Bu çalışma, bu makalenin içeriği mutlaka Sağlık Ulusal Enstitüleri resmi görüşlerini yansıtmamaktadır PHM için Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Yaşlanma Enstitüsü hibe R00AG031911 tarafından kısmen desteklenmiştir.

Medya ve Çözümleri 1. Hazırlık <ol><li> Maya özü-pepton-glikoz (YPD) standart protokol için zengin bir ortam kullanarak hücreleri büyütün. % 2 Bacto-pepton,% 1 maya özütü, YPD ortamında% 2 glükoz çözeltisi hazırlayın ve 19 katı bir ortam için% 2 Bacto-agar ekleyin. Sterilize etmek otoklavlayın. Belirli bir büyüme durumu veya mutant maya suşu test etmek için, gerekirse, alternatif bir ortamı kullanın. </li><li> Kanavanin dirençli mutantların seçmek için 60 mg / L canavanine (SC-Arg + kanavanin) arginin eksik bir katı sentetik tam orta olun. Arginin (Bırakma karışımı) amino asitleri,% 2 glikoz,% 0.2 tamamlandı ek karışımı ya% 0.67 bakto-maya azot baz,% 2 Bacto-agar 19 olan bir çözelti hazırlayın. Otoklav ve 20 mg / ml stok çözeltisinden kanavanin ilave edilmeden önce soğukta 19 (4 ° C&#39;de saklanır, filtre ile sterilize edilmiş). <ol><li> 5-fluoroorotik asit (5-FOA) içeren katı sentetik tam orta olun. 500 hazırlayınamino asitler olmadan% 1.34 bakto-maya azot baz,% 4 glükoz,% 0.4 tam ek karışımını ve% 0.2 5-FOA ve bir çözelti 19 ml filtre-sterilize edin. Otoklav daha sonra 500% 4 Bacto ağar çözeltisi ilave edildi, kısa bir süre, serin ve 500 mi filtre ile sterilize edilmiş besleyici çözelti ile karıştırın. Diğer mutasyon deneyleri için uygun alternatif medyayı kullanın. </li></ol></li><li> Biotin ile etiketlenmesinde, 500 mi 1 x fosfat, 137 mM sodyum klorid, 2.7 mM potasyum klorid, 10.14 mM sodyum fosfat dibazik, ve 1.77 mM potasyum fosfat dibazik, pH içeren tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi 8 deposu 4 ° C olmak ve devam Kullanım sırasında buz. </li><li> Steril, ultra saf su taze 5 mM biyotin stok yapmak. </li><li> , Biyotin etiketleme söndürme 1x PBS 500 mi, 100 mM glisin yapmak. 4 ° C&#39;de saklayın ve kullanım sırasında buz üzerinde tutmak. </li><li> Ikinci hücreler ve deney süresi sayısına bağlı olarak, 1 x PBS, 2 mM EDTA,% 0.5 Bovi içeren boncuk işaretleme tamponu, 1-2 L yapmayane serum albümin. Filtre sterilize ve de gaz tampon. 4 ° C&#39;de saklayın ve kullanım sırasında buz üzerinde tutmak. </li><li> Hücre canlılığı ölçümlerde kullanmak için, oda sıcaklığında bir 1x PBS içinde% 0.4 tripan mavi bir çözelti, filtre sterilize ve mağaza hazırlayın. </li><li> Bir buğday tohumu aglutinin (WGA) ile floresan konjügat alikosu küçük hacimler (~ 100 | il), hücre yaş belirlenmesinde kullanım için sarılmış folyo (ya da opak) mikrosantrifüj tüpleri içinde, -20 ° C de saklamak için. </li></ol> Mutasyon Oranı ve Sıklığı 2. belirlenmesi <ol><li> Standart kültür koşulları altında yetiştirilen hücreler için dalgalanma testleri kullanılarak hücre üretimi başına temel bir mutasyon oranını kurmak. On erken sabit fazda (~ 10 8 hücre / ml) 1000-5000 hücre / ml&#39;lik bir başlangıç ​​yoğunluğunda 1 mi kültürleri çoğaltmak için yedi büyütün. <ol><li> 2000 ve koloni oluşturucu birimler / ml belirlemek için seçici olmayan ortam (YPD) üzerine 1-4 ul Aralığı: Her suret kültürü için, hücreler 1 seyreltin. Pelet ~ 2.400 x, kalan hücreler100 ul su içinde tekrar süspansiyon ve bir mikrosantrifüj içinde 1 dakika boyunca gr mutantlann tespit edilmesi için seçici bir ortam üzerine yaymak. Kolonilerin sayılması önce 30 ° C&#39;de üç gün boyunca (hücre büyüme oranına göre gerektiğinde inkübasyon zamanı ayarlamak) için inkübe edin. </li><li> Seçici bir ortam üzerinde elde edilen mutant koloni (r) sayısına göre araştırmada ortaya çıkan bağımsız mutasyon (m) sayısını belirler. 9, aşağıdaki formülde r mutant kolonilerin ortalama sayısı ile ikame m bulmak için Lea-Coulson medyan tahminleyicisini. Denklemin sol tarafı neredeyse sıfır oluncaya kadar Sonra m değerlerini yerine. <img alt="Denklem 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51850/51850eq1.jpg" /></li><li> Mutasyon oranını belirlemek için, ilk olarak suret kültürleri ve hacminin ortalama koloni oluşturan birimler / ml çarparak seçici ortam üzerine yayıldı yaşayabilir hücrelerin ortalama sayısını hesaplamakseçici ortam üzerine yayıldı mi kültür ile aşılandı. Hücre üretimi başına mutasyon oranını elde etmek için canlı hücreler bu ortalama sayısına göre adım 2.1.2 m değeri bölün. </li></ol></li><li> Aşama 2.1.3 tarif edildiği gibi ayrı ayrı bir deneyde, her kültür için suret seçici ortam üzerine yayıldı canlı hücre sayısını hesaplayın. Mutasyon frekansı elde etmek için seçici bir ortam üzerine yayıldı canlı hücre sayısına göre bir kültür elde edilen mutant koloni (r) sayısı bölün. Bazal mutasyon frekansı olarak aşama 2.1 &#39;de replike kültürden tek tek mutasyonlan frekansların ortalama veya medyan kullanın. </li><li> Mutasyon birikimi yaşa özgü değişiklikler için test ederken ihtiyacınız olacak mutasyonların sıklığında herhangi bir değişiklik etiketleme adım sonuçları dikkate olmadığını belirlemek için biotin etiketleme hücrelerinin (3.2 ve 3.4 adımları) öncesi ve sonrası frekans ölçümlerini yapmak. </li></ol> 3. biotin ile etiketlenmesinde <ol><li> Streak S. cerevisiae YPD ortamı üzerine, -80 ° C&#39;de, bir gliserol stokundan ve 1-3 gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Steril bir pipet kullanarak, su tutma 1 ml (veya daha fazla) çizgi plaka transfer hücreleri akılda çizgisinin bir kalın yetiştirilen kısmının 1-1.5 cm yaklaşık 10 8 hücreleri verecektir. Hemasitometre kullanarak tam hücre yoğunluğu belirlemek. </li><li> Suşu (veya tedavi durumu) toplama noktası başına mutasyon sıklığı belirlenecek olan veya seçici ortam üzerinde örnekleme başına en az 5-10 mutant koloniler elde etmek için yeterli bir nüfus büyüklüğüne göre 10 8 hücreleri etiketlemek (adım 2.2 mutasyon frekansa göre). Suş / durumuna göre temel ölçümler için ek bir 10 8 hücreleri içerir. </li><li> Üreticisinden, 5 mM biotin reaktif stoğunu