This work was supported by NIH R01 EY020533, WSU Startup Fund, and RPB grants.

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürleri Wayne State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Deneysel Çözüm 1. Hazırlık <ol><li> Gerçek deneyden önce diseksiyon çözeltisini 1 gün hafta 1 hazırlayın. Çünkü düşük sıcaklıklarda 16 de güçlü tamponlama yeteneği retina diseksiyon için bir HEPES tampon solüsyonu kullanın. (MM olarak) aşağıdaki gibi kimyasalları karıştırın: 115 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl2, 1.0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glikoz ihtiva eder. NaOH ile 7.4&#39;e pH ayarlayın. 1 hafta buzdolabı yukarı çözümü tutun. </li><li> kayıt solüsyonu retina preparasyonlar 17 için tasarlanmış yapay beyin omurilik sıvısı (CSF) &#39;dir Ames aracı. Deney günü olarak, bir tüp içinde Ames tozu (500 ml çözelti için 4.4 g) tartılır. Ayrıca, NaHCO 3 (500 ml çözelti için 0.95 g) tartmak ve A ile karıştırınMES&#39;in toz. </li><li> Deney günü ile yama kelepçe kayıtları için hücre içi pipet çözüm hazırlayın. (MM olarak) aşağıdaki gibi kimyasalları karıştırma: 111, K-glukonat, 1.0 CaCl2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10 NaCl, 1.0 MgCl2, 5 ATP, Mg ve 1,0 GTP Na. KOH ile pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın. Geleneksel şırınga filtresi ile pipet çözüm Filtre. ~ 500 ul hacimde yapın ve bir dondurucu veya derin dondurucuda saklayabilirsiniz. </li></ol> Deney Günü 2. Hazırlık <ol><li> O / N karanlık adaptasyonu için karanlık bir alanda - (erkek, 8 haftalık 4, C57BL / 6J veya benzeri bir arka plan) gece deneyden önce, bir kafes içinde bir fare koyun. </li><li> Diseksiyon için hazırlık: <ol><li> En az 10 dakika süreyle oksijen ile, bir cam beher içinde - (200 mi, 100), buz üzerine yerleştirin ve kabarcık çözeltisi kesme doldurun. </li><li> Retina hazırlık depolama için karanlık kutu oksijenasyonu başlatın. </li><li> Yeniden gres için raylar ile plastik lamelleri hazırlayınintestinal dilim preparasyonlar 35 mm plastik tabak, her biri koyun. </li><li> Bir helikopter (doku dilimleme makinesi) yeni bir jilet takın. </li><li> Iki eşit parçaya, bir filtre membranı kesin. Bu retina dilimleme içindir. </li><li> Mikroskop yakın diseksiyon araçları ve transfer pipet hizalayın. Her aracı kolayca karanlıkta erişilebilir, böylece çalışma alanı iyi organize edilmelidir. </li></ol></li><li> Yama kelepçe kayıtları için hazırlık: <ol><li> Ames tozu ve damıtılmış su içinde NaHCO 3 (Ames 4.4 g NaHCO 3 0.95 g / 500 mi GKD 2 O) içinde çözülür. Karışık oksijen ile kabarcık Ames ortamı (% 95 O2 ve% 5 CO2), en azından 30 dakika için ise bir kayıt sıcaklık seviyesine ısıtma (~ 35 ° C). Hala köpüren ise NaHCO3 ile 7.4 pH ayarlayın. </li><li> Diseksiyon sırasında iç pipet çözüm çözülme. Çözündürüldükten sonra, hücre içi boyama için,% 0.01 sülforhodamin B ekleyin. </li></ol></li></ol> 3. Retina Diseksiyon <ol><li> Karanlık bir odada, karbon dioksit ve bilateral pnömotoraks kullanarak fare euthanize. 2 Sonra - karbondioksit kullanarak 3 dakika, fare bilincini kaybeder. </li><li> Fare artık kuyruk-çimdiği yanıt zaman hızlı bir şekilde gözler enükleasyonu ve bir plastik tabak soğuk kesme çözeltisi içine yerleştirin. Hayvanın ölümü sağlamak için ikili pnömotoraks gerçekleştirin. Hızla karanlık kutuya çanak göz saklayın. Karanlıkta prosedürü yürütmek için bir kızılötesi görüntüleyicisi kullanın. Not: Alternatif olarak, izofluran, dekapitasyon veya servikal dislokasyon ötenazi için kullanılabilir. ötenazi yöntemi Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) ve / veya Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallara uymalıdır. </li><li> Karanlık bir odada, diseksiyon mikroskobu ve kızılötesi aydınlatma ayarlayın. Mikroskop altında, 10 cm plastik tabak w içine çanak göz aktarınsoğutulmuş kesme solüsyon i. Sürekli boru içinden kabarcık oksijen plastik tabak altına yerleştirdi. Çok düşük değil yani akış sesini ayarlayın, ancak diseksiyon rahatsız kadar yüksek olmadığından emin olun. </li><li> Kornea ve lens temizleme: <ol><li> Bir mikro-cerrahi bıçakla kornea üstünde bir kesi yapmak. Göz küresinin diğer ucunda optik sinir tutarak hareket gözü engeller. Cerrahi bir makas kullanarak kesim uzatın. Etrafında bazı sklera ile kornea kesin. </li><li> Ince forseps ile objektif tut ve yavaşça lensi çekin. Vitreus lens çıkarmak için çok yapışkan ise, bir makas ile vitreus kesti. </li><li> Göz-fincan yapıldıktan sonra, yavaşça küçük bir transfer pipet ile Göz yuvası içine soğuk, oksijenli kesme çözümü dökün. NOT: Bir kesi korneada yapıldıktan sonra gözün çabuk söner. Bu pro sırasında göz deforme gibi göz şeklini korumak için önemlidirketencik retinaya zarar ve retina dekolmanı neden olacaktır. </li></ol></li><li> Retinanın dorsal ve ventral tarafı belirlenmesi: Not: yeşil ve morötesi (UV) düzensiz bir dağılım özel retina alanı belirleme 18 koniler için hafif tepki kayıtlar için önemlidir. <ol><li> Optik sinir başı yakınında geçen retina göz fincan karşısına gidiyor çizgi belirleyin. Bu hat, çoğunlukla optik sinirin ventral tarafında boyunca geçer; Diğer 19 ventral ise optik sinir dahil yan, sırt tarafı. Kızılötesi izleyiciler altında açıkça bu dönüm bakın. </li><li> Deney amacına bağlı olarak, gereksiz tarafında bir kesim yapmak. Bu göz fincan retina izole sonra yararlı olacaktır. </li></ol></li><li> Camsı kaldırma: <ol><li> İsteğe bağlı olarak, 15 dakika için hiyaluronidaz (0.5 mg / ml) ile göz fincan inkübe edilir. </li><li> Ekstra ince forseps ile vitrözü çıkarın. vitreus esasalt ve göz bardağın dış kenarına eklenerek. Yavaşça dokunmadan veya retina alay etmeden çıkarın. Vitreus sıkıca Göz yuvası takılı olabilir gibi, göz fincan retina dekolmanı önlemek için yavaşça çıkarın. Hiçbir gerginlik hissedilir kadar çekmeye devam edin. Not: Bu adım fare retinasına kesme için özellikle önemlidir; Bununla birlikte, bu tür sıçan veya salamanderin gibi diğer türlerin retinalarında için bir sorun değildir. </li></ol></li><li> Göz-fincan retina izole edin. Sklera tut ve yavaşça forseps ters kullanılarak retina soyulabilir. NOT: retina hazırlıkları Tüm montaj izole retina yapılabilir. Kenarlarda 3-4 kesim yapmak ve retina düzleştirmek ya da birkaç parçaya kesilmiş retina. </li><li> Retina Trim ve retinanın gereksiz yarısını atın (3.5 adım). Aynı plastik tabak, iki parçaya kalan retina kesti. Retinanın her parça için, bir yapmak için kenarları kesilmişretina döşeme ve katlama kenarları kırpın. </li><li> Büyük bir transfer pipeti (~ 2 mL) kullanılarak bir cam plaka üzerine bir retina levha aktarın. Küçük bir pipet ile aşırı çözümü Suck slab düzleştirmek için filtre kağıt parçası kullanın ve ardından hızla doku üstünde filtre membran bir parça koyun. <ol><li> Küçük bir transfer pipet kullanarak, filtre zarı üzerinde çözüm diseksiyon bir damla yerleştirin. Çözelti zarın yayılır kadar ~ 15 saniye bekleyin. Bu süre zarfında, retina dokusu filtre zarı sopa olacak. </li><li> Altında ve filtre etrafında daha soğuk diseksiyon çözüm dökün. Filtre membran ile retina dokusu yüzer. Bir forseps ile filtre membran tut ve dilimleme odasına yerleştirin. Doku üzerinde çözüm diseksiyon dökün ve karanlık kutuya hazırlık saklayın. NOT: Burada anlatılan prosedür