Yazarlar ölçüde Pierre BOURDONCLE, Thomas Guilbert ve Cochin Görüntüleme Tesisi Louise Rimbault kabul. Bu çalışma Inserm, CNRS ve Ligue Nationale contre le Kanser (Equipe labellisée) tarafından desteklenmiştir.

T Lemfositleri hazırlanması 1. <ol><li> 10,11 tarif edildiği gibi primer, fare veya insan T hücrelerini hazırlamak. </li><li> 3 x 10 6 hücre / mL - 2 arasında bir yoğunlukta% 10 insan serumu AB ile tam RPMI ortamı içinde insan T hücrelerini yetiştirmek. Not: kültürde insan T hücrelerinin büyük bir kısmını kendiliğinden polarizasyon ortaya fetal sığır serumu (FCS) yerine, insan serumu kullanılması. Bu dönemde herhangi bir zamanda 5 gün ve daha fazla işlem onları - 4 kültürde bu hücreleri tutun. </li><li> Benzer bir hücre yoğunluğunda,% 10 FCS ile desteklenmiş tam RPMI ortamı içinde fare T hücrelerini koruyun. 10 ng / ml IL7 mevcudiyetinde 37 ° C &#39;de hemen ya da ertesi gün, bir O / N kültürden sonra kullanın. </li><li> Tam RPMI,% 10 FCS ile takviye edilmiş CEM insan T hücre soyu geliştirin. </li></ol> 2. Kemokin Uyarım <ol><li> 10 mM HIPE ile desteklenmiş sıcak HBSS ortamında deneysel koşul başına 5 x 10 5 hücre yıkayıns. Bazı deneyler için, 2 ug pmaxGFP ve 8 ug pcDNA3.1 + (boş vektör kontrol), ölü yer PKCζ kinaz ya da N-ucu Par6 plazmidler ile bir gün önce, primer insan T hücrelerinin ko-transfekte. </li><li> Sıcak HBSS-hepes ortamında hücre pelletini (deneysel koşullar 0.3 ml x numarasını kullanın). </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine hücreleri dağıtın. NOT: Bu nedenle, tek bir deneysel koşuluna karşılık gelen bir boru, 0.3 ml HBSS-HEPES ortamında 5 x 10 5 hücre içerir. Bazı deneyler için, 500 nM Latrunculin A veya aracı (DMSO) ilave ediniz ve kemokin uyarılmadan önce 30 dakika için kuluçkalayın. </li><li> Her bir tüp içinde 10 ng / ml CCL19 veya CXCL12 kemokin 500 ekleyin. NOT: Biz genellikle 10 kullanın - İnsan T hücreleri için 200 ng / ml kemokini. CEM hücreleri CCL19 bağlayan CCR7 reseptörü ifade yoktur. Bu nedenle, CEM hücreleri sadece bir CXCL12 uyarısına cevap mümkün olacak. 500 N - Ayrıca, daha yüksek bir kemokin konsantrasyonları (300 kullanımıg / ml) fare T hücrelerini kutuplaşmaya. </li><li> Tüpler birkaç kez ters çevirin ve sırasıyla, birincil T hücrelerinin veya CEM 8 ya da 10 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde inkübe. </li><li> Her bir tüpe,% 2 paraformaldehit (PFA) ile PBS içinde 10 mM Hepes ihtiva eden ılık bir çözeltiye, 0.3 ml ilave etmek suretiyle polarizasyon işlemi durdurun. Tüpler ters çevirin ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe. </li></ol> 3. Renklendirmeler <ol><li> Tüpler akış sitometri mikrosantrifüj tüpleri hücreleri aktarın. </li><li> % 1 sığır serum albümini (BSA), 0.5 mM EDTA ve PBS içinde 10 mM Hepes ihtiva eden bir RT çözeltisi ile tam olarak tüpler doldurun. </li><li> 4 dakika için 460 xg&#39;de tüpler santrifüj. </li><li> Süpernatant atılır ve PBS içinde% 5 FCS ihtiva eden bir RT çözeltisi 100 