferinde, 2 ml 8 mi F12HS10 ile tüp durulayın ve kültür tabağına aktarın. Bu durulama aşaması, borunun duvarlarına yapışmış halde olabilir hücreleri toplamak yardımcı olur. </li><li> 100 mm kültür tabağına yerleştirin (10 mi F12HS10 ve DRG hücreleri ayrışmış), 3 saat boyunca nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör içine. NOT: HEPES CO2 yokluğunda ortam pH tamponları, çünkü CO2 inkübatör gerekli değildir. İnkübasyon sırasında, glial hücreler, glial gevşek yatağına yapışarak doku kültürü eğilimi plastik ve nöron yüzeyine bağlanır. </li></ol> 4. Kaplama Asit YıkanmışLaminin-1 ve Fırında Lameller <ol><li> Buz üzerinde donmuş laminin-1 steril hacimde çözülme. </li><li> , Steril koşullar altında, laminin-1, 50 ul steril kana 1x PBS 1 ml. </li><li> 280 nm&#39;de, laminin-1 absorbans değerini elde etmek için bir spektrofotometre kullanılır. Laminin-1 konsantrasyonunu belirlemek için, aşağıdaki denklem kullanılarak, bu değeri kullanın. </li></ol> ABS 280 (= konsantrasyonu mg / ml) * (protein yok olma katsayısı) Laminin-1 için yok olma katsayısı 0.86 olduğunu. <ol start="4"><li> , Steril koşullar altında, 1 mg / ml ve 20 mg / ml konsantrasyonları elde etmek için 1X PBS ile laminin-1 seyreltin. Laminin-1 inkübasyondan sonra 7,8,10 lamel (30 ng / cm2 ve 300 ng / cm2) bağlı bir on kat bir fark elde etmek için, laminin-1 Bu iki tatbik konsantrasyonlarını kullanarak. </li><li> Laminar akış, bir asitle yıkanmış ve pişmiş c yerleştirmek için ince forseps kullanımıBir 35 mm kültür çanak dibine overslip. Gerekli yemekleri sayısını elde etmek için gerektiği kadar tekrarlayın. </li><li> Daha da sterilizasyon sağlamak üzere 20-30 dakika süre ile, UV ışığına maruz lamelleri. Bu aşama esnasında çanak kapağı kapalı tutunuz. </li><li> Her cam lamel hazırlanan laminin-1 400 ul ekleyin. Lamel tam kapsama sağlamak için laminin-1 yaymak için pipet kullanın. Yüzey gerilimi, laminin-1 lamel kalır ve gerektiğinde, kültür kabı, bir alt üzerine yayılmaz sağlayacaktır. </li><li> Tabağa kapağı yerleştirin ve laminin-1, oda sıcaklığında 2-3 saat süreyle inkübe izin (3 saat uygunudur). </li><li> Laminin-1 inkübasyondan sonra, laminar akış başlığı içinde steril PBS ile aseptik teknik kullanılarak lamelleri yıkayın. Lamel çözüm çıkarın ve PBS 400 ul ekleyin. 5-10 dakika bekleyin. 3 durulama toplam tekrarlayın. </li><li> Son durulama sonra lamel PBS bırakın. Durulama sırasında yüzey gerilimini kırmak etmeyin ve lamelleri kurumasına izin vermeyin. Lehazır olana kadar üzerinde ave kapak coverlip üzerine nöronlar ayrışmış plakasına. </li></ol> 5. Ayrılma, zenginleştirilip, ve Kültürleme DRG Nöronlar - Bölüm 2 <ol><li> İnkübasyondan sonra, yavaşça ayrışmış DRG hücreleri ihtiva eden 100 mm tabak için alt durulama için 10 ml&#39;lik steril bir pipet kullanın. Sonra yavaşça yaklaşık 1/3 yemeğin üzerine 7 ml sınırdışı ~ pipet yardımı ile F12HS10 7 ml çekin, 45 ° açı ~ de çanak tutun. Yavaşça nöronlar yerinden oynatıp 5x tekrarlayın. </li><li> Çanak döndürün ve yemeğin başka 1/3, başka bir altı durular için, prosedürü durulama tekrarlayın. Yemeğin 1/3 kalan tekrar işlemi tekrarlayın. Bu şekilde, yavaşça çıkarmak için nöronlar F12HS10 ile çanak tüm alt yıkayın. </li><li> Aynı pipet kullanarak, 15 konik tüp 100 mm çanak F12HS10 içeren nöronlar aktarın. Hücrelerin topakçık 200 g&#39;de 5-10 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Rahatsız pelet bırakarak F12HS10 çıkarın. Isıtıldı