kullanmak ve hafifçe inkübasyon sırasında kaya dışında standart prosedüre göre biotin etiketi. Tüm santrifüj adımları 3000 x g hızında, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj s,4 ° C&#39;den yüksek sıcaklıklarda eğirme ince artan hücre kaybına yol açabilir. Son yıkamadan sonra, su içinde 10 8 etiketli hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar hücrelerin süspansiyonu. </li><li> Tripan mavi boya kullanılarak hücrelerin yaşayabilirliği kontrol edin. 23 ul su ve 1 x PBS içinde% 0.4 tripan mavisi ile 67 ul hücre 10 ul seyreltin. Hemasitometre kullanılarak canlı (boyasız) ve ölü (boyanmış) hücrelerini puanlama önce oda sıcaklığında en az 40 dakika bekletilir. </li><li> Genom istikrarsızlık, hücre yaş, ve diğer ilgili özellikleri için başlangıç ​​değerleri ölçün (bölümler 5, 6 görmek ve 7). </li><li> Bir Erlenmeyer şişesine (yaklaşık 5 x 10 6 hücre / ml) içinde 10 8 hücre başına YPD ortamında 20 ml biyotin-etiketli hücreler aktarın. 10 8 hücre / ml (4-5 hücre kuşakları) yaklaşık bir yoğunluğa kültür (ler), 20 ° C&#39;de 16-18 saat büyümeye ama Hücreler durağan aşamaya ulaşmak için izin yoktur. 30 ° C&#39;de büyüme için kısa bir kuluçkalama süresi kullanın. , Biyotin-etiketli c tutunboyunca 4 ° C&#39;de arşın ile birkaç saat önce orta ilave edilmeden önce, büyüme süresi ve toplama zamanlamasını optimize etmek için gerekli olursa. </li></ol> 4. Boncuk Etiketleme ve Manyetik Ayırma <ol><li> Büyüme aşamasından sonra, bir hemositometre kullanılarak, hücre kültürünün yoğunluğunu belirlemek için bir kısım seyreltin. 3000 x g&#39;de 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj ile pelet hücreleri. Süpernatantı dökün. </li><li> Daha sonra, boncuk işaretleme tamponu, 30 ml pelet askıya vorteks santrifüj ve 4.1 bölüm olarak süpernatant dökülerek hücreleri yıkayın. Tekrar yıkayın. </li><li> Tamamen vorteks ile 10 8 toplam hücre başına 50 ul boncuk-etiketleme tampon hücreleri tekrar süspansiyon. Karıştırmak için kısaca 10 8 toplam hücre ve vorteks başına 2 ul manyetik boncuk ekleyin. Bir online protokol modifiye (karıştırmak için periyodik tersini, 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf &lt;</a>/ A&gt;). </li><li> Boncuk etiketleme tamponu, 30 ml hücreleri üç kez yıkayın. </li><li> Hücreler yeniden süspanse sadece kadar orta ayarda 10 8 toplam hücre başına 0.5 ml boncuk-etiketleme tampon ve kısaca vorteks pelet ekleyin. Kalan hücre kümeleri kaldırmak için bir 50 ml tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden dökün. Gerekirse, önce kolonu üzerinde yükleme 1-2 saat boyunca buz üzerinde hücreleri bırakın. </li><li> Manyetik sütun, bağlanan yıkama ve manyetik boncuk etiketli ana hücrelerin elüt edilmesi için üreticinin tavsiye ettiği protokol takip edin. Işaretli hücrelerin artış elde edilmesi için, 2 x 10 9 toplam hücre başına en az bir sütun kullanılır. <ol><li> Onlar akışını engellemek gibi, sütunları yüklerken oluşabilecek kabarcıklarını çıkarın. Çıkarın ve bir online protokolü modifiye boncuklar (arasında sıkışma hücreleri önlemek için yıkamalar arasında ayırıcı üzerinde sütun yerine <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/user</a>manual031113.pdf). </li><li> Arzu edildiği takdirde, ana hücreler tarafından üretilen genç hücrelerin analiz bağlanabilen ve yıkama aşamaları arasından akar kaydedin. Adım 4.7 açıklandığı gibi hücrelerin konsantre. </li><li> Bir seferde birden fazla örnekleri işlemek için çoklu-sütun ayırıcılar kullanın. Aynı toplama tüpünün içine aynı numunenin birden çok sütun elute kullanma süresinin azaltılması ve hücre kaybını azaltmak için. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile elüt ana hücreler konsantre edilir. Aspire 1 ama tüm 10 8 orijinal biyotin-etiketli hücre başına tampon ml. Vortex kısaca tampon kalan hücreleri askıya. </li><li> Bir kısım hücreler seyreltin ve hücre yoğunluğu ve bir hemositometre kullanılarak hücre canlılığı, tripan mavisi belirlemek için boyanmayan (adım 3.5). Geri kazanılan toplam hücre sayısını hesaplayın. <ol><li> Hücrelerin sayısı beklenenden önemli ölçüde daha yüksek olması durumunda, genç hücreler kirlenmesine bertaraf edilmesini denemek için bir sütunu içinden elüsyon örnek geçmektedir.Hücrelerin sayısı beklenenden önemli ölçüde daha düşük olması halinde, ana hücrelerin verimini iyileştirmek için diğer bir kolon boyunca numune boyunca kaydedilen akış geçmektedir. </li></ol></li><li> Alternatif bölümleri 5 ve 6&#39;da tarif edildiği gibi olmadan yine kendi replikatif yaş (adım 3.7) artırmak ve boncuk etiketlenmesi ve (adım 4.1-4.8.1) sıralayarak takip YPD çorbasının hücrelerin büyümesi, daha fazla analiz için hücreleri kullanarak biyotin etiketleme tekrarlamanız gerekir. </li></ol> Replika Çağı 5. Belirlenmesi <ol><li> Bu bölümde yer alan tüm adımlar için oda sıcaklığında 5000 x g&#39;de 2 dakika boyunca hücreler dönerler. 1.5 ml santrifüj tüpüne elde edilen hücreler (~ 10 8 hücre / ml) 25 ul koyun ve PBS 1x 1 ml ile iki kez yıkayın. Süpernatant aspire. <ol><li> WGA-konjugat bir kısım çözülme, girdap mix ve protein agrega ortadan kaldırmak için kısaca dönmeye. Th yüzeyinde tomurcuk izleri etiketlemek için PBS 1x 180 ul ve bir fluoresan moleküle konjuge WGA 20 ul süspanseE hücreleri. Folyo ile 1.5 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü Kapak ve yumuşak bir 30 dakika boyunca 30 ° C&#39;de çalkalanarak inkübe edin. </li><li> 1 mi 1X PBS ile üç kez yıkayın. </li></ol></li><li> Floresan mikroskopi, etiket slaytlar ve bir anti-solmaya ajanı kullanılarak standart protokol başına monte edin. Tamamen görüntüleme sırasında hücre hareketi önlemek için coverslip sızdırmazlık önce karanlıkta (birkaç güne kadar) slaytlar tedavi. Hücre yaşı temsili bir ölçümünün elde edilmesi için, numune başına en az 50 hücrelerinde tomurcuk yara sayısı. Yukarı gerekirse, tomurcuk izleri görüntüleme için aylık 1 için Mağaza slaytlar. <ol><li> Alternatif olarak, aşama 5.1.2 sonra PBS 1x 1 ml