ul süspansiyon hücrelerin. </li><li> Işıktan uzakta, girdap onları, her bir tüp içinde FITC-anti-HLA-ABC 5 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe. </li><li> PBS,% 5 FCS ihtiva eden bir kez hücreler yıkayınSadece bir kez PBS ile nd. </li><li> Oda sıcaklığında: daha sonra% 1 BSA, 0.5 mM EDTA ve PBS içinde 10 mM HEPES içeren bir solüsyon ile yıkama hücreleri, 10 dakika süre ile inkübe edilir, 500 ul% 1 PFA ekleyin. </li><li> Süpernatant atılır, PBS,% 0.2 BSA,% 0.1 saponin, 0.5 mM EDTA ve 10 mM Hepes (permeabilizasyon tamponu) ihtiva eden bir çözelti ile tamamen tüpleri doldurun. </li><li> Bu ortam içinde hücreler iki kez yıkayın. </li><li> Orta kaldırmak ve hücre pelet ayırmak için onları vorteks tüpleri çevirin. </li><li> Her bir tüpe, anti-P-KRY antikorun 100 seyrelti, girdap onları ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir: ve / veya 1 ila 0.25 ug / ml TRITC-falloidin ekleyin. </li><li> Permeabilizasyon tampon maddesi ile hücreleri yıkayın. Bir fluorescent sekonder antikor gerektiğinde kuluçkalayın. </li><li> 200 ul PBS hücrelerin tekrar ve mikrosantrifüj tüpler aktarabilirsiniz. NOT: Hücreler edinimi için hazırız. Tüp başına 200 ul maksimum toplam hacmi korurken, alternatif olarak, bir son% 1 konsantre PFA eklemekHücreler daha fazla işlem için aynı gün kullanılmak üzere takdirde için yoğunlaştırma lekelenmelerinin korumak için. </li></ol> 4. Görüntüler Toplama ve Analiz <ol><li> Aparat (Belirli Reaktifler / Ekipman Tabloya bakınız) açın ve üreticinin talimatlarına göre kendisini kalibre edelim. NOT: INSPIRE yazılımı 40X objektif (0.75 NA) ile kullanılmıştır. FİKİRLER 3.0 yazılımı tüm bildirilen sayımsal için kullanılmıştır. </li><li> Gelecek deneyler için bir şablona kaydedilebilir satın alma pencereleri bir dizi hazırlayın. RMS degrade değerlerini ölçmek histogramlar çizin. RMS degrade histogram seçilen &quot;Focus&quot; nüfus itibaren, Alan histogram &quot;Tek hücreli&quot; nüfus sınırlandırmak. Mikrosantrifüj tüpü makinesinde yerleştirildikten sonra, tek tek hücreler ile bir kapı lazer gücünün ayarlanması ve 5000 T lenfositleri kazanır. </li><li> Yumuşak Fikirlerware, satın alma dosyasını açın ve her hücre için elde edilen parlak bir alan görüntüler için degrade RMS değerini gösteren bir histogram (Kanal 1) oluşturun. 57 Yukarıda RMS degrade değeri sergileyen hücreler gördüğü RMS degrade histogram üzerinde bir kapı çizin. NOT: RMS degrade analizinde odak düzleminde sadece T lenfositler dikkate alarak sağlar. Bu 57 um&#39;nin RMS gradyan değeri gösteren tek tek hücreler odak düzlem içindedir ve doğru olarak kabul edilebilir ampirik olarak tespit edilmiştir. </li><li> Analiz / Maskeler menüsünde, 2 piksel aşınmış aydınlık görüntüler M01, üzerinde morfoloji maskesinden (M01,2) Erode denilen, yeni bir maske oluşturmak. Ardından, Analiz / Erode (M01,2) maske hesaplanan Area, yeni bir özellik oluşturmak, menü bulunmaktadır. Bir önceki kapısı seçilen hücrelerden, bu yeni