F12H + takviyeleri 2 ml yeniden süspanse pelet. </li><li&gt; hücre yoğunluğu belirlemek için Hemasitometre kullanın. </li><li> İstenen kaplama konsantrasyonu (20 ug / ml laminin-1 ile kaplanmış 8,16 lamelleri boyunca 1 ug / ml laminin-1 ve 40.000 hücre / ml &#39;si ile kaplanmış lamelleri için 120.000 hücre / ml) elde etmek üzere F12H + takviyeleri ile, gereken hücreleri seyreltin. </li><li> Laminin kaplı lamelleri PBS çıkarın ve hemen lamelleri üzerine hücrelerinin 400 ul yerleştirin. Dikkatle nemlendirilmiş, 37 ° C hücre kültürü inkübatör çanak aktarın. Nöronlar, laminin-1 yapışmasının sağlanması için 3 saat için en az 1 saat süreyle ve en inkübe izin verin. </li><li> , Steril koşullar altında, yavaşça F12H + takviyeleri 1.6 ml nöron içeren 35 mm&#39;lik kaplara sel. NOT: Bu zamanda, bir örtücü kısım üzerine gerilim kırılabilir alanlar. Nöronlar yeterince lamel laminin-1 yapıştırılır var. </li><li> Kuluçka ve gece inkübe hücreleri dönün. Ertesi gün immünsitokimya gibi deneyler yapın. </li></ol> 6. Benmmunocytochemistry <ol><li> İmmünositokimya önce, 37 ° C su banyosunda ılık bir sabitleyici çözeltisi (% 4 paraformaldehit,% 30 sukroz 2X PBS). NOT: hücreleri sabitleme önce, böyle netrin-1, Mn 2, sonik kirpi, semaforin ve efrin 16,29-31 gibi çeşitli reaktifler ile tedavi. </li><li> Yavaş yavaş kültürü çanak F12H + takviyeleri 2 ml 1 ml&#39;sini uzaklaştırın. Yavaşça ısıtılmış sabitleştirici çözeltisi 1 ml. 10-15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe izin verin. </li><li> Dikkatle sabitleştirici çözüm kaldırmak ve 2 ml PBS ekleyin. PBS uygulaması nedeniyle sabit hücrelerin olası yerinden oynatmamaya kaçınarak, yemeğin kenarına doğru çözümü uygulayın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 5 yıkama toplam PBS yıkama tekrarlayın. Hücreler immünositokimyada Herhangi bir adım sırasında kurumasına izin vermeyin. </li><li> PBS çıkarın. Bloke etme çözeltisi, 1 ml halinde (% 0.1 Triton-X, 1X PBS,% 5 normal keçi serumu). Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. Alternatif olarak, yüzey molekülleri leke, Çözüm 8 engelleme Triton-X kullanmayın. </li><li> Üreticinin tavsiyesine göre çözümü engelleme içine primer antikorları sulandırmak. NCAM karşı antikorlar için 500 ve β1 integrinleri 16 aktif: 1 kullanın. , Bloke çözeltisini çıkarın primer antikor çözeltisi 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Primer antikor çözüm çıkarın ve 1X PBS 2 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca inkübe edin. 4 PBS yıkama toplam tekrarlayın. Gerekirse yıkar, uzatılabilir. </li><li> İkincil antikor 1 sulandırmak: 1000 çözümü engelleme. , PBS çıkarın 1 mi ikincil antikor solüsyonu ilave edildi ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. NOT: İkincil antikorlar ışığa duyarlı bulunmaktadır. Bu noktadan sonra mümkün olduğu kadar karanlıkta çözüm ve hücreleri tutun. </li><li> Sekonder antikor çözüm çıkarın ve daha önce yapıldığı gibi, 1x PBS ile 5x durulayın. </li><li> Fluoromount arasında ~ 60-80 ul uygulayınBir mikroskop lamı üzerine G. Ince forseps kullanarak, yavaşça mikroskop lamı üzerine Fluoromount G içine çanak ve alt lamel üzerinden lamel kaldırın. Hava kabarcıkları kaçının. </li><li> Mağaza karanlıkta 4 ° C&#39;de yatay olarak kayar. 12-24 saat sonra, Fluormount G polimerize edecek ve kapak sıkıca mikroskop lamı eklenir. Bu polimerizasyon basamağından sonra hücreler Resim tamamlanır. </li></ol>