suspensiyon halindeki hücreler üzerinde akış sitometresi gerçekleştirerek, WGA-birleşikten flüoresan sinyal yoğunluğunu belirler. WGA-Alexa 488. için 505 nm uzun geçiş filtresi ile 405 nm uyarma lazer ve 530/30 nm emisyon filtresi kullanın, her toplama noktası için bir boyanmamış denetimi ekleyin. </li></ol></li><li> Üzerinde mikroskopisiyle sayılır genç hücrelerde ve yaşlanmış hücrelerde grafikte tomurcuk izlerix-ekseni üzerinde aynı hücre popülasyonlarından WGA-konjügat floresans normalize geometrik ortalama karşı Y ekseni (geometrik ortalama lekeli / boyasız geometrik ortalama). Bu ilişki için doğrusal bir eğilim çizgisinin denklemi edinin. Takip eden deneyler için, denklemde x için bir hücre popülasyonunun WGA-konjügat floresan yoğunluğunun normalize geometrik ortalama ile değiştirin ve bir numunenin ortalama hücre yaşını belirlemek için y çözer. </li></ol> 6. Mutasyon Frekans <ol><li> Adım 2.1.1 anlatıldığı gibi yayılmış YPD orta ve seçici bir ortam üzerine adım 4,7 tampon içinde yeniden süspanse anne hücreleri sıralanır. 1 dakika boyunca 5.000 xg&#39;de seçici orta ve spin hücreleri için yeniden süspanse ana hücrelerinde 1 ml kullanın. NOT: hücreler büyük toplumlarda cansız ve yaşlanmış hücreler artan sayıda telafi etmek için yaş arttıkça YPD ortamında üzerine seyreltilmiş hücrelerin daha büyük hacimli yayıldı. <ol><li> YPD orta ve seçici orta inkübesırasıyla, 3 ve 4 gün boyunca 30 ° C &#39;de 6.1 dur. Çok eski hücreler veya yavaş büyüyen suşlar için bir hafta inkübasyon süresi bitti artırın. Adım 2.2 açıklandığı gibi mutasyon sıklığı hesaplayın. </li></ol></li></ol> 7. Verilen Replikatif Çağ için Öngörülen Mutasyon Frekansı Hesaplanması <ol><li> İlgili sıralama için kriteri ana hücrelerin ortalama yaş başlangıç ​​hücre popülasyonunun ortalama yaşı çıkarılarak deney boyunca biyotin etiketli hücrelerin replikatif yaş ortalama artışa hesaplayın. Adım 5.2 hesaplanan hücre yaşlarını kullanın ya 5.2.2 adım. </li><li> Adım 7.1 hesaplanan ortalama hücre yaş artışı adım 2.1.3 elde mutasyon oranını çarpın. İlgili Replikatif yaş hücreler için öngörülen mutasyon sıklığını belirlemek adım 2.2 hesaplanan ilk nüfus için temel mutasyon sıklığı için bu değeri ekleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Maslov, A. Y., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+instability,+cancer+and+aging.">Genome instability, cancer and aging.</a> Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).</li><li>Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+DNA+replication+and+recombination+activities+in+the+maintenance+of+genome+stability.">Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability.</a> J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).</li><li>Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+and+chronological+aging+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Cell Metab. 16, 18-31 (2012).</li><li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer.">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li><li>Madia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1/Polzeta-dependent+mechanism.">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11, 599-606 (2012).</li><li>McMurray, M. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-induced+switch+to+a+hyper-recombinational+state.">An age-induced switch to a hyper-recombinational state.</a> Science. 301, 1908-1911 (2003).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates.">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).</li><li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5&amp;#34;-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast:+5-fluoro-orotic+acid+resistance.">A positive selection for mutants lacking orotidine-5&amp;#34;-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).</li><li>Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CAN1+locus+of+Saccharomyces+cerevisiae:+fine-structure+analysis+and+forward+mutation+rates.">The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates.</a> Genetics. 91, 35-51 (1979).</li><li>Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother+enrichment+program:+a+genetic+system+for+facile+replicative+life+span+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 183, 413-422 (2009).</li><li>Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+age+induces+mitotic+recombination+in+the+ribosomal+RNA+gene+cluster+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS Genet. 7, e1002015 (2011).</li><li>Feser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+histone+expression+promotes+life+span+extension.">Elevated histone expression promotes life span extension.</a> Mol Cell. 39, 724-735 (2010).</li><li>Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+circuit+for+selectively+arresting+daughter+cells+to+create+aging+populations.">A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations.</a> Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).</li><li>Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+transcriptional+silencing+causes+sterility+in+old+mother+cells+of+S.+cerevisiae.">Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae.</a> Cell. 84, 633-642 (1996).</li><li>Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+reactive+oxygen+species+begin+early+during+replicative+aging+of+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).</li><li>Dang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+lysine+16+acetylation+regulates+cellular+lifespan.">Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan.</a> Nature. 459, 802-807 (2009).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14, 115-132 (1998).</li><li>Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposition+is+associated+with+genome+instability+during+chronological+aging.">Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).