This work was supported by NIH R01 EY020533, WSU Startup Fund, and RPB grants.

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Wayne State University zugelassen. 1. Vorbereitung der Versuchslösung <ol><li> Vorbereiten des Präparationslösung 1 Tag bis 1 Woche vor dem eigentlichen Experiment. Verwenden Sie ein HEPES-Pufferlösung für die Netzhaut Dissektion wegen seiner starken Pufferfähigkeit bei niedrigen Temperaturen 16. Mischen Sie alle Chemikalien wie folgt (in mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,0 MgCl 2, 10 HEPES, 28 Glucose. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH. Die Lösung wird in einem Kühlschrank bis zu 1 Woche. </li><li> Aufzeichnungslösung ist Ames &#39;Medium, das eine künstliche Rückenmarksflüssigkeit (aCSF) für die Netzhautpräparate 17 ausgelegt ist. Mit dem Tag des Experiments abzuwiegen Ames-Pulver (4,4 g für 500 ml Lösung) in einem Rohr. Auch abwiegen NaHCO 3 (0,95 g für 500 ml Lösung) und mit der A mischenmes &quot;Pulver. </li><li> Bereiten Sie die intrazellulären Pipette Lösung für Patch Clamp Messungen von der Tag des Experiments. Mischen Sie alle Chemikalien wie folgt (in mM): 111 K-Gluconat, 1,0 CaCl 2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 NaCl, 1.0 MgCl2, 5 ATP-Mg und 1,0 GTP-Na. PH-Wert auf 7,2 mit KOH. Filtern der Pipettenlösung mit einem herkömmlichen Spritzenfilter. Stellen Sie ~ 500 ul Aliquots und speichern sie in einem Gefrierschrank oder eine Tiefkühltruhe. </li></ol> 2. Vorbereitung für den Tag der Experiment <ol><li> In der Nacht vor dem Experiment, legen Sie eine Maus in einen Käfig (C57BL / 6J oder ähnlichen Hintergrund, 4 - 8 Wochen alt, männlich) in einem dunklen Raum für O / N Dunkeladaptation. </li><li> Vorbereitung für die Präparation: <ol><li> Füllen Sie sezieren Lösung (100 - 200 ml) in einem Becherglas, legen Sie es auf Eis und Blase mit Sauerstoff für mindestens 10 min. </li><li> Starten Sie die Sauerstoffversorgung des dunklen Kasten Netzhautvorbereitung Lagerung. </li><li> Bereiten Kunststoffdeckgläser mit Fett Schienen für WiederDarm-Schnittpräparate und legen Sie jeden von ihnen in einem 35-mm-Kunststoffschale. </li><li> Setzen Sie eine neue Rasierklinge zu einem Chopper (Gewebeschneidemaschine). </li><li> Schneiden Sie einen Filtermembran in zwei Hälften. Dies ist für die Netzhaut-Schneiden. </li><li> Richten Sie die Sezieren Werkzeuge und Transferpipetten in der Nähe des Binokular. Der Arbeitsbereich ist auch so gestaltet sein, dass jedes Werkzeug kann im Dunkeln leicht zugegriffen werden. </li></ol></li><li> Vorbereitung für die Patch-Clamp-Aufnahmen: <ol><li> Löse Ames Pulver und NaHCO 3 in destilliertem Wasser (Ames 4,4 g und 0,95 g NaHCO 3/500 ml ddH 2 O). Blasen AMES &#39;Medium mit gemischten Sauerstoff (95% O 2 und 5% CO 2) für mindestens 30 min unter Erwärmen auf einem Aufzeichnungstemperaturniveau (~ 35 ° C). Den pH-Wert auf 7,4 mit NaHCO 3, während immer noch sprudelt. </li><li> Tauen Sie den internen Pipettenlösung während der Präparation. Nachdem es aufgetaut ist, fügen 0,01% Sulforhodamin B für die intrazelluläre Färbung. </li></ol></li></ol> 3. Netzhaut Dissection <ol><li> In einem dunklen Raum, einschläfern der Maus unter Verwendung von Kohlendioxid und bilaterale Pneumothorax. Nach 2 - 3 min mit dem Kohlendioxid, wird die Maus das Bewusstsein verlieren. </li><li> Wenn die Maus reagiert nicht mehr auf einem Schwanz kneifen, schnell die Augen enukleiert und legen Sie sie in einem kalten Sektions Lösung in einer Kunststoffschale. Führen Sie die bilateralen Pneumothorax zum Tode des Tieres sicherzustellen. Schnell speichern das Auge in die Schüssel in der Dunkelheit ein. Verwenden Sie eine Infrarot-Viewer, um das Verfahren in der Dunkelheit zu führen. HINWEIS: Alternativ Isofluran, Enthauptung oder Genickbruch für Euthanasie verwendet werden. Die Methode der Euthanasie sollte die Leitlinien des National Institute of Health (NIH) und / oder der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss folgen. </li><li> In einem dunklen Raum, stellen Sie den Binokular und Infrarotbeleuchtung. Unter dem Mikroskop über ein Auge aus seiner Schale in eine 10 cm Plastikschale wit dem Sezieren Lösung gekühlt. Kontinuierlich Blase Sauerstoff durch das Rohr auf dem Boden des Kunststoffschale gegeben. Die Durchflussvolumen, damit es nicht zu gering, aber sicherzustellen, dass sie nicht hoch genug ist, um die Dissektion zu stören. </li><li> Hornhaut und Linse entfernen: <ol><li> Einen Einschnitt auf der Oberseite der Hornhaut mit einem mikrochirurgischen Messer. Halten des Sehnervs am anderen Ende des Augapfels verhindert das Auge bewegt. Erweitern Sie den Schnitt mit einem Paar chirurgische Schere. Schneiden Sie die Hornhaut mit einigen Lederhaut um ihn herum. </li><li> Schnappen Sie sich die Linse mit einer feinen Pinzette und ziehen Sie das Objektiv langsam aus. Wenn der Glaskörper zu klebrig ist, um die Linse zu entfernen, schneiden Sie den Glaskörper mit einer Schere. </li><li> Sobald die Augenmuschel gemacht wird, sanft gießen Sie kaltes, sauerstoff Sezieren Lösung in die Augenmuschel mit einem kleinen Transferpipette. HINWEIS: Der Augapfel schnell entleert, nachdem ein Einschnitt in der Hornhaut vorgenommen. Es ist wichtig, die Form des Auges, wie Verformen des Auges während dieser Pro aufrechtzuerhaltenverfahren wird die Netzhaut beschädigen und zu einer Netzhautablösung. </li></ol></li><li> Die Ermittlung der dorsalen und ventralen Seiten der Netzhaut: HINWEIS: Aufgrund der ungleichen Verteilung der grünen und der ultravioletten (UV) Kegel 18, Identifizierung einer bestimmten Netzhautbereich ist wichtig für die Lichtreaktion Aufnahmen. <ol><li> Identifizieren Sie die Linie, die über die Netzhaut-Augenmuschel vorbei an der Papille. Diese Linie verläuft meist auf der Bauchseite des Sehnerven; die Seite inklusive der Sehnerv ist die Rückenseite, während der andere ventral 19. Sehen Sie dieses Wahrzeichen deutlich unter Infrarot Zuschauer. </li><li> Je nach dem Zweck des Versuchs, einen Schnitt an der unnötige Neben. Dies kann hilfreich nach Trennen der Netzhaut von der Augenmuschel ist. </li></ol></li><li> Glaskörperentfernung: <ol><li> Optional inkubieren Sie die Augenmuschel mit Hyaluronidase (0,5 mg / ml) für 15 min. </li><li> Entfernen Sie den Glaskörper mit extra feinen Pinzette. Der Glaskörper ist in erster Linieauf dem Boden und der Außenkante der Okularmuschel angebracht. Entfernen Sie sie ohne sie zu berühren oder stoßen die Netzhaut. Da die Glaskörper kann fest an der Augenmuschel befestigt werden, entfernen Sie vorsichtig, um eine Netzhautablösung von der Augenmuschel zu vermeiden. Weiter zu ziehen, bis keine Spannung erreicht ist. Anmerkung: Dieser Schritt ist besonders wichtig für Sezieren der Mausretina; es ist jedoch kein Problem für den Netzhäuten von anderen Spezies, wie Ratten und Salamander. </li></ol></li><li> Isolieren Sie die Netzhaut von der Augenmuschel. Besorgen Sie sich die Lederhaut und sanft ziehen Sie die Netzhaut unter Verwendung der Rückseite der Zange. HINWEIS: Whole-Mount-Netzhaut-Präparate können aus der isolierten Netzhaut durchgeführt werden. Stellen Sie drei vor vier Schnitte an den Kanten und glätten die Netzhaut, oder schneiden Sie die Netzhaut in mehrere Stücke. </li><li> Schneiden Sie die Netzhaut und entsorgen Sie die unnötige Hälfte der Netzhaut (Schritt 3.5). Im gleichen Kunststoffschale, schneiden Sie die restlichen Netzhaut in zwei Stücke. Für jedes Stück der Netzhaut, schneiden Sie die Ränder um ein zu machenNetzhaut-Platte, und schneiden Sie die Falzkanten. </li><li> Übertragen einer Netzhaut-Platte auf eine Glasplatte mit einem großen Transferpipette (~ 2 ml). Saugen Sie die überschüssige Lösung mit einer kleinen Pipette, mit einem Stück Filterpapier, um die Platte zu glätten, und dann schnell legen Sie ein Stück der Filtermembran auf der Oberseite des Gewebes. <ol><li> Mit einem kleinen Transfer Pipette einen Tropfen Sezieren Lösung auf der Filtermembran. Warten Sie ca. 15 Sekunden, bis die Lösung erstreckt sich über der Membran. Während dieser Zeit wird das Netzhautgewebe, um die Filtermembran haften. </li><li> Pour mehr kalte Sezieren Lösung unter und um den Filter. Das Retinagewebes mit der Filtermembran wird schwimmen. Besorgen Sie sich die Filtermembran mit einer Pinzette und legen Sie sie in der Schneidkammer. Gießen Sie sezieren Lösung über das Gewebe, und speichern Sie die Zubereitung in der Dunkelheit ein. HINWEIS: Das hier beschriebene Verfahren ist von entscheidender Bedeutung. Es ist wichtig, diese Schritte schnell durchzuführen, um sicherzustellen, daß die Netzhautgewebe klebt an den Filter memBrane und trocknet nicht aus. </li></ol></li><li> Mit einem Chopper, schneiden Sie das Netzhautgewebe in Scheiben schneiden. Rund 200 um Dicke machbar für Patch-Clamp-Studien. </li><li> Legen Sie eine Kunststoff-Deckglas mit Fett Schienen im Schneideraum. Übertragen einer Netzhaut-Scheibe auf der Oberseite der Fett Schienen auf einer Kunststoffdeckglas. Drehen Sie die Scheibe um 90 °, so dass der Querschnitt zu sehen ist. Drücken Sie die Filtermembran nach unten auf das Deckglas, dann decken Sie die Seiten des Filterpapier mit Fett. <ol><li> Nachdem die Scheibe auf einer Kunststoffdeck immobilisiert, schnappen Sie das Deckglas und überträgt es auf einer 35 mm Kunststoffschale. Gießen Sie kaltes Sezieren Lösung auf die Netzhaut-Vorbereitung und tauchen die Vorbereitung. Bewahren Sie die Schale in den dunklen Kasten, der kontinuierlich mit Sauerstoff angereichert werden soll. ANMERKUNG: Das gesamte Verfahren muss sorgfältig durchgeführt, so dass die Filtermembran nicht deformiert werden. Andernfalls wird der retinaler Scheibe leicht trennt von der Filtermembran. </li></ol></li></ol><ol><li> Aufnahme der Zubereitung: <ol><li> Prime die Perfusionsschläuche mit Ames &#39;Medium. Lassen Sie alle Blasen passieren beim Füllen der Schläuche. </li><li> Stellen Sie Patch-Clamp-Aufzeichnung Pipetten mit einem Abzieher. Um eine Pipette mit der Pipettenlösung, Sprung in die Rückseite einer Pipette 1 min zu füllen, bis die Pipettenspitze aufgefüllt. Als nächstes füllen ~ 1/3 der Pipette mit einer Mikropipette Füllstoff. Bewahren Sie die Pipette in einem feuchten Pipettenfeld. </li><li> Schalten Sie die Geräte für Patch-Clamp-Aufnahmen; einschließlich des Computers, Verstärker, CCD-Kamera und Mikroskop. </li></ol></li><li> Schalten Sie die Raumbeleuchtung. Setzen Sie ein Netzhaut-Schnittpräparat auf den Mikroskoptisch Kammer mit einem Infrarot-Betrachter. Nachdem es immobilisiert ist, beginnen kontinuierliche Perfusion. Stellen Sie die Perfusion Temperatur bei 33 bis 37 ° C. </li><li> Sehen Sie sich die Scheibenoberfläche mit der CCD-Kamera. Konzentrieren Sie sich auf die Zielposition, wo das Ziel cell Arten befinden. Wählen Sie eine gesund aussehende Zelle für Patch-Clamp-Aufzeichnung (dh es sollte glatt aussehende Oberfläche und eine gute Zellform haben). </li><li> Legen Sie eine Aufnahme Pipette in einer Pipettenhalter. Voraus die Pipette auf die Schnittpräparat. Wenn es in der Nähe der Schnittpräparat (~ 2 mm oben) finden die Spitze der Pipette mit dem Mikroskop. Sobald der Pipettenspitze ist unter dem Mikroskop sichtbar ist, bewegen Sie die Spitze nach unten in Richtung der Zielzelle. </li><li> Stellen Sie den Verstärker. Stellen Sie die Pipette bei 0 mV / pA 0 (Nullstellung) und starten Sie einen kontinuierlichen elektrischen Impuls von ca. 5 mV bei ~ 10 Hz. Prüfen Sie die Pipette Widerstand; idealen Widerstand zwischen 5 und 10 M für die meisten Netzhautneuronen. </li><li> Starten Ausblasen von der Spitze. Verwenden Sie ein Mundstück, oder verwenden Sie eine Spritze, um Überdruck anzuwenden, wenn die Pipette taucht in der Badlösung. Kontinuierlich Ausblasen der internen Lösung, bis die Spitze ist auf der Oberfläche der Zielzelle. <ol><li> Wenn der Überdruck macht einen kleinen Grübchen auf the Zelloberfläche, voranzutreiben die Spitze leicht und Stop Ausblasen. Prüfen Sie die Pipette Widerstand, der zu erhöhen sollte. Wenn es ständig zu, lassen Sie es und Überwachung der Resistenz bis&gt; 1 G (Giga) erreicht. Wenn der Widerstand nicht spontan zu erhöhen, leicht negativen Druck ausüben, bis es eine undurchlässige. </li></ol></li><li> Nach dem Gigaseal erreicht ist, ändern Sie die Haltepotential auf -70 mV. Dann intermittierenden negativen Druck, um die Membran im Inneren der Pipettenspitze Bruch anzuwenden. Wenn der Gesamtzellkonfiguration hergestellt ist, kann die Pipettenwiderstand zwischen 500 MOhm und 1 GOhm, und der kapazitive Strom zu sehen sein. Manchmal spontane postsynaptischen Ströme beobachtet werden kann. </li><li> Notieren Sie sich die IV-Beziehung von -80 bis +40 mV. Verschiedene Typen von spannungsabhängigen Kanäle aktiviert je nach Zelltyp. </li><li> Nehmen Licht-evozierte synaptische Ströme oder Spannungen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Good recordings can only be achieved with good retinal preparations and well-designed patch clamp setups. Although all the steps described above are important, the discussion highlights some critical steps both for the dissection and recordings. 
For dissection, two things are especially important: cooling and oxygenation. After enucleating the eye, quickly remove the front part of the eye in a dissecting chamber with oxygen-bubbled, cooled dissecting solution, and pour cold solution into the ...

The retina is one of the unique parts of the nervous system. As an accessible part of the brain, its synaptic architecture has been well characterized. In addition, the functions of this neural network can be examined with a physiological stimulus: light. If the retinal tissue is isolated in a dark room with appropriate procedures, neurons in the tissue will respond to light. This preparation has been used to study visual signal processing and elucidate various synaptic mechanisms and neural network functions, as well as disease mechanisms. 
Light responses in retinal neurons have been recorded for decades. Early studies used sharp electrodes to make intracellular recordings from mudpuppy retinal neurons1. In the 1980s, the patch clamp technique was invented2, and soon became a popular method among vision researchers3,4. Single cell recordings from lower vertebrates, including mudpuppy and fish retinal neurons, were popular methods that contributed to the elucidation of visual signal processing mechanisms5,6. 
After genetic mutation techniques were developed, the mouse retina became a more popular model for vision researchers7-9. The mammalian retina is more attractive than that of lower vertebrates because it is evolutionarily closer to the human retina, and there is an opportunity to use disease models. However, mouse retinal cells are small and fragile10, and making retinal preparations and conducting patch clamp recordings in a dark room is challenging. As technology has improved, diverse approaches have become available to study visual signaling mechanisms such as imaging studies11 and the electroretinogram (ERG)12. Nevertheless, single cell recording with the patch clamp method is still important because it is highly temporally and spatially sensitive compared to other methods. Therefore, we have continuously conducted patch clamp recordings and improved our methods to investigate visual signal processing in mouse retinal slice preparations13-15.
In this video tutorial, the protocols are presented with important tips. Good recordings can only be achieved with good preparation. Practicing animal dissection and building a sturdy patch clamp rig will enable most researchers to achieve successful recordings.

<table><tbody><tr><td>Mice (28-60 days old, male)</td><td>Jackson laboratory</td><td>C57BL/6J strain</td><td></td></tr><tr><td>Ames&#039; medium powder</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Dissecting tool: forceps</td><td>Dumont</td><td>#4, #5, #55</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Dissecting tool: scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Dissecting tool: surgery knife</td><td>Surgistar</td><td>7514</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Razor blade (for chopper)</td><td>EMS</td><td>71970</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Chopper</td><td>handmade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrared viewer</td><td>Night Owl Optics</td><td>NOBG1</td><td>It shows bright view. Focusing small objects is an issue.</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td>excellent; makes consistent size pipettes.</td></tr><tr><td>Dark box</td><td>Pelican</td><td>dark box</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Patch clamp system</td><td>Scientifica</td><td>slice scope 2000</td><td>Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent.</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>multiclamp 700B</td><td>Excellent and easy control.</td></tr><tr><td>Acquiring software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp software</td><td>Excellent and easy control.</td></tr><tr><td>Light source (LED)</td><td>Cool LED</td><td>pE-2 4 channel system</td><td>Excellent</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Q-imaging</td><td>Retiga 2000</td><td>Excellent</td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td>handmade</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques

Die Netzhaut ist das Tor zu den visuellen Systems. Zur visuellen Signalverarbeitung Mechanismen zu verstehen, untersuchen wir retinale neuronalen Netzwerkfunktionen. Retinalen Neuronen in dem Netzwerk umfassen eine Reihe von Subtypen. Mehr als 10 Subtypen der bipolaren Zellen, Ganglienzellen und Amakrinzellen wurden durch morphologische Studien identifiziert. Mehrere Subtypen von retinalen Neuronen sind gedacht, um unterschiedliche Merkmale der visuellen Signalisierung, wie Bewegung und Farbe zu codieren, und bilden mehrere Nervenbahnen. Jedoch sind die funktionalen Rollen von jedem Neuron in der visuellen Signalverarbeitung nicht vollständig verstanden. Die Patch-Clamp-Methode ist hilfreich, diese grundlegende Frage zu beantworten. Hier ist ein Protokoll, um Licht-evozierte synaptische Antworten in Maus retinalen Neuronen mit Patch-Clamp-Aufnahmen im dunkeladaptierten Bedingungen aufnehmen wird. Die Maus Augen sind dunkeladaptierten O / N, und Netzhautschnittpräparate werden in einem dunklen Raum mit Infrarotbeleuchtung und Zuschauer seziert. Infrarotlicht nichtAktivieren Maus Photorezeptoren und damit bewahrt ihr Licht Reaktionsfähigkeit. Patch-Clamp verwendet, um Licht hervorgerufenen Reaktionen in retinalen Neuronen aufzuzeichnen. Ein Fluoreszenzfarbstoff während Aufnahmen auf neuronale morphologischen Subtypen charakterisieren injiziert. Dieses Verfahren ermöglicht es, die physiologischen Funktionen von jedem Neuron in der Maus-Retina zu bestimmen.

Eine repräsentative Schnittpräparat ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Schnittpräparat in einer geraden Position, welche Photorezeptoren Ganglionzellen in einer flachen Oberfläche, und keine Ablösung vom Filterpapier. Wenn eine Scheibe geneigt ist, ist nur ein Teil der Vorbereitung im Fokus, was es schwierig macht, eine geeignete Zelle für Patch-Clamp identifizieren. Für Aufnahmen ist es wichtig, eine gute Soma, die in der Regel hat eine glänzende Oberfläche, eine gleichmäßige runde Form, un...

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Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

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Serie: Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Biologie

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Gleichzeitige Ganzzellableitungen von Photorezeptoren und Neuronen zweiter Ordnung in eine Amphibie Retinal Scheibe Vorbereitung

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch-Clamp-Aufzeichnung von Starburst-Amakrinzellen in einer Wohnung Montage Herstellung von Deafferentated Maus Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices

Source: Hellmer, C. B., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52422">Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the recording of light-evoked post-synaptic responses in a dark-adapted mouse retinal tissue slice preparation. The retinal slice is placed in a recording chamber, and a recording pipette is used to establish electrical continuity with a retinal ganglion cell. Light pulses are applied to generate excitatory post-synaptic potentials in the ganglion cells, which are recorded by the pipette.

Lichtevozierte postsynaptische Reaktionen in Neuronen von Netzhautschnitten von Mäusen

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Experimental ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

Source: Richevaux, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59534">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

Photostimulation und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Neuronen in Hippocampus-Schnitten der Maus

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Solutions for acute slice ...

Electrophysiology Techniques

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

Source: Kinnavane, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63077">Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

Optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung synaptischer Ereignisse in Hirnschnitten von Ratten

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Electrophysiology and ...