<ol>
	<li>Millet, L. J., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+a+century+of+neuron+culture:+from+the+hanging+drop+to+microfluidic+devices.">Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices.</a> The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).</li><li>Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+neuron+subtypes+have+unique+substratum+preference+and+receptor+expression+before+target+innervation.">Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).</li><li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+way+to+go?+Cytoskeletal+organization+and+polarized+transport+in+neurons.">Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons.</a> Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).</li><li>Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+in+dendritic+spines.">Microtubule dynamics in dendritic spines.</a> Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).</li><li>Snow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pioneering+studies+on+the+mechanisms+of+axonal+regeneration.">Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration.</a> Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).</li><li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures:+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies.">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).</li><li>Condic, M. L., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-induced+changes+in+integrin+expression+regulate+neuronal+adhesion+and+neurite+outgrowth.">Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth.</a> Nature. 389, 852-856 (1997).</li><li>Lemons, M. L., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+integrin+activation+and+intracellular+cAMP+cause+Rho+GTPase+dependent+growth+cone+collapse+on+laminin-1.">Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1.</a> Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).</li><li>Beller, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+sensory+neuron+growth+cone+and+filopodial+responses+to+structurally+diverse+aggrecan+variants,+in+vitro.">Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro.</a> Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).</li><li>Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+neurons+adapt+to+the+inhibitory+proteoglycan+aggrecan+by+increasing+integrin+expression.">Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).</li><li>Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+sensory+neurons+to+hyalectin+and+decorin+proteoglycans.">Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).</li><li>Guan, W., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Netrin-1,+Neogenin+and+cUNC-5H3+expression+during+chick+dorsal+root+ganglia+development.">Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development.</a> Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).</li><li>Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+influences+cell+number+and+the+distribution+of+neuronal+subtypes+in+dorsal+root+ganglia.">Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia.</a> Developmental biology. 314, 317-328 (2008).</li><li>Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+has+a+dual+effect+on+the+growth+of+retinal+ganglion+axons+depending+on+its+concentration.">Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).</li><li>Kolpak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+guidance+factor-induced+macropinocytosis+in+the+growth+cone+plays+a+critical+role+in+repulsive+axon+turning.">Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).</li><li>Lemons, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+and+cAMP+mediate+netrin-induced+growth+cone+collapse.">Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse.</a> Brain research. 1537, 46-58 (2013).</li><li>Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+proteoglycan+elevates+cytoplasmic+calcium+in+DRG+neurons.">Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons.</a> Developmental biology. 166, 87-100 (1994).</li><li>Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+behavior+in+the+presence+of+soluble+chondroitin+sulfate+proteoglycan+(CSPG),+compared+to+behavior+on+CSPG+bound+to+laminin+or+fibronectin.">Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin.</a> Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).</li><li>Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfated+proteoglycans+in+astroglial+barriers+inhibit+neurite+outgrowth+in+vitro.">Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro.</a> Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).</li><li>Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+outgrowth+on+a+step+gradient+of+chondroitin+sulfate+proteoglycan+(CS-PG).">Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG).</a> Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).</li><li>Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+system-derived+chondroitin+sulfate+proteoglycans+regulate+growth+cone+morphology+and+inhibit+neurite+outgrowth:+A+light,+epifluorescence,+and+electron+microscopy+study.">Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study.</a> Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).</li><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Firnhaber, C., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+feeding+RNAi+in+C.+elegans+and+its+use+in+a+screen+for+essential+genes+required+for+GABA+neuron+function.">Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function.</a> PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).</li><li>Hollyday, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+wing+innervation.+I.+Time+course+of+innervation+and+early+differentiation+of+the+peripheral+nerve+pattern.">Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).</li><li>Hollyday, M., Morgan-Carr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+wing+innervation.+II.+Morphology+of+motor+and+sensory+axons+and+their+growth+cones+during+early+development.">Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).</li><li>Honig, M. G., Kueter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+cell+adhesion+molecules+on+the+growth+cones+of+chick+cutaneous+and+muscle+sensory+neurons.">The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons.</a> Developmental biology. 167, 563-583 (1995).</li><li>Tosney, K. W., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+major+pathways+for+neurite+outgrowth+in+the+chick+hindlimb.">Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb.</a> Developmental biology. 109, 193-214 (1985).</li><li>Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+semaphorin+3A+signaling+pathways+interact+in+regulating+sensory+neuronal+growth+cone+motility.">Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).</li><li>Munoz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-A5+inhibits+growth+of+embryonic+sensory+neurons.">Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons.</a> Developmental biology. 283, 397-408 (2005).</li><li>Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+distal+axons+is+not+required+for+growth+cone+responses+to+guidance+cues.">Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).</li><li>Condic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neuronal+regeneration+induced+by+transgenic+integrin+expression.">Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression.</a> Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).</li><li>Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+supports+the+survival+of+developing+muscle+sensory+neurons+in+culture.">Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).</li><li>Toyofuku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FARP2+triggers+signals+for+Sema3A-mediated+axonal+repulsion.">FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).</li><li>Steinmetz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+enhancement+of+the+intrinsic+growth+capacity+of+sensory+neurons+combined+with+the+degradation+of+inhibitory+proteoglycans+allows+functional+regeneration+of+sensory+axons+through+the+dorsal+root+entry+zone+in+the+mammalian+spinal+cord.">Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada izole etmek için ayrıntılı protokoller sunmak ve kültür bir civciv embriyo duyusal nöronlar ayrışmış. Bu prosedür vitro 7,8,10,16 yılında güçlü büyüyen nöronların zenginleştirilmiş bir nüfusu oluşturur. Çok sayıda hücresel ve moleküler teknikler burada açıklanan İmmünositokimya, aşağıdakileri içeren, bu kültüre edilmiş nöronlarda, uygulanabilir. Bu protokol, yakın zamanda nicel olarak duyu büyüme konilerinin 8,16 olarak imüno-akt...