</li><li>Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+analysis+CalculatOR:+a+web+tool+for+the+determination+of+mutation+rate+using+Luria-Delbruck+fluctuation+analysis.">Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis.</a> Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+estimator+of+mutation+rates.">A robust estimator of mutation rates.</a> Mutat Res. 661, 101-109 (2009).</li><li>Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+inheritance+of+oxidatively+damaged+proteins+during+cytokinesis.">Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis.</a> Science. 299, 1751-1753 (2003).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, kaynak için birden çok yöntem ve verimli bir şekilde bir araya mitotik hücre yaşlanmada genom istikrarsızlık çalışma uygulanacak olan S. cerevisiae, Saccharomyces model sistemi kullanılabilir yaklaşımlar. Deneylerinin çok çeşitli fenotipik seçim ile genom istikrarsızlık farklı formları ölçmek için mutasyonlar ya da kromozom yeniden düzenleme biçimlerine birikimi mümkün yaşa özel değişiklikleri incelemek için manyetik sıralama ile birleştirilebilir. Bütün-genom dizileme yaklaşımlar yaş ile bir genom içinde meydana gelen değişikliklerin genel türleri hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir ederken, mutasyon hızı ölçümleri elde etmek için fenotipik seçim sistemlerini kullanmak ve tercihen genetik değişikliklerin belirli türleri izole etmek yeteneği mekanik eğitimi için önemli avantajları yaşlanma ile ilgili genom istikrarsızlık yönleri. Hücre yaş belirlenmesi ve potansiyelini düzene physiologi paralel ölçümler yapmak içinakışı ile cal değişiklikler sitometri belirli yaş aralıklarında sırasında diğer hücresel değişiklikler ile genom istikrarsızlık korelasyon etkili bir yoldur. Biriken mutasyonlar oranlarında potansiyel yaşa bağlı değişikliklerin belirlenmesi için gereken: 1) dikkatli genç hücre popülasyonlarında oranlarının belirlenmesi, hücre yaş 2) doğru belirlenmesi, ve 3) güvenilir bir şekilde ölçmek için yeniden üretilebilir ana hücrelerin yeterince büyük popülasyonlarının zenginleştirilmesi için yeteneği Yaşlılıkta genom istikrarsızlık. Bu yaklaşım, maya model sistem oranları ve / veya mitotik aktivite gösteren hücrelerde genom istikrarsızlık frekanslarında yaşa bağlı değişikliklerden sorumlu altında yatan mekanizmaların tanımlanması katkıda bulunmaya olanak sağlamaktadır. Ayrıca, genetik ve çevresel etkenler hızla yaşa bağımlı genom istikrarsızlık katkıları için değerlendirilebilir. Sonuçta, bu karakterizasyonlar mutasyonlar Replikatif yaşlanma sırasında birikir hangi şekilde hesap modellerinin gelişmesine neden olabilir. Bu yöntem, bu tür olayların oranını ölçmek için seçilebilir fenotip görünümüyle mutasyonları ya da genom istikrarsızlık diğer tür tespit etme yeteneğine bağlıdır. Ancak, deney tasarımı yaratıcılık genom istikrarsızlık birçok yönleri incelenecek izin verebilir. Örneğin, URA3 genlerinin ve CAN1 sonuçlarına genomik konumu hakkında herhangi bir etkilerini test etmek için farklı bir genomik bölgelere yerleştirilmiş olabilir. Fonksiyonel gen allelleri özgü işlevsel olmayan gen allel Reversiyon belirli mutasyon süreçleri test edebilir. Aynı zamanda, bir gen ya da tekrar sıraları ile bir gen eteklenen çoklu aktif olmayan allel giriş sırasıyla restorasyon ya da gen fonksiyon kaybı ile rekombinasyon olayları incelemek için kullanılabilir. Dalgalanma testleri bu çeşitli genom istikrarsızlık olayları 9 oranlarını belirlemek için standart yaklaşım vardır. Protokol muta belirlemek için iyi kabul ve nispeten basit Lea-Coulson medyan tahmincisi kullanılarak yazılıryon oranı MSS-maksimum olabilirlik tahmin yöntemi mutasyon oranları 9 belirlemek için en iyi yaklaşım olarak kabul edilir olsa da, farklı araştırmacılar için daha erişilebilir hale getirmek için. MSS-maksimum olabilirlik tahmincisi önce detaylı 9 gözden geçirilmiştir ve alternatif bir yöntem olarak kullanılabilir, ancak daha sofistike hesaplamalar gerektirir. Alternatif olarak, bu yöntem ile mutasyon oranlarını hesaplamak için ücretsiz yazılım 22 elde edilmiştir. Mutasyon oranları tekrarlanabilir tedbirleri alması, yeterli suret kültürleri kullanılarak yeterince düşük başlangıç ​​hücre yoğunluklarında kültürleri aşılamak dahil deneysel tasarım, birkaç yönlerine dikkat gerektirdiğini 10.000 kat veya daha fazla, ve seçilmesinin uygun kültür hacimleri ile nüfus büyüklüğü artar tüm böylece hücre popülasyonları seçici ortam üzerine yayılır. İkinci nokta için, daha önce tarif edilen formül kültür teste fraksiyonuna dayanan mutasyon oranını ayarlamak için kullanılabilend 9. Kültürlerin büyüme oranında varyasyon tekrarlanabilir bir mutasyon oranı belirlenmesi ve son zamanlarda 23 tarif edilmiştir böyle durumlarda daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar doğurabilir değiştirilmiş medyan tabanlı tahmincisi karmaşık hale getirebilir. Doğru hücre yaşı ölçmek için yeteneği eski hücrelerin genomu dengesizlik nedeniyle genç hücrelere Frekanslar olayların oranı beklenen değerlerle farklı olup olmadığı kurulması için önemli olan diğer bir faktördür. WGA farklı floresan moleküllerine konjuge kullanılabilir beri, arka plan ve esneklik açısından hem de beyaz lekeleme Kalkofluor kıyasla tercih edilir olarak WGA, lekeleme bulduk. Bu esneklik floresan reaktif ile diğer hücre özelliklerinin ölçümleri için daha fazla fırsat sağlayabilir. Ilk iş sonra daha fazla yol açabilir sinyal WGA boyama için yoğunluğu ve hücrelerin tomurcuk izleri tekabül sayısı arasında bir ilişki kurmak içinakış sitometrisi yoluyla hücre yaşı hızlı belirlenmesi. Bu yaklaşım, aynı zamanda, tipik olarak ölçümlerin daha iyi bir reprodüksiyon için mikroskopla incelenmiş göre daha büyük nüfus büyüklüklerinin kullanımına izin vermektedir. Tüm yaş tayinleri hücrelerin mikroskobik muayene ile yapılabilir olabilir iken, biz yaklaşımı sitometri akış yaşa bağlı genom istikrarsızlık etkileyen faktörlerin hızlı tarama kolaylaştırır hissediyorum. Güvenilir bir hücre yaşı ölçülmesine ek olarak, değerlendirme ana hücre büyümesi