önemlidir. Bu sağlamak için hızlı bir şekilde bu adımları gerçekleştirmek için önemli olduğunu filtre hafızasına retina dokusu sopabran ve kurumaz. </li></ol></li><li> Bir helikopter kullanarak, dilimler halinde retina dokusu kesti. Yaklaşık 200 mikron kalınlığında yama kelepçe çalışmaları için uygundur. </li><li> Dilimleme odasında gres raylar ile bir plastik lamel yerleştirin. Plastik lamel gres rayların üstünde bir retina dilim aktarın. Enine bölüm görünür şekilde dilim 90 ° döndürün. Daha sonra, lamel üzerine aşağı filtre membranı basın yağ ile filtre kağıdı tarafı kapsamaktadır. <ol><li> Dilim plastik lamel üzerinde hareketsiz sonra, lamel kapmak ve 35 mm plastik tabak aktarmak. Retina hazırlık üzerine soğuk diseksiyon çözüm dökün ve hazırlık daldırın. Sürekli oksijenli gereken karanlık kutunun her yemeğin, saklayın. NOT: Tüm prosedür filtre membran deforme etmeyecek şekilde dikkatli yapılması gerekiyor. Aksi takdirde, retina dilim kolayca filtre zarından ayrılır. </li></ol></li></ol><ol><li> Hazırlık Kayıt: <ol><li> Ames &#39;orta ile Başbakan perfüzyon tüpleri. Boru doldururken tüm kabarcıklar geçmesine izin verin. </li><li> Bir çektirmesi ile yama kelepçe kayıt pipetler olun. Pipet backfilled kadar 1 dakika boyunca bir pipet arka pipet çözeltisi, daldırma ile bir pipet doldurmak için. Sonraki, bir mikro-pipet dolgu kullanılarak pipet ~ 1/3 &#39;doldurunuz. Nemli pipet kutusu, her pipet saklayın. </li><li> Yama kelepçe kayıtları için ekipman açın; bilgisayar, amplifikatör, CCD kamera, mikroskop ve dahil. </li></ol></li><li> Oda ışığı kapatın. Kızılötesi görüntüleyici kullanarak mikroskop sahne odasının üzerine bir retina dilim hazırlık yerleştirin. Bu hareketsiz kılındıktan sonra, sürekli perfüzyon başlar. 33-37 ° C&#39;de perfüzyon sıcaklığını ayarlayın. </li><li> CCD kamera ile dilim yüzeyini görüntüleyin. Hedef yere odaklanın nerede hedef cell türleri bulunur. Yama kelepçe kayıt için sağlıklı görünümlü hücreyi seçin (örneğin, pürüzsüz görünümlü yüzey ve iyi bir hücre şekli olmalıdır). </li><li> Bir pipet tutucu bir kayıt pipet yerleştirin. Dilim hazırlık pipet Advance. Bu dilim hazırlama (~ yukarıdaki 2 mm) yakın olduğunda, mikroskop ile pipet ucu bulabilirsiniz. Pipet ucu mikroskop altında görülebilir sonra, hedef hücreye doğru ucu aşağı hareket ettirin. </li><li> Amplifikatör ayarlayın. (Sıfırlama) 0 mV / 0 pA de pipet ayarlayın ve 10 Hz ~ En ~ 5 mV sürekli elektrik darbe başlar. Pipet direnci kontrol edin; İdeal direnç çoğu retina nöronlar için 5 ila 10 MΩ olduğunu. </li><li> Ucundan dışarı üfleme başlayın. Bir ağızlık kullanın, ya da pipet banyo çözeltisi içine dips zaman pozitif basınç uygulamak için, bir şırınga kullanın. Ucu hedef hücrenin yüzeyinde kadar sürekli iç çözüm darbe. <ol><li> Pozitif basınç th küçük bir çukur yaptığındae hücre yüzeyi, biraz ucu ilerlemek ve üfleme durdurun. Artmalıdır pipet direnci, kontrol edin. Sürekli artıyorsa, bırakın ve&gt; 1 GΩ (gigaseal) ulaşıncaya kadar direnç izlemek. Direnç kendiliğinden artmaz ise bir gigaseal olana kadar, yavaşça negatif basınç uygulayın. </li></ol></li><li> Gigaseal gerçekleştirildikten sonra mV -70 için tutma potansiyeline değişir. Sonra, aralıklı pipet içindeki membran rüptürü negatif basınç uygulayın. Tam hücre konfigürasyonu yapıldığında, pipet direnci 500 MΩ ve 1 GΩ ve kapasitif akım görülmektedir arasında olabilir. Bazen spontan postsinaptik akımlar görülebilir. </li><li> -80 Den +40 mV IV ilişkisini kaydedin. Voltaj kapılı kanallar farklı tipte hücre tipine bağlı olarak aktive edilir. </li><li> Tutanak sinaptik akımları ya da gerilimleri ışık uyarılmış. </li></ol>