Nöronlar hissi, görme, motor hareketinin, öğrenme ve bellek dahil, çeşitli işlevler için gerekli bilgiyi taşır karmaşık hücrelerdir. Diğer hücre tiplerinden Benzersiz, nöronlar iletişim için gerekli nöral otoyolları oluşturmak için, kol-gibi süreçleri olarak adlandırılan aksonlar uzatmak. Büyüyen akson ucunda bulunan kalkınma uzmanlaşmış bölümlerinde sırasında, kendine uygun hedef akson yol dışı ipuçlarının bir konser gezinmek, büyüme konileri denir. Büyüme konisinin navigasyon altında yatan karmaşık moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir. Iyi bu mekanizmaları anlamak için, araştırmacılar tanımlanmış ve basitleştirilmiş vitro ortamda nöronların çalışma hücre kültürü modelleri kullandık. Nöronal farklılaşma 2, sitoskeletal dinamikleri, endositoz ve kaçakçılığı, dendrit: kültürü 1 okuyan nöronlar da dahil olmak üzere nöronal hücre biyolojisi anlayışımızda önemli ilerlemelere yol açmıştırdüzenleme 3,4, aksonal rejenerasyon 5, ve bu nöropatiler 6 gibi klinik durumlar. Buna ek olarak, kültürlü nöronlar İmmünositokimya, hücre yüzeyi ko-bağışıklık çökelti Western blot, transfeksiyon, RNAi, ve bu büyüme konisi motilite timelapse analizi de dahil olmak üzere canlı bir görüntüleme araştırma teknikleri geniş bir yüksek ölçüde uygundurlar. Bu nedenle, birincil kültür nöronları Nöronların hücre biyolojisi çok yönlerini açıklamak için güçlü bir yaklaşım. Hücre kültürü modeli çevresel koşullar ve değişkenler üzerinde ayrıntılı kontrol ile araştırmacılar sağlar. Örneğin, kaplama nöronlar (ve buna uygun olarak büyür) edildiği katmanlarından kolayca manipüle edilebilir. Burada, iki farklı katmanlarından, düşük laminin-1 konsantrasyonu ile bir ve laminin-1 konsantrasyonları doyurarak ile diğer üretmek için ayrıntılı talimatlar sağlar. Şaşırtıcı bir şekilde, aynı molekülün farklı konsantrasyonlarda istenmeyen etkilere sahip olabilirİç nöronların durumu yanı sıra hücre yüzeyi bileşime. Örneğin, integrinler, cAMP ve yüzey düzeyleri hücre içi düzeyleri, bu iki substrat üzerine kaplanır 7,8 nöronlarında önemli ölçüde farklıdır. Daha başka çalışmalarda, fibronektin ve kondroitin sülfat proteoglikan, etki hücre yüzey moleküllerinin ifade edilmesi ve nöronal motilite 7-11 de dahil olmak üzere, bu diğer molekülleri göstermiştir. Buna ek olarak, aynı zamanda, hücre zarı bileşim ve nöronal motilite 12-16 darbe ve kolay ve hassas bir hücre kültürü modeli olarak manipüle olabilir nörotrofin ve neurotropins gibi çözünebilir moleküllerdir. Burada, biz yöntemleri izole etmek ve kültür civciv embriyoları duyusal nöronlar ayrışmış açıklar. Bu prosedür, akson büyümesinin 5,7,8,10,11,16-21 içeren nörobiyolojisinde önemli gelişmelere yapmak için kullanılmıştır ve gangliyon hücreleri 22 izole etmek için tasarlandı bir prosedürden modifiye edilmiştir. VarBu yaklaşımın birçok avantajları. İlk olarak, civciv sırt kök ganglion (DRG) gelişimi birçok özellikleri iyi doğum, akson uzantısı için zaman çerçevesi de dahil olmak üzere karakterize edilir, ve protein ifadesi böylece in vitro deneylerde bilgilendirici inşa etmek için bir öğretici temel sağlayarak, 2,23-28 profiller. İkinci olarak, nöronal kültürler araştırıcı daha doğrudan ayrışan nöronlar ve nöronal olmayan hücreler her ikisini ihtiva eden (nöronlar ve nöronal-olmayan hücreleri içeren) Bozulmamış DRG eksplantları ve / veya karışık kültürlerinin kullanıldığı alternatif yaklaşımlara kıyasla nöronların çalışma sağlar ayrışmış. Üçüncü olarak, burada açıklanan prosedür, basit, ucuz ve lisans elverişlidir. Bu nedenle, bu teknik araştırma hem de eğitim amaçlı kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol küçük varyasyonlar DRG&#39;ler dışındaki kaynaklardan nöronların hızlı, yüksek verim arınma izin vermelidir. Örneğin, bu prosedür, ENR nöronal olarak temin etmek üzere modifiye edilebilirembriyonik önbeyinde omurilik gibi diğer dokulardan iched kültürler. İmmünositokimya, bu protokoller ayrışan nöronal kültürler için optimize edilmiştir ve burada ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Nöral hücre adhezyon molekülü (NCAM) ve β1 integrinler karşı iki İmmünositokimya için prosedür sağlanır. Bu imüno yöntemlerle üretilen veriler kültüre edilmiş nöronlarda 8,16 uzaysal ve model oluşturmanın çok molekül yoğunluğunu incelemek için kullanılmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile small culture dishes (35mm)</td>
			<td style="width:176px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">430165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile large culture dishes (100mm)</td>
			<td style="width:176px;">Falcon</td>