ve hücre sıralama her bir ardışık yuvarlak geçmesi için izin verilen hücre bölünmesini sayısına dikkat etmek gerekmektedir. Hücreleri istenen hücre yoğunluğu ulaşmadan önce daha fazla hücre bölünmesi geçmesi olanak sağlayan bir küçük başlangıç ​​popülasyon boyutu ya da daha büyük bir kültür hacminin kullanın. Örneğin, diğer araştırmacılar daha az experime eski hücrelerini elde bariz bir avantaja sahiptir çok eski maya hücreleri 16, elde etmek için sıralama sadece iki mermi kullanmışntal adım. Hücreler sıralama öncesinde daha fazla hücre bölünmeleri tamamlamak için izin kültür hacmini artırmak olmadığını düşünürken, aklında tek bir sütunda işlenebilir hücrelerinin toplam sayısı sınırı tutmak. Bir hücre popülasyonu sıralamak için birden çok sütun kullanılmasını gerektirebilen daha büyük bir kültür hacminin kullanın. Hücre çeşitleri / toplama noktaları arasındaki hücre bölünmesinin az mermi geçmesi Ayrıca, eğer, daha sonra ömrü boyunca farklı zaman noktalarında beklenen mutasyon frekansları sapmaları gözlemlemek için daha fazla fırsat vardır. Örneğin, ömrü boyunca sadece erken örnekleme ve geç zaman noktalarında veri mutasyon sıklığı sürekli bir artış gösteren, ama çabuk ve daha sonra yaylalar bu mutasyon sıklığı artar gösterebilir ömrü boyunca ek ara zamanlarda örnekleme üretebilir. Bu protokol yaşlı anne hücreleri izolatları Ancak, yaşla birlikte mutasyon oranlarındaki değişimlerin daha doğrudan bir ölçümünü elde etmek için bir fırsat var. Dalgalanma testleri olabilir be mutasyon oranı, genç hücreler kullanılarak elde edilen orandan farklı olup olmadığını belirlemek için farklı yaşlarda annesi hücreleri kullanılarak gerçekleştirildi. Büyüdükçe bu dalgalanmaları deney kültürleri yaşlı ve genç hücrelerin bir karışımı olacak olsa da, genç hücreler ile başlanarak elde oranlarından herhangi bir sapma eski bir başlangıç ​​popülasyonunun kullanımı ile bağlanabilir. Tekrarlanabilir doğru genom istikrarsızlık ölçmek için yaşlı anne hücreleri yeterince büyük bir nüfus elde etmek için yeteneği, bu yaklaşımın başarısı için kritik öneme sahiptir. Protokol, bu amaç için özel bir manyetik ayırma sisteminin kullanımını tarif etmekle beraber, başka gruplar da alternatif sistemler 14,18 (Malzeme Tabloya bakınız) maya hücreleri ana kriteri var. Üreticilerin bazı protokoller optimizasyon gerekli olabilir ama böyle bir alternatif sistemleri de, bu yöntem ile çalışması gerekir. Ne olursa olsun kullanılan özel sistem, nüfus büyüklüğü gerektirirÇalışma için seçilen bir mutasyon ya da genom yeniden düzenleme tipinin frekansına bağlı olarak d farklıdır. En azından, yeterli ana hücreler, mutasyon frekansı hesaplamak için kişi başına en azından bir mutant koloni elde etmek için olmalıdır. Sadece sıfır ila beş koloni, mutant nüfusta ve popülasyon boyutu daha küçük bir artış beklenmektedir eğer 5-10 mutan koloniler tahmin edilen, büyük ölçüde tekrarlanabilirliği artırabilir böylece uygulamada, sonuçlar oldukça değişken olabilir. Biotin bir başlangıç ​​nüfusu etiketleme, her tür için kurtarma verimlilik yaşındaki annesi hücrelerde mutasyon frekansını ölçmek için gerekli uygun nüfus büyüklüğü belirlemenize yardımcı olmak için dikkate alınması gerekiyor. Her sıralama sonra ana hücrelerinde% 90 iyileşme ile, orijinal nüfusun sadece% 59 büyüme ve sıralama beş tur sonra kurtarıldı olacaktır. Bu ~% 33 büyüme beş turdan sonra asıl nüfusun geri kazanımı ve etiketli anne hücrelerin sadece% 80&#39;i geri eğer sıralama düşerHer çeşit sırasında ed. Nüfus büyüklüğü iki üç kat azalma kolayca nüfus başına mutant kolonilerin güvenilmez numaraları neden olabilir, çünkü düşük frekanslı olayları ölçerken Ölçme ve kurtarma maksimize önemlidir. Genişletilmesi veya mitotik hücre yaşlanma sırasında genom istikrarsızlık daha geniş bir anlayış elde etmek için bu protokolü değiştirerek için çok sayıda seçenek vardır. Basit örnekler gen fonksiyonlarının, ortam değişiklikleri veya diğer çevresel durumu değişiklikleri değişiklikler yaşla birlikte mutasyonların birikimi nasıl değiştirdiğini analiz içerir. Değiştirilmiş gen fonksiyonu ile veya uygun durumda, genç hücreler için Mutasyon oranı ölçülmüş ve kontrol hücre popülasyonlarında daha farklı hızı değerleri ile tahmin ve daha farklı mutasyonların birikmesine olup olmadığını belirlemek için kullanılacaktır. Replikatif yaşlanma sırasında farklı noktalarda Hücre popülasyonları, reaktif oksijen türleri veya DNA hasar verme ajanları gibi özel baskı uygulayıcılar maruz olabilir. Biroksidatif strese geçici ve hafif maruziyet esasen hücre sıralama (Şekil 3) gerçekleştirme yeteneğini değiştirmek değil, ama sert gerilmeler hücrelerin iyileşmesini komplike edebilir. Ön deneyler anne hücreleri hala belirli stresleri sonra bir şekilde geri doğrulamak için gerekli olacaktır. Ayrıca, izole anne hücrelerinin hücresel özellikleri 3 yaşlanma ile ilişkili reaktif oksijen türlerinin, mitokondriyal ve vakuolar morfolojisi ve diğer fizyolojik özelliklerinin düzeyleri dahil olmak üzere, ayrıntılı olarak analiz edilebilir. Ayrıca ana hücreleri bir tedavi ya da bir işlem için bir başlangıç ​​popülasyonu olabilir. Anne ve kızı hücreleri fiziksel işlem sırasında ayrılır yana, kızı hücreleri yine de analiz için mevcuttur. Örneğin, çocuk hücrelere veya maya anne ve ikincil hücreler arasında hasarlı makro moleküllerin asimetrik miras fizyolojik değişiklikleri <s&gt; 24 mutasyon frekansları / oranlarında herhangi bir ilginç değişiklikler zamanlamasına göre olabilir kadar. Kızı hücre popülasyonlarının mutasyon frekansları da Replikatif yaşlanma sırasında mutasyonların asimetrik miras olup olmadığını modellemek için denemek için elde edilebilir. Özet olarak, dalgalanma testleri ile manyetik hücre sıralama yoluyla ana hücrelerin zenginleştirilmesi birleştiren S. avantajlarını mümkün kılmaktadır cerevisiae model sistem verimli mitotik hücre yaşlanma sırasında genetik değişikliklerin birikimi sorumlu mekanizmaların araştırılması için uygulanacak.