oluşturulan maske kullanarak hücrelerin Alan gösteren bir histogram açın. NOT: ulaşırsınız morfoloji maskeleriVarsayılan hücrenin gerçek boyutundan daha büyüktür. Böylece, 2 piksel o kadar aşındırmak için daha hassas. </li><li> Kalibrasyon boncuk ve enkaz (küçük Alan) ve çiftler (büyük Area) hariç, bireysel T hücreleri üzerinde bir kapı çizin. Her satın alma bu kapıyı ayarlayın. NOT: Hücre boyutu varyasyonlar kapısı konumunu etkileyecektir. Fare T hücrelerinin kendilerini CEM hücreleri daha küçük olan insan T hücrelerinin daha küçük olduğu için, her hücre tipi alan büyüklüğü ile orantılı olacaktır. </li><li> Önceki adımlarda Geçitli edildi tek odakta hücreleri göz önüne alındığında, Phalloidin Raw Max Pixel bir fonksiyonu olarak HLA-ABC boyama Raw Max Pixel (Kanal 2, x ekseni) oluşan bir nokta arsa açmak boyama (Kanal 4, y ekseni). Lekesiz veya doymuş floresan olayları dışlamak için bir kapı oluşturun. Ham Max HLA-ABC için Pixel (Kanal 2) ve Phalloidin (Kanal 4) lekelenmelerinin gösteren Aç iki histogramlar. </li><li> Analiz / Maskeler menüsünde, creat içinde2 piksel aşınmış HLA-ABC boyanmış hücreler (Kanal 2), morfolojisi maskesinden (M02,2) Erode denilen adet yeni maske. Ardından, Analiz / Erode (M02,2) üzerinden hesaplanan Circularity parametresi oluşan yeni bir özellik oluşturmak, menü bulunmaktadır. NOT: Bu parametre, bir daire hücre şeklinin sapmasını ölçer. Bu nedenle, mükemmel yuvarlak T hücresi düşük dairesellik endeksi sergileyecek uzatılmış polarize hücreler ise yüksek bir yuvarlaklık değerine sahip olacaktır. </li><li> Daha sonra, daha önce kapı hücrelerden Circularity özelliği değerlerini rapor başka bir histogram yaratmak. Doğrudan her bir hücre için daireselliğe değerine göre bir birey, odakta hücre popülasyonu dağılımının çizmek için bu histogram kullanın. </li><li> Uyarılmamış hücrelere için histogram şeklinde bakıldığında, dairesellik sınır değerine kadar düşük dairesellik değerden başlayarak polarize hücreler için bir kapı çizmek burada Uyarılmamış hücrelere ençizilmiştir. Kapılı nüfus arasında polarize hücrelerin yüzdesi istatistikleri ekrana bak (% Geçitli). NOT: Biz 13 altında Circularity indeks değerleri için bu kapıyı belirledik. </li><li> Hücrelerde aktin boyama kutuplaşma bakmak için, HLA-ABC boyama (Kanal 2) ve falloidin boyama karşılaştırarak, Parlak Detay Benzerlik R3 değeri için histogram arsa (Kanal 4). NOT: Bu özellik büyük değeri, en fazla iki Renklendirmeler vardır bindirilmiş. </li><li> Daha önce olduğu gibi aynı yolluk strateji kullanarak, polarize aktin boyama ile hücrelerin yüzdesini gösterir ayrılmış boyama için, uyarılmamış hücreler ile bir kapı çizilir. </li><li> Tamamlandığında, MHC Sınıf I ve falloidin boyamalar, birlikte SD ± bütün hücrelerin Circularity ve Benzerlik indeksleri ortalama değerleri ile polarize hücrelerin yüzdesi dağılımında bir ayrımı sergileyen hücrelerin yüzdesi Nominal değerden uygun olarak gösterilmektedironding istatistik paneller. </li></ol>

<ol><li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chemokines+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li>
<li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li>
<li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases%3A+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li>
<li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li>
<li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta%3A+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li>
<li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li>
<li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li>
<li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+T+cell+shape%2C+motility%2C+and+sensitivity+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409(2007).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Sitometri, hızlı ve bilgilendirici yolluk strateji kemokin uyarımı ile uyarılan hücresel ve moleküler olayları analiz etmek görüntüleme akışının son teknolojiyi kullanarak sunulmuştur. Kemokin uyarılması ve polarizasyon sürecinde farklı proteinlerin hücre içi dağılımı ile oluşturulan hücre morfolojisi değişiklikleri: Tek bir deney itibaren, bir iki ana bilgi edinebilirsiniz. İlginç bir şekilde, kanıtlar da istatistiksel sağlamlık ve bütün hücre nüfusun küçük bir fraksiyonu ilgi...

Kemokinler özel yerlere 1 hücreleri çekmek küçük çözünebilir proteinlerdir. Bu nedenle, bu dokularda hücre doğru konumlandırılması, geliştirme ve fizyolojisi çok önemli bir işlevine katılırlar. Bu, etkili bir bağışıklık karşılığının ortaya çıkarılması için birlikte hareket birçok farklı hücre tiplerinin hareketlerine dayanır, bağışıklık sistemi, bu kurala istisna değildir. Yabancı antijenler tespit ve nötralize edilebilir önce belirli bir durumda bir bağışıklık hücre tipi özel konumunu kontrol ederek, kemokinler önceden gerekli bulunmaktadır. Özellikle T lenfositleri kemokinler T hücresi hareketliliği 2,3 tercih geçişi üzerine, hücreiçi sinyal ortaya, özel yüzey reseptörleri (kalsiyum yükselişi ERK fosforilasyonu, Rho GTPazlar aktivasyonu, integrinler afinite ve sitoskeletal değişimler artış) bağlanır. Hücresel düzeyde, bir kemokin stimülasyon üzerine ortaya morfolojik değişiklikler gözlemleyebilirsiniz.Hücre şekilleri bu değişiklikler T hücrelerinin özellikle dramatik: kanda seyahat ederken dinlenme T hücreleri, bir boncuk gibi yuvarlak morfoloji var. Ön bir ön kenarı: Bununla birlikte, iltihabik bölgelerde veya lenfoid organların yakınlık kemokinlerin varlığı algılama hemen iki kutuplu bir formundan oluşan tipik bir &quot;el ayna&quot; morfolojisi kabul T hücrelerinin şeklinin değiştirilmesi için gidiyor ve arka 4 bir arka kenar veya uropod. Buna ek olarak, hücre içi bileşenleri göç sürdürmek için polarize T hücresinin bu iki zıt bölgeye ayırmak olabilir. Örneğin kemokin uyarımı 5 ve polimerize aktin üzerine aktin filamentler polimerizasyon artar kutuplaşmış T hücresinin 2 ön birikir. Öte yandan, bu tür kortikal F-aktin hücre iskeleti, plazma membranı bağlantı Ezrin-Radixin-moesin (ERM); ailesinin fosforile proteinler gibi bazı proteinler, kutuplaşmış uropod yeniden lokalizeT hücreleri, 6. İlginç bir şekilde, ve diğerleri, bu kutuplaşma süreci T hücre göçü için gerekli olduğunu göstermiştir. Nitekim, polarizasyon müdahale herhangi bir tedavi hücresel hareketliliğini engeller. Örneğin, atipik protein üyelerinin etkinliğinin engellenmesi, C (PKC), aile, PKCζ ve PKCι blok T hücresi polarizasyon ve dendritik hücrelerin 7 için göç tarama işlemini kinaz. T hücre kutuplaşma da Rho GTPases tarafından düzenlenir. Son zamanlarda tarif edildiği Fam65b proteini ile RhoA aktivitesinin modüle bir Transwell tahlilinde 6 geçirilecek T hücre morfolojisindeki değişikliklerle ve kapasiteyi etkiler göstermiştir. Polarizasyon hücre motilitesi için bir ön adım olarak, kemokin tepkilerin ana okuma olarak ölçmek mümkün böylece önemlidir. Hücre şekli değişiklikleri önceden elle 8 ölçüldü. Ancak, miktar bu tür çok zaman tüketen olduğunu, genellikle sadece birkaç yüzdenhücre on dikkate alınmaktadır. Burada, yeni bir yöntem hızlı uyarımı kemokin maruz bırakılan T lenfositlerinin şekil değişiklikleri derecesini ölçmek için sunulmuştur. Teknoloji sitometri bir görüntüleme akış kemokin stimülasyon farklı koşullarda verimli polarize hücrelerin miktarını ölçmek için bir akış sitometresinde ve bir mikroskop 9 avantajlarını birleştiren, kullanılan (Belirli Reaktifler / Ekipman Tablo). Bir bu teknoloji ile sağlam ölçebilen morfolojik değişimlerin değerlendirilmesiyle ek olarak, bu kemokin sinyali üzerine, bazı proteinlerin hücre altı lokalizasyonda değişiklikleri değerlendirmek için de mümkündür.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Human serum AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Human T cell nucleofactor kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8-100</td><td>This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC antibody</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>clone B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream&lt;sup&gt;x&lt;/sup&gt; Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling

Hücreler, bir süreç olarak adlandırılan kutuplaşma onların yuvarlak kaybederek ve birçok proteinlerin hücre içi lokalizasyonu değiştirerek uyarılmasını kemokin cevap. Klasik görüntüleme teknikleri bu olguları incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, morfolojisi ve hücre onlarca boyama eş-lokalizasyonu zaman alıcı miktarının ardından birçok hücrede elle toplama gerektiriyordu. Burada, hızlı ve güçlü bir yöntem, bir sitometresinde kişilerce mikroskop avantajlarını bir araya teknolojisi sitometri bir görüntüleme akışı kullanılarak hücrelerin birkaç bin oluşan numuneler üzerinde, bu olayları incelemek için tarif edilmektedir. MHC sınıf I molekülleri ve filamentli aktin için CCL19 ve boyama ile uyarılmış T lenfositleri kullanılarak bir yolluk stratejisi aynı zamanda şekil değişikliklerinin derecesi ve CCL19 sinyal etkilenen belirteçlerin eş-lokalizasyonu derecesini ölçmek için sunulmuştur. Üstelik, bu yolluk strateji gözlemleme için bize izine CXCL12 uyarıldıktan sonra polarize T hücrelerinde (ön) ipliksi aktin ve (arkada) fosforile Ezrin-Radixin-moesin (fosfo-ERM) proteinlerin ayrımı. Par6 / atipik PKC sinyal yolunun mutantlar bir farmakolojik inhibitörü ve ifade ile aktin polimerizasyonu inhibe: Bu teknik aynı zamanda iki farklı unsurların kutuplaşma engelleme etkisini gözlemlemek için yararlı oldu. Böylece, kanıtlar bu tekniğin morfolojik değişiklikler ve protein yeniden dağıtımı esnasında hem de analiz etmek yararlı olduğu gösterilmiştir.

Burada seçilen ilk örnek CCL19 ile uyarılmış insan primer T lenfositlerinin kullanımı ile ilgilidir. Bununla birlikte, aynı strateji primer fare T hücreleri, T hücre çizgileri ya da kemokin stimülasyona yanıt veren herhangi bir başka hücre tipi ile kullanılabilir. Burada sunulan yolluk strateji odaklı olaylar, ardından tek hücreleri seçin pencerelerin bir dizi içerir. (Şekil 1) veya CCL19-uyarılmış (Şekil 2), T lenfositleri istirahat için MHC Sınıf I HLA-ABC...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling at JoVE.com

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Kemokin Sinyalizasyonu Bağlı Hücresel ve Moleküler Polarizasyon Hızlı ve Sağlam Analizi

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell Polarization and Migration

SCIENTISTS IN ACTION

8.1K Görüntüleme.  Institut Cochin. Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Video: Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Biyokimya

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Nörobilim

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

Vivo Makrofaj İşe Test için Bir Ektopik Kemokin İfade Modeli

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Gelişim Biyolojisi

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil migration and chemotaxis owing to their advantages in real-time visualization, precise control of chemical concentration gradient generation, and reduced reagent and sample consumption. Recently, a growing effort has been made by the microfluidic researchers toward developing integrated and easily operated microfluidic chemotaxis analysis systems, directly from whole blood. In this direction, the first all-on-chip method was developed for integrating the magnetic negative purification of neutrophils and the chemotaxis assay from small blood volume samples. This new method permits a rapid sample-to-result neutrophil chemotaxis test in 25 min. In this paper, we provide detailed construction, operation and data analysis method for this all-on-chip chemotaxis assay with a discussion on troubleshooting strategies, limitations and future directions. Representative results of the neutrophil chemotaxis assay testing a defined chemoattractant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), and sputum from a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patient, using this all-on-chip method are shown. This method is applicable to many cell migration-related investigations and clinical applications.

This article provides the detailed method of performing a rapid neutrophil chemotaxis assay by integrating the on-chip neutrophil isolation from whole blood and the chemotaxis test on a single microfluidic chip.

Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Biyomühendislik

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Biyoloji

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...