			<td style="width:135px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile large petri dishes (100mm)</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">89000-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass petri dish (100mm)</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">D108962&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fine forceps</td>
			<td style="width:176px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">11251-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">standard forceps</td>
			<td style="width:176px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">1100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">coverslips&#160; (22x22)</td>
			<td style="width:176px;">Fisher</td>
			<td style="width:135px;">12 518 105K</td>
			<td>0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">porcelin coverslip holder</td>
			<td style="width:176px;">Thomas scientific</td>
			<td style="width:135px;">8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td>use 50ml aliquots per 500 mls of Ham&#39;s F12 media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCL</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">VW3204-1</td>
			<td>use at 2M, can be used twice before discarding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">S9888</td>
			<td>use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">laminin-1</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">23017-015</td>
			<td>Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml conical tube</td>
			<td style="width:176px;">cell treat</td>
			<td style="width:135px;">229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS CMF 10X</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">14200</td>
			<td>used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">14080</td>
			<td>used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ham&#39;s F12</td>
			<td style="width:176px;">Lonza</td>
			<td style="width:135px;">12-615F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">10438</td>
			<td>use in F12HS20 at 10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">H3375</td>
			<td>make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin streptomyocin</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P0781</td>
			<td>use 5mls in 500mls of F12 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NT3</td>
			<td style="width:176px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">GF031</td>
			<td>Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C&#160; non-defrosting freezer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td>&#160;aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,&#160; use 100ul per 10ml of F12H media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NGF</td>
			<td style="width:176px;">RnD systems</td>
			<td style="width:135px;">256-GF</td>
			<td>Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">l-glutamine</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G7513</td>
			<td>aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T4049</td>
			<td>aliquot under sterile conditions, store at -20 0C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">15260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">Other items needed:&#160; general dissection instruments, including&#160; glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37&#160; degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immunocytochemistry Reagents Table</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">S9378</td>
			<td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P6148</td>
			<td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluoromount G</td>
			<td style="width:176px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:135px;">0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:176px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">PCN500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microscope slides</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">16004-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primary Antibody Table</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibody against NCAM</td>
			<td style="width:176px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">AB5032</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Antibody against activated beta 1 ingegrin</td>
			<td style="width:176px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MAB19294</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Seconday Antibody Table</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td style="width:176px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat anti-rabbit IgG Alexa 548</td>
			<td style="width:176px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of dissociated sensory neurons from chick embryos

Nöronlar duyusunda, motor hareket, öğrenme ve bellek dahil, çeşitli işlevler için gerekli bilgiyi taşır yönlü hücrelerdir. In vivo nöronlar okuyan nedeniyle karmaşıklığı, çeşitli ve dinamik ortamlarda ve teknik sınırlamalar zor olabilir. Bu nedenlerden dolayı, in vitro olarak nöronların okuyan nöronların karmaşık sırlarını çözmek için oldukça faydalı olabilir. Hücre kültürü modelleri arasında iyi tanımlanmış bir yapısı çevre koşulları ve değişkenler üzerinde detaylı bir kontrol sağlar. Burada, izole ayırmak ve civciv embriyolardan kültürü birincil nöronların nasıl açıklar. Bu teknik, hızlı, ucuz ve sağlam duyusal nöronlar büyüyen üretir. Prosedür, tutarlı bir şekilde yüksek nöronlar için zenginleştirilmiştir kültürleri üretmektedir ve çok az nöron olmayan hücreler (% 5&#39;ten az) sahiptir. İlköğretim nöronların bu nedenle ayrıntılı prosedürler iki Distin oluşturmak için, işlenmemiş cam veya doku kültürü plastik iyi uymayanct, nöronal kaplama için iyi tanımlanmış laminin ihtiva katmanlarından açıklanmaktadır. Kültürlü nöronlar eş-immunoprecipitation, canlı hücre tahayyül, RNAİ&#39;nin ve İmmünositokimya dahil olmak üzere birden hücresel ve moleküler teknikler, son derece elverişlidir. Bu kültürlü nöronlar çift İmmünositokimya için prosedürler optimize edilmiş ve burada tarif edilmiştir.

Burada açıklanan protokol kültürü için çok az (örneğin, &lt;5%) nöronal olmayan hücrelerin 7,8,10,16 ile ayrışan embriyonik duyu nöronlarının zenginleştirilmiş bir popülasyonu araştırmacılar sağlar. Sayısız DRG&#39;ler lumbosakral, torakal ve servikal bölgelerde elde edilebilir. Araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak, bu farklı anatomik bölgelerden DRG&#39;ler kolaylıkla izole edilebilir. Örneğin, Şekil 1 Şekil 1C ve 1D ve ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos at JoVE.com

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Hücre kültürü modelleri çevre koşulları üzerinde ayrıntılı kontrol sağlar ve böylece nöronal hücre biyolojisi sayısız yönlerini aydınlatmak için güçlü bir platform sağlar. Biz civciv embriyolardan duyusal nöronlar, izole ayırmak ve kültür bir, hızlı, ucuz ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Katmanlarından hazırlanması ve immunositokimya detayları da sağlanmıştır.

Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

isolation-culture-dissociated-sensory-neurons-from-chick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K Görüntüleme.  Assumption College.  Hücre kültürü modelleri çevre koşulları üzerinde ayrıntılı kontrol sağlar ve böylece nöronal hücre biyolojisi sayısız yönlerini aydınlatmak için güçlü bir platform sağlar. Biz civciv embriyolardan duyusal nöronlar, izole ayırmak ve kültür bir, hızlı, ucuz ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Katmanlarından hazırlanması ve immunositokimya detayları da sağlanmıştır. 

Video: Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned to completely random. In addition, fibers can be spun from a variety of materials, including biodegradable polymers such as poly-L-lactic acid (PLLA). These characteristics make electrospun fibers suitable for a variety of scaffolding applications in tissue engineering. Our focus is on the use of aligned electrospun fibers for nerve regeneration. We have previously shown that aligned electrospun PLLA fibers direct the outgrowth of both primary sensory and motor neurons in vitro. We maintain that the use of a primary cell culture system is essential when evaluating biomaterials to model real neurons found in vivo as closely as possible. Here, we describe techniques used in our laboratory to electrospin fibrous scaffolds and culture dorsal root ganglia explants, as well as dissociated sensory and motor neurons, on electrospun scaffolds. However, the electrospinning and/or culture techniques presented here are easily adapted for use in other applications.

Aligned electrospun fibers direct the growth of neurons in vitro and are a potential component of nerve regeneration scaffolds. We describe a procedure for preparing electrospun fiber substrates and the serum-free culture of primary rat E15 sensory (DRG) and motor neurons. Visualization of neurons by immunocytochemistry is also included.

Kültür İlköğretim Motor ve Electrospun Poli-L-lactide Nanofiber Yapı iskeleleri Tanımlı Medya Duyu Nöronlar

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Biyokimyasal Analiz için Duyu Nöronlar gelen üretim ve Aksonlar izolasyonu gözenekli Filtre Kullanma

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Kaldırılması<em&gt; Drosophila</emDuyu Nöronlar ve Epidermal Hücre İmmünofloresan Analizi Larvaların Fileto dan&gt; Kas Dokusu

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...