Bu tür maya Saccharomyces cerevisiae gibi mikroorganizmalar, mutasyon hızı incelemek için mükemmel bir model olan, ancak tam olarak bu modeller, hücrelerin mitotik yaşlanma sırasında mutasyonların birikimine araştırmak için kullanılan edilmemiştir. Nükleer genomu içerisinde, mutasyon birikimi gen fonksiyonlarının 1 (veya varyasyonun) ilerleyen kaybıyla sonuçlanan yaşlanma katkıda sürülmüştür. Büyük ölçüde çünkü uyduruk genetik sistemlerin bu süreci etkileyen genetik ve çevresel faktörlerin belirlenmesi ve mikroorganizmalar nadir fenotipik değişiklikleri nicel kolaylığı hızlandırabilir yaşlanma sırasında mekanizmaları ve mutasyon birikimi sonuçlarını incelemek için bir mikrobiyal sistemi kullanmak için yeteneği. DNA onarım faktörler ve DNA hasar cevabı proteinler de farklı türlerin 2 boyunca korunduğu, ve organizma yaşlanma temel benzerlikler S. gibi çeşitli organizmaların tespit edilmiştir cerevisiae birmuhtemelen bu hale d memeliler 3, maya çalışmalardan elde edilen sonuçlar, birçok organizmada yaşlanma ile ilgili olacaktır. S. yaşlanma Çalışmaları cerevisiae kronolojik yaşlanma veya hücre kopyelenebilir yaşlanmasını ölçen iki yaşlanma modelleri faydalanmak. Kronolojik yaşlanma nedeniyle besin tüketme 3&#39;e bölünmeyen durumu (sabit faz) olan maya hücre popülasyonlarında canlılığının ilerleyen kaybıyla karakterize edilir. Kronolojik yaşlanma modeli, büyük hücre popülasyonları kolayca mutant hücrelerin fenotipik seçim yapmak için bu modelde elde edildiğinden mutasyonlar, yaş arttıkça 4 birikir olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Bu durumda, mutasyon birikimi büyüme sinyal yolları ve oksidatif stres 5 tarafından etkilenmiş gibi görünüyor, ve bu faktörlerin her biri çok hücreli ökaryotlarda 3 yaşlanma anlaşılması için uygun olduğu. Replikatif yaşlanma modeli kullanan asimetrik DiViSiS. ile ilgili ardışık hücre nesiller 3 ile oluşur yaşlanmayı araştıran cerevisiae anne ve kızı hücreler. Maya Replikatif yaşlanma sık microfluidic cihazlar 6,7 maya hücreleri küçük popülasyonlar video mikroskobu ile anne ve kızı hücreleri, ya da daha yakın zamanda, küçük popülasyonlarının mikromanipülasyon ile ölçülmüştür. Sınırlı popülasyon boyutları tam genom bilgileri tek hücre elde edilen ya da çok yüksek frekanslı genetik değişiklikler 8 ölçülür sürece mitotik yaşlanmada mutasyon birikimi araştırılması için, bu yaklaşımlar kötü uygun hale gelir. Tek tek hücrelerin tam genom sekanslama gibi sahalarda mutasyon birikimi araştırmak için büyük ölçüde veri setleri sağlar, ancak fenotipik seçim sistemleri, altta yatan mutasyonun birikimi incelemek için mutasyon oranlarını ölçmek için bir araç sağlayan büyük avantajlara sahiptir. Çalışmalar haploi fenotipik seçimleri yoluyla mutasyon frekansları ve oranlarını incelemek içinReplikatif yaşlanma sırasında d maya suşları henüz rapor edilmemiştir. Mutasyon oranları yaygın dalgalanma testleri 9 kullanılarak ölçülür. Mutasyon frekans değerleri bir popülasyonda bir gen sekansı içerisinde bir mutasyon taşıyan hücrelerin toplam sayısını yansıtmaktadır. Bu bağımsız mutasyonların meydana geleceği hücreler ve sadece önceden mevcut olan mutasyonları taşıyan bu hücrelerin herhangi bir soyunu kapsar. Bunun aksine, dalgalanma testleri vasıtasıyla ölçülen bir mutasyon oranı, yeni nesil her bir hücre ile ortaya çıkan mutasyonlar bağımsız sayısını temsil eder. Bu testler tipik olarak, bir hedef dizisi daha önceden var olan mutasyonlar ile hücrelerin ilave yakın doyması kültürlerinin yetiştirilmesine ve seçici ortam üzerinde büyüme mutant hücreler tanımlama olasılığını azaltmak için, düşük hücre yoğunluklarında kültür aşılamak çok tekrarlanan içerir. Suret popülasyonunda tespit mutant hücrelerin sayısı daha sonra i sayısını tahmin etmek için çeşitli matematiksel modeller biri kullanılırbüyüme 9 sırasında ortaya ndependent mutasyonlar. Ortalama nüfus büyüklüğü bağımsız mutasyonların sayısını karşılaştırarak mutasyon oranı bir ölçü sağlar. S., Bu genlerin kaybı fonksiyon-mutasyonlar seçilebilir fenotiplerini üretmek beri cerevisiae, mutasyon frekansları ve oranları sık sık, URA3 ve CAN1 genleri kullanarak ölçülür. URA3 tarafından kodlanan protein molekülü toksik 10 içine 5-FOA dönüştürür yana bir URA3 fonksiyon kaybı, 5-fluoroorotik asit (5-FOA) dirençli hücre oluşturur. CAN1 şifrelediği protein, hücrelere 11 içine arginin ve kanavanin taşıma yana CAN1 fonksiyon kaybı, hücreler canavanine, toksik bir arginin analogunun dirençli olmayı sağlar. Hem genetik hem de fiziksel sıralama stratejileri başarıyla S. geniş popülasyonları elde etmek için istihdam edilmiştir cerevisiae anne hücreleri Replikatif yaşlanma soruşturmaları kolaylaştırmak için. Genetik stratejileri bir popülasyonda kızı hücre hayatta karşı seçim zeki yaklaşımları içermektedir. Annesi zenginleştirme programı (MEP) loxp siteleri 12 içerecek şekilde tasarlanmıştır edilen iki temel genlerin kızı özgü bozulmasına yol açan, sadece kız hücrelerde Cre yeniden ifade beta-östradiol indüklenmesini içerir. MEP suşlar, uyarıcının yokluğunda normal olarak yetiştirilebilir, ancak anne kız hücreler hücreler, hücre siklüsü boyunca 12 ilk ilerlemesi sırasında tipik olarak, M-fazında tutuklama olurken, indüksiyonundan sonra bölünmeye devam edecektir. Bu sistem, genel olarak yaşlanma sırasında mutasyon birikimi incelemek için kullanılmış olsa da, bu yaşlanma ana hücrelerinde 13,14 heterozigosite kaybı, diploit maya suşlarında genom istikrarsızlık nispeten sık bir formu, hem de biyokimyasal değişiklikler incelemek için kullanılmıştır. Benzer şekilde, kızı-deşarj sistemi S. kızı özgü ifadesini içerir cereviSIAE URA3 geninin 15. 5-FOA hangi URA3 ifade noktası yavru hücre ölür, ortamına ilave edilene kadar ana hücreler 15 büyümeye devam eder kızı-deşarj suşları, normal büyümeyi sürdürmüştür. Bu ana hücreler için kullanışlı ettirecek sistemleri, ancak seçim sistemi oluşturan gen fonksiyonlarının korunması bağlıdır. Seçim sistemi bir ya da daha çok bileşen olarak rastgele mutasyonların seçimi kaçış ve katlanarak çoğalmasına kız hücrelerde neden olabilir. MEP suşların gelişimi sırasında, uygun nüfus büyüklükleri seçimi 12 kaçış olabilir mutant kızı hücrelerin görünümünü önlemek için kararlı idi. Ancak, nüfus büyüklüğü bu sınır Replikatif yaşlanma sırasında genom istikrarsızlık nadir formları algılama ödün. Nüfus büyüklüğüne Bu kısıtlama kısmen her genin iki kopyası çünkü çoğu, seçim sistemi katkıda diploid maya suşları kullanılarak üstesinden gelinebilirmutasyonlar büyük olasılıkla 12 çekinik olacaktır. Bununla birlikte, Diploid suşların kullanımı kolay uygulanabilen, haploit maya hücrelerinde tespit edilebilir kıyasla tespit edilebilir mutasyon olayları türlerini kısıtlar. Fiziksel sıralama stratejileri ana hücrelerinde büyük nüfuslu zenginleştirmek için etiketsiz kızı hücrelerden etiketli bir hücre yüzeyi ile anne hücrelerin izolasyonu bulunmaktadır. S. hücre yüzeyi proteinleri olduğu şeklindeki gözlem, (hücre duvarı) cerevisiae kızı hücreler yeni onlar 16 üretmek kızı hücrelerin etiketlenmesi olmadan anne hücreleri etiketlemek için istismar edilmiştir tomurcuklanma sırasında sentezlenir. Örneğin, biyotin ile etiketlenmiş yüzey üzerinde maya hücrelerinin bir ilk popülasyon yetiştirilebilir ve daha sonra, başlangıç ​​popülasyonu tarafından üretilen yavru hücre yüzeyinde biyotin içermez, çünkü 16 sıralama, anti-biyotin ve manyetik mikro-boncuklar kullanılarak kız hücrelerde izole . Seri büyüme veayırma ana hücrelerin giderek daha büyük popülasyonları elde edilmiş ve analiz edilmesini sağlar. Bu prosedür maya 13,14,17,18 kopyelenebilir yaşlanma sırasında hücre fizyolojisi ve gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için başarıyla kullanılmaktadır. Mevcut yöntem, potansiyel olarak nadir mutasyonlar veya fenotipik tahlil seçimleri arasında genom istikrarsızlık diğer formları birikiminin ölçülmesi amacı ile ana hücreleri zenginleştirmek üzere bu biotin ile etiketlenmesinde ve manyetik ayırma tekniği uyarlar. Seri büyüme ve fiziksel ayrıştırma giderek daha büyük hücrelerinde de mutasyon birikimi analizi, hem de kendi kızı hücre popülasyonu sağlar. Nesil başına mutasyon oranlarının belirlenmesi öngörülen mutasyon frekans hücre bölünmeleri belli bir sayıda uğramıştır anne hücreleri için hesaplanacak izin verir. Tahmin frekans değerleri nedeniyle gözlenen Mutati hücre bölünmesinin ek mermi, önemli sapmalar beklenen artış dayalı olduğundantahmin edilen değerlerle karşılaştırıldığında frekanslar üzerinde biriken değişim oranından yaşa özel değişiklikler kanıtlarıdır. Bu protokolü kullanarak, akış sitometri analizi ile birleştiğinde anne hücreleri üzerinde hücre bölünmeleri sitelerine karşılık tomurcuk izleri floresan boyama hızla sıralı ve sıralanmamış nüfusun yaş dağılımını belirlemek için kullanılabilir. Bu tür reaktif oksijen türlerini tespit etmek için kullanılanlar gibi floresan ilave reaktifler, aynı zamanda Bu protokol uygulamasında kullanılabilir. Genel olarak, bu protokol yaşlanma ile ilgili genom istikrarsızlık etkileyen genetik ve çevresel faktörleri araştırmak için uygun bir model organizma yaşa bağlı hücre fizyolojik değişikliklere korelasyon potansiyeli ile genom istikrarsızlık yaşa bağlı değişikliklerin etkili analiz sağlar.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Anti-Biotin Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)</td></tr><tr><td>MACS LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>25 columns suitable for QuadroMACS separator</td></tr><tr><td>QuadroMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>Separator Only</td></tr><tr><td>QuadroMACS Starting Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-051</td><td>Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads</td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer, 40 &amp;micro;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>40 &amp;micro;m for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>Powder, filtering after dissolving important to remove particulates</td></tr><tr><td>Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488</td><td>Life Technologies</td><td>W11261</td><td>Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>10 ml, other antifade reagents could also be used</td></tr></tbody></table>