<ol>
	<li>Werblin, F. S., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+retina+of+the+mudpuppy,+Necturus+maculosus+II.+Intracellular+recording.">Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording.</a> J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Lukasiewicz, P., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+slowly+inactivating+potassium+current+truncates+spike+activity+in+ganglion+cells+of+the+tiger+salamander+retina.">A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).</li><li>Kaneko, A., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+L-glutamate+on+the+anomalous+rectifier+potassium+current+in+horizontal+cells+of+Carassius+auratus+retina.">Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina.</a> J Physiol. 358, 169-182 (1985).</li><li>Kamermans, M., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-mediated+positive+autofeedback+loop+controls+horizontal+cell+kinetics+in+tiger+salamander+retina.">GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).</li><li>Cook, P. B., McReynolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+inhibition+in+the+inner+retina+is+important+for+spatial+tuning+of+ganglion+cells.">Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).</li><li>Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+current+responses+in+rod+bipolar+cells,+cone+depolarizing+bipolar+cells+and+AII+amacrine+cells+in+dark-adapted+mouse+retina.">Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina.</a> J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).</li><li>Euler, T., Masland , R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+bipolar+cells+in+a+mammalian+retina).">Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina).</a> J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).</li><li>Berntson, A., Taylor , W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+characteristics+and+receptive+field+widths+of+on-bipolar+cells+in+the+mouse+retina.">Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina.</a> J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).</li><li>Sterling, P., Smith, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+for+a+binary+synapse.">Design for a binary synapse.</a> Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).</li><li>Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+nonlinear+glutamate+release+dynamics+at+bipolar+cell+synapses+in+the+mouse+retina.">Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina.</a> J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).</li><li>Dowling, J. E., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+retinal+dystrophy+in+the+rat.">Inherited retinal dystrophy in the rat.</a> J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).</li><li>Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A),+GABA(C)+and+glycine+receptor-mediated+inhibition+differentially+affects+light-evoked+signalling+from+mouse+retinal+rod+bipolar+cells.">GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells.</a> J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).</li><li>Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mode+of+retinal+presynaptic+inhibition+switches+with+light+intensity).">The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity).</a> J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).</li><li>Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+ON+cone+bipolar+cell+subtypes+in+temporal+coding+in+the+mouse+retina.">Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina.</a> J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).</li><li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature:+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency.">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li><li>Ames, A., Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system.">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li><li>Haverkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primordial,+blue-cone+color+system+of+the+mouse+retina.">The primordial, blue-cone color system of the mouse retina.</a> J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).</li><li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina.">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li><li>Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+screening+-+automated+patch+clamp+on+the+rise.">Ion channel screening - automated patch clamp on the rise.</a> Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Good recordings can only be achieved with good retinal preparations and well-designed patch clamp setups. Although all the steps described above are important, the discussion highlights some critical steps both for the dissection and recordings. 
For dissection, two things are especially important: cooling and oxygenation. After enucleating the eye, quickly remove the front part of the eye in a dissecting chamber with oxygen-bubbled, cooled dissecting solution, and pour cold solution into the ...

The retina is one of the unique parts of the nervous system. As an accessible part of the brain, its synaptic architecture has been well characterized. In addition, the functions of this neural network can be examined with a physiological stimulus: light. If the retinal tissue is isolated in a dark room with appropriate procedures, neurons in the tissue will respond to light. This preparation has been used to study visual signal processing and elucidate various synaptic mechanisms and neural network functions, as well as disease mechanisms. 
Light responses in retinal neurons have been recorded for decades. Early studies used sharp electrodes to make intracellular recordings from mudpuppy retinal neurons1. In the 1980s, the patch clamp technique was invented2, and soon became a popular method among vision researchers3,4. Single cell recordings from lower vertebrates, including mudpuppy and fish retinal neurons, were popular methods that contributed to the elucidation of visual signal processing mechanisms5,6. 
After genetic mutation techniques were developed, the mouse retina became a more popular model for vision researchers7-9. The mammalian retina is more attractive than that of lower vertebrates because it is evolutionarily closer to the human retina, and there is an opportunity to use disease models. However, mouse retinal cells are small and fragile10, and making retinal preparations and conducting patch clamp recordings in a dark room is challenging. As technology has improved, diverse approaches have become available to study visual signaling mechanisms such as imaging studies11 and the electroretinogram (ERG)12. Nevertheless, single cell recording with the patch clamp method is still important because it is highly temporally and spatially sensitive compared to other methods. Therefore, we have continuously conducted patch clamp recordings and improved our methods to investigate visual signal processing in mouse retinal slice preparations13-15.
In this video tutorial, the protocols are presented with important tips. Good recordings can only be achieved with good preparation. Practicing animal dissection and building a sturdy patch clamp rig will enable most researchers to achieve successful recordings.

<table><tbody><tr><td>Mice (28-60 days old, male)</td><td>Jackson laboratory</td><td>C57BL/6J strain</td><td></td></tr><tr><td>Ames&#039; medium powder</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Dissecting tool: forceps</td><td>Dumont</td><td>#4, #5, #55</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Dissecting tool: scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Dissecting tool: surgery knife</td><td>Surgistar</td><td>7514</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Razor blade (for chopper)</td><td>EMS</td><td>71970</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Chopper</td><td>handmade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrared viewer</td><td>Night Owl Optics</td><td>NOBG1</td><td>It shows bright view. Focusing small objects is an issue.</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td>excellent; makes consistent size pipettes.</td></tr><tr><td>Dark box</td><td>Pelican</td><td>dark box</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Patch clamp system</td><td>Scientifica</td><td>slice scope 2000</td><td>Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent.</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>multiclamp 700B</td><td>Excellent and easy control.</td></tr><tr><td>Acquiring software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp software</td><td>Excellent and easy control.</td></tr><tr><td>Light source (LED)</td><td>Cool LED</td><td>pE-2 4 channel system</td><td>Excellent</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Q-imaging</td><td>Retiga 2000</td><td>Excellent</td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td>handmade</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques

Retina görsel sisteme kapıdır. Görsel sinyal işleme mekanizmaları anlamak için, biz retina sinir ağı işlevlerini araştırmak. Ağda Retinal nöronlar çok sayıda alt-tiplerinin içermektedir. Bipolar hücreler, ganglion hücrelerinin ve amacrine hücrelerinin fazla 10 alt tipi morfolojik çalışmalarla tespit edilmiştir. Retina nöronlarının birden fazla alt tipleri, hareket ve renk, görsel sinyal belirgin özellikler, kodlayan ve birden çok sinir yolları oluşturmak üzere düşünülmektedir. Bununla birlikte, görsel sinyal işleme her bir nöronun fonksiyonel rolleri tam olarak anlaşılmış değildir. yama kelepçe yöntemi bu temel soruyu ele almak yararlıdır. Burada, bir protokol sağlanır koyu adapte koşullarda yama kelepçe kayıtları kullanarak fare retina nöronlar ışık uyarılmış sinaptik yanıtları kaydetmek için. Fare gözler O / N koyu adapte olup, retina dilim hazırlıkları kızılötesi aydınlatma ve izleyiciler kullanarak karanlık bir odada disseke edilir. Kızılötesi ışık yokFare fotoreseptörleri etkinleştirmek ve böylece ışık yanıt korur. Patch kelepçe retina nöronlar ışık uyarılmış yanıtları kaydetmek için kullanılır. Bir floresan boya nöronal morfolojik alt tipleri karakterize etmek kayıtları sırasında enjekte edilir. Bu prosedür, fare retinanın her nöronun fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bize sağlar.

Bir temsilci dilim dilim hazırlama hazırlama düz bir yüzeye ganglion hücrelerinin fotoreseptörleri gösteren, düz konumda. Şekil 1&#39;de gösterildiği ve filtre kağıdı hiçbir dekolmanı olduğu. Bir dilim hareket ettirildiğinde ise, hazırlık sadece bir parçası zor yama sıkma için uygun bir hücreyi tanımlamak için yapar, odak olduğunu. Kayıtları için, genellikle parlak yüzeye sahip iyi bir soma, bir hatta yuvarlak şekil ve görünür hiçbir karanlık plaklar seçmek önemli...

Watch this Scientific Journal Video about Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques at JoVE.com

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

recording-light-evoked-postsynaptic-responses-neurons-dark-adapted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K Görüntüleme.  Wayne State University School of Medicine. We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Video: Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Nörobilim

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Biyoloji

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices

Source: Hellmer, C. B., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52422">Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the recording of light-evoked post-synaptic responses in a dark-adapted mouse retinal tissue slice preparation. The retinal slice is placed in a recording chamber, and a recording pipette is used to establish electrical continuity with a retinal ganglion cell. Light pulses are applied to generate excitatory post-synaptic potentials in the ganglion cells, which are recorded by the pipette.

Fare Retina Dilimlerinin Nöronlarında Işık Uyarılmış Postsinaptik Yanıtlar

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Experimental ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

Source: Richevaux, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59534">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

Fare hipokampal dilimlerindeki nöronların fotostimülasyon ve tam hücre yama kelepçesi kayıtları

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Solutions for acute slice ...

Electrophysiology Techniques

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

Source: Kinnavane, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63077">Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

Sıçan Beyin Dilimlerinde Sinaptik Olayların Optogenetik Stimülasyonu ve Elektrofizyolojik Kaydı

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Electrophysiology and ...