combining magnetic sorting of mother cells and fluctuation tests to analyze genome instability during mitotic cell aging in saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae mekanizmaları ve genom istikrarsızlık sonuçlarını incelemek için mükemmel bir model sistem olmuştur. DNA onarımı ve DNA tamir faktörler tam olarak çeşitli türlerin boyunca korunduğu için, bu maya modelden elde edilen bilgiler, insanlar dahil olmak üzere bir çok organizmada, ile ilgilidir. Bununla birlikte S. cerevisiae henüz tam olmadığını yaş artan Replikatif (mitoz) ile mutasyonlar değişiklikleri biriken oranı teknik zorlamalar nedeniyle hitap kullanılan olmamıştır. Örneğin, mikromanipülasyon yoluyla maya Replikatif ömrü ölçümleri nadir mutasyonları tespit yasaklayan hücrelerinin çok küçük nüfus kapsayabilir. Kızı hücrelerinin ölümünü uyararak toplumlarda anne hücreleri zenginleştirmek üzere genetik yöntemler geliştirilmiştir, ancak nüfus büyüklükleri yine seçim sistemleri tehlikeye rastgele mutasyonların meydana geldiği ile frekansı ile sınırlıdır. Geçerli protokol manyetik Sorti yararlanıryüzey-etiketli maya anne hücreleri ng fenotipik seçimleri arasında nadir mutasyonları ölçmek için anne hücreleri yaşlanma yeterince büyük popülasyonları elde etmek. Dalgalanması testleri ile ölçülen mutasyon oranları, ve mutasyon frekansları ilk genç hücreler için kurulan ve çeşitli Replikatif yaş annesi hücrelerinde mutasyonların sıklığını tahmin etmek için kullanılır. Mutasyon frekanslar sıralanmış bir ana hücreler için belirlenir, ve ana hücrelerin yaş hücre bölünmesi esnasında, hücre yüzeyleri üzerinde oluşturulan tomurcuk izleri tespit eden bir flüoresan tepkime maddesi, ile boyama ile akış sitometrisi kullanılarak belirlenir. Deneysel olarak, belirli bir replikatif yaş ana hücrelerde gözlemlenen frekanslara hücre bölünmesini sayısına göre tahmin mutasyon frekansın karşılaştırılması daha sonra biriken değişim oranından yaşa bağlı değişiklik olup olmadığını belirleyebilir. Bu temel protokolün Varyasyonları özgü gen işlevlerinde değişikliklerin etkisini araştırmak için araçları sağlamak veyamutasyon birikimi belirli çevresel koşullar Replikatif yaşlanma sırasında mekanizmalar yatan genom istikrarsızlığı gidermek için.

Watch this Scientific Journal Video about Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.c

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Dalgalanması testleri ile ölçülen genç Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde mutasyon oranları farklı Replikatif yaştan annesi hücrelerinin mutasyon frekansları tahmin etmek için kullanılır. Manyetik ayırma ve akım sitometri sonra tahmin mutasyon sıklıkları sapmaları tespit etmek, gerçek mutasyon frekansları ve anne hücrelerin yaşını ölçmek için kullanılır.

Anne Hücreleri ve dalgalanma Testleri Manyetik orting birleştiren Mitotic Hücre Yaşlanma sırasında Genom istikrarsızlık Analiz için<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

combining-magnetic-sorting-mother-cells-fluctuation-tests-to-analyze

Research

JoVE Journal

Biology

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

12.5K Görüntüleme.  Rensselaer Polytechnic Institute.  Dalgalanması testleri ile ölçülen genç Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde mutasyon oranları farklı Replikatif yaştan annesi hücrelerinin mutasyon frekansları tahmin etmek için kullanılır. Manyetik ayırma ve akım sitometri sonra tahmin mutasyon sıklıkları sapmaları tespit etmek, gerçek mutasyon frekansları ve anne hücrelerin yaşını ölçmek için kullanılır. 

Video: Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Biyomühendislik

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Biyoloji

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors contribute to alterations in the normal aging process. These factors intersect in complex ways, as evidenced by the wealth of documented links identified and conserved in many organisms. Most of these studies focus on loss-of-function, null mutants that allow for rapid screening of many genes simultaneously. There is much less work that focuses on characterizing the role that overexpression of a gene in this process. In the present work, we present a straightforward methodology to identify and clone genes in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, for study in suppression of the short-lived chronological lifespan phenotype seen in many genetic backgrounds. This protocol is designed to be accessible to researchers from a wide variety of backgrounds and at various academic stages. The SIR2 gene, which codes for a histone deacetylase, was selected for cloning in the pRS315 vector, as there have been conflicting reports on its effect on the chronological lifespan. SIR2 also plays a role in autophagy, which results when disrupted via the deletion of several genes, including the transcription factor ATG1. As a proof of principle, we clone the SIR2 gene to perform a suppressor screen on the shortened lifespan phenotype characteristic of the autophagy deficient atg1&#916; mutant and compare it to an otherwise isogenic, wild type genetic background.

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Here is a protocol to identify genetic interactions through an increased copy number suppressor screen in Saccharomyces cerevisiae. This method allows researchers to identify, clone, and test suppressors in short-lived yeast mutants. We test the effect of the copy number increase of SIR2 on lifespan in an autophagy null mutant.

Saccharomyces cerevisiae Kronolojik Yaşam Süresini Düzenleyen Genetik Bağlantıların Karakterizasyonu için Bastırıcı Ekran

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors ...

Genetik

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Gelişim Biyolojisi

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Akış Sitometri tabanlı Arıtma<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigot

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells&#8217; (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

Yetişkin gelen Bağırsak Kök Hücreler Yalıtımlı<em&gt; Drosophila</em&gt; FACS Midguts Yaşlanma sırasında Kök Hücre Davranışı Eğitim için

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Anne Hücreleri ve dalgalanma Testleri Manyetik orting birleştiren Mitotic Hücre Yaşlanma sırasında Genom istikrarsızlık Analiz için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler