This work was supported by NIH R01 EY020533, WSU Startup Fund, and RPB grants.

윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 절차는 웨인 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 실험 솔루션 1. 준비 <ol><li> 실제 실험 전에 해부 솔루션을 일일 1 주를 준비합니다. 때문에 낮은 온도 (16)에서 강력한 완충 능력 망막 박리에 대한 HEPES 완충 용액을 사용합니다. (mm 단위)으로는 다음과 모든 화학 물질을 혼합 : 115의 NaCl, 2.5의 KCl, 2.5 CaCl2를, 1.0의 MgCl 2, 10 HEPES, 28 포도당을. NaOH로 pH 7.4까지를 조정합니다. 일주에 냉장고까지의 솔루션을 유지합니다. </li><li> 기록 액 망막 17 제제 용으로 설계된 인공 뇌척수액 (ACSF)이다 에임스 &#39;매체이다. 실험의 날에 의해, 튜브에 복귀 돌연변이 분말 (500 ml의 용액 4.4 g)을 달아. 또한,의 NaHCO3 (500 ml의 솔루션을위한 0.95 g)을 달아 및 혼합MES &#39;분말. </li><li> 실험의 날에 의해 패치 클램프 레코딩을위한 세포 내 피펫 솔루션을 준비합니다. (mm 단위)으로는 다음과 모든 화학 물질을 혼합 : 111 K 글루코 네이트, 1.0 CaCl2를, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10의 NaCl, 1.0의 MgCl 2, 5 ATP-㎎, 1.0 GTP - 나. KOH으로 pH를 7.2로 조정합니다. 기존의 주사​​기 필터 피펫 솔루션을 필터링합니다. ~ 500 μL 씩을 확인하고 냉장고 나 냉동고에 보관합니다. </li></ol> 실험의 날 2. 준비 <ol><li> O / N 어두운 적응 어두운 공간에서 - (남, 8 주 오래 된 4, C57BL / 6J 또는 유사한 배경) 밤은 실험 전에, 새장에 마우스를 놓습니다. </li><li> 해부를위한 준비 : <ol><li> 적어도 10 분 동안 산소, 유리 비커에 - (200 ml의 100) 얼음에 배치, 거품 솔루션을 해부 입력합니다. </li><li> 망막 준비 저장 어둠 상자의 산소를 시작합니다. </li><li> 재에 대한 그리스 레일 플라스틱 커버 슬립을 준비tinal 슬라이스 제제는 35mm 플라스틱 접시에 이들 각각을 놓고. </li><li> 헬기 (조직 슬라이서)에 새로운 면도날을 연결합니다. </li><li> 두 반으로 여과막을 잘라. 이것은 망막 슬라이스입니다. </li><li> 해부 현미경 근처 해부 도구 및 전송 피펫을 맞 춥니 다. 각 도구를 쉽게 어두운 액세스 할 수 있도록 작업 영역은 잘 조직되어야한다. </li></ol></li><li> 패치 클램프 레코딩을위한 준비 : <ol><li> 에임스 &#39;가루와 증류수의 NaHCO3 (에임스 4.4 g 및 NaHCO3을 0.95g / 500㎖의 DDH 2 O)를 용해. 혼합 산소 버블 에임스 중형 (95 % O 2 및 5 % CO 2) 적어도 30 분 동안 기록 온도 레벨로 가열 (~ 35 ° C). 아직 버블 링 동안의 NaHCO3와 7.4 pH를 조정합니다. </li><li> 해부하는 동안 내부 피펫 솔루션을 녹여. 해동 후 세포 내 염색 0.01 %의 sulforhodamine의 B를 추가합니다. </li></ol></li></ol> 3. 망막 해부 <ol><li> 어두운 방에서, 이산화탄소를 이용하여 양측 기흉 마우스를 안락사. 2 - 후 이산화탄소를 사용하여 3 분간, 마우스가 의식을 잃게 될 것이다. </li><li> 마우스가 더 이상 꼬리 핀치에 응답 할 때, 신속하게 눈을 명백히하다 없으며 플라스틱 접시에 차가운 해부 솔루션에 배치합니다. 동물의 죽음을 확인하기 위해 양측 기흉을 수행합니다. 빨리 어둠 상자에 접시에 눈을 저장합니다. 어둠의 절차를 수행하기 위해 적외선 뷰어를 사용합니다. 참고 : 또는 이소 플루 란, 참수, 또는 자궁 경부 전위는 안락사에 사용할 수 있습니다. 안락사의 방법은 국립 보건 연구소 (NIH) 및 / 또는 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침을 따라야합니다. </li><li> 어두운 방에서, 해부 현미경 및 적외선 조명을 조정합니다. 현미경, 10cm 플라스틱 접시 w로 그 접시에서 눈을 전송냉각 해부 솔루션 i 번째. 지속적으로 튜브를 통해 거품 산소는 플라스틱 접시의 바닥에 배치. 너무 부족하지 않도록 유량을 조절하지만 절개를 방해 충분하지 있는지 확인합니다. </li><li> 각막과 렌즈 제거 : <ol><li> 마이크로 수술 칼 각막의 상단에 절개를합니다. 안구의 다른 쪽 끝에서 시신경을 잡고 이동하는 현상을 방지 할 수 있습니다. 수술 가위를 사용하여 절단을 확장합니다. 주위 몇 공막과 각막을 잘라. </li><li> 미세 집게로 렌즈를 잡고 천천히 렌즈를 빼냅니다. 유리체가 렌즈를 분리하기에 너무 끈적 경우 가위로 절단 유리체. </li><li> 눈 컵이 이루어지면, 부드럽게 작은 전송 피펫과 아이 컵에 차가운, 산소 해부 솔루션을 붓는다. 참고 : 절개가 각막을 한 후 안구가 빠르게 움 추러 들게합니다. 그것은이 프로시 변형 눈으로 눈의 형상을 유지하는 것이 중요시저는 망막이 손상되어 망막 박리의 원인이됩니다. </li></ol></li><li> 망막의 지느러미와 복부 측면을 확인 : 참고 : 녹색 및 자외선 (UV)의 불균일 한 분포가 특정 망막 영역을 식별, 18 콘 때문에 빛 응답 레코딩을위한 중요합니다. <ol><li> 시신경 유두 근처에 전달하는 망막 아이 컵을 가로 질러가는 라인을 확인합니다. 이 라인은 주로 시신경의 복부 측면을 가로 질러 통과; 다른 19 복부 동안 시신경 포함 측은 등쪽이다. 적외선 뷰어에서 명확 랜드 마크를 참조하십시오. </li><li> 실험의 목적에 따라, 불필요한 측을 잘라. 이것은 아이 컵으로부터 망막을 분리 후 유용 할 것이다. </li></ol></li><li> 유리체 제거 : <ol><li> 선택적으로, 15 분 동안 히알루로니다 제 (0.5 ㎎ / ㎖)와 눈 컵을 배양한다. </li><li> 여분의 미세 집게로 유리체를 제거합니다. 유리체는 주로바닥과 눈 컵의 바깥 쪽 가장자리에 연결합니다. 조심스럽게 만지거나 망막을 파고하지 않고 제거합니다. 유리체가 단단히 아이 컵에 부착 할 수 있듯이, 눈 컵에서 망막 박리를 방지하기 위해 조심스럽게 제거합니다. 더 긴장 느낌되지 않을 때까지 당겨 계속합니다. 주 :이 단계는 마우스를 해부 망막 특히 중요하다; 그러나, 이러한 쥐 또는 도마뱀 같은 다른 종의 망막에 대한 문제가 아니다. </li></ol></li><li> 눈 컵에서 망막을 분리합니다. 공막을 잡고 부드럽게 집게의 뒷면을 사용하여 망막을 벗겨. 참고 : 망막 준비를 전체 마운트는 분리 된 망막에서 할 수있다. 가장자리에서 3-4 컷을 확인하고 망막을 평평하게, 또는 여러 조각으로 망막을 잘라. </li><li> 망막 트림 및 망막의 불필요한 절반을 버리고 (단계 3.5). 같은 플라스틱 접시에 두 조각으로 남아있는 망막을 잘라. 망막의 각 부분의 경우, 수 있도록 가장자리를 잘라망막 슬래브 및 접는 자리를 떼어. </li><li> 큰 전송 피펫 (~ 2 ㎖)를 사용하여 유리 접시에 망막 슬래브를 전송합니다. 작은 피펫으로 용액을 과량 빨아 슬래브를 평탄화 여과지를 사용하고 빠르게 조직 위에 여과막의 조각을 배치. <ol><li> 작은 전송 피펫을 사용하여 필터 멤브레인 솔루션을 해부 한 방울을 배치합니다. 이 솔루션은 막 퍼져 때까지 ~ 15 초를 기다립니다. 이 시간 동안, 망막 조직 여과막 고집한다. </li><li> 아래의 필터 주위에 더 차가운 해부 솔루션을 붓는다. 여과막과 망막 조직이 뜬다. 집게로 필터 멤브레인을 잡고 슬라이스 챔버에 배치합니다. 조직을 통해 솔루션을 해부 붓고, 어두운 상자에 준비를 저장합니다. 참고 : 여기에 설명 된 절차는 매우 중요하다. 그것은 보장하기 위해 신속하게 다음 단계를 수행하는 것이 중요하다 필터 (MEM)에 망막 조직 스틱파괴 현상과 건조하지 않습니다. </li></ol></li><li> 헬기를 사용하여 조각으로 망막 조직을 잘라. 약 200 μm의 두께는 패치 클램프 연구 가능하다. </li><li> 슬라이스 챔버 그리스 레일 플라스틱 커버 슬립을 놓습니다. 플라스틱 커버 슬립에 그리스 레일 위에 망막 슬라이스를 전송합니다. 횡단면 볼 수 있도록 슬라이스를 90 ° 회전합니다. 다음, 커버 슬립에 내려 여과막을 눌러 그리스 여과지의 측면을 커버. <ol><li> 슬라이스가 플라스틱 커버 슬립 상에 고정화 된 후, 커버 슬립을 잡아 35mm 플라스틱 접시에 옮긴다. 망막 준비 위에 차가운 해부 솔루션을 붓고 준비 잠수함. 지속적으로 산소해야 어두운 상자에 각각의 접시를 저장합니다. 주 : 전체 절차는 여과막이 변형되지 않도록 조심스럽게 수행되어야한다. 그렇지 않으면, 슬라이스 망막 용이 여과막으로부터 분리한다. </li></ol></li></ol><ol><li> 준비 기록 : <ol><li> 에임스 &#39;매체와 총리는 관류 튜브. 튜브를 채울 때 모든 거품이 통과하도록 허용합니다. </li><li> 풀러와 패치 클램프 녹음 피펫을 확인합니다. 피펫 팁이 채워 때까지 1 분 동안 피펫의 뒷면에있는 피펫 솔루션, 딥 피펫을 작성합니다. 다음에, 마이크로 피펫을 이용하여 필러의 피펫 ~ 1 / 3의 채우기. 촉촉한 피펫 상자에 각각의 펫을 저장합니다. </li><li> 패치 클램프 녹음을위한 장비를 켜십시오; 컴퓨터, 앰프, CCD 카메라와 현미경을 포함. </li></ol></li><li> 실내 조명을 차단합니다. 적외선 뷰어를 사용하여 현미경 스테이지 챔버 상 망막 슬라이스 준비를 놓습니다. 이 고정화 된 후, 연속 관류를 시작한다. 33-37 ° C에서 재관류 온도를 설정합니다. </li><li> CCD 카메라로 슬라이스 표면을 볼 수 있습니다. 대상 위치에 초점 위치를 목표 CELL 유형이 존재합니다. 패치 클램프 녹음을위한 건강한 보이는 셀 선택 (즉, 그것의 자연스러운 표면과 좋은 세포 모양이 있어야합니다). </li><li> 피펫 홀더에 기록 피펫을 놓습니다. 슬라이스 준비에 피펫을 사전. 그것이 슬라이스 제제 (~ 2mm 위)에 가까운 경우에는, 현미경 피펫 팁을 찾기. 피펫 팁은 현미경으로 볼되면, 타겟 셀을 향해 끝이 아래로 이동. </li><li> 앰프를 설정합니다. (제로) 0 MV / 0 펜실베니아 피펫을 조정하고 10 Hz에서 ~에 ~ 5 MV의 연속 전기 펄스를 시작합니다. 피펫 저항을 확인; 이상적인 저항은 대부분의 망막 신경 세포에 대한 5 ~ 10 MΩ입니다. </li><li> 끝에서 불고 시작합니다. 마우스 피스를 사용하거나 피펫은 목욕 솔루션으로 떨어지면 긍정적 인 압력을 적용, 주사기를 사용합니다. 끝이 표적 세포의 표면에있는 동안 연속으로 내부 솔루션을 날려. <ol><li> 양압 차에 작은 딤플을하면전자의 세포 표면, 약간의 팁을 발전 불고 중지합니다. 증가 할 전망 피펫 저항을 확인합니다. 그림 계속 증가하면두고 그것을&gt; 1 GΩ (기가 시일)에 도달 할 때까지 저항을 모니터링한다. 저항이 자발적으로 증가하지 않는 경우가 될 때까지 기가 시일 부드럽게 부압을 적용한다. </li></ol></li><li> 기가 시일이 달성 된 후, MV를 -70 잡고 잠재력을 변경합니다. 그런 다음, 간헐적으로 피펫 팁 내부의 막을 파열 부정적인 압력을 적용합니다. 전체 셀 구성이 이루어지면, 피펫 저항이 500 MΩ 1 GΩ 및 용량 성 전류가 볼 사이 일 수있다. 때로는 자발적인 시냅스 후 전류를 관찰 할 수있다. </li><li> -80에서 +40 MV에 IV 관계를 기록한다. 전압 게이트 된 채널의 종류는 세포 종류에 따라 활성화된다. </li><li> 기록 시냅스 전류 또는 전압을 빛-유발. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Good recordings can only be achieved with good retinal preparations and well-designed patch clamp setups. Although all the steps described above are important, the discussion highlights some critical steps both for the dissection and recordings. 
For dissection, two things are especially important: cooling and oxygenation. After enucleating the eye, quickly remove the front part of the eye in a dissecting chamber with oxygen-bubbled, cooled dissecting solution, and pour cold solution into the ...

The retina is one of the unique parts of the nervous system. As an accessible part of the brain, its synaptic architecture has been well characterized. In addition, the functions of this neural network can be examined with a physiological stimulus: light. If the retinal tissue is isolated in a dark room with appropriate procedures, neurons in the tissue will respond to light. This preparation has been used to study visual signal processing and elucidate various synaptic mechanisms and neural network functions, as well as disease mechanisms. 
Light responses in retinal neurons have been recorded for decades. Early studies used sharp electrodes to make intracellular recordings from mudpuppy retinal neurons1. In the 1980s, the patch clamp technique was invented2, and soon became a popular method among vision researchers3,4. Single cell recordings from lower vertebrates, including mudpuppy and fish retinal neurons, were popular methods that contributed to the elucidation of visual signal processing mechanisms5,6. 
After genetic mutation techniques were developed, the mouse retina became a more popular model for vision researchers7-9. The mammalian retina is more attractive than that of lower vertebrates because it is evolutionarily closer to the human retina, and there is an opportunity to use disease models. However, mouse retinal cells are small and fragile10, and making retinal preparations and conducting patch clamp recordings in a dark room is challenging. As technology has improved, diverse approaches have become available to study visual signaling mechanisms such as imaging studies11 and the electroretinogram (ERG)12. Nevertheless, single cell recording with the patch clamp method is still important because it is highly temporally and spatially sensitive compared to other methods. Therefore, we have continuously conducted patch clamp recordings and improved our methods to investigate visual signal processing in mouse retinal slice preparations13-15.
In this video tutorial, the protocols are presented with important tips. Good recordings can only be achieved with good preparation. Practicing animal dissection and building a sturdy patch clamp rig will enable most researchers to achieve successful recordings.

<table><tbody><tr><td>Mice (28-60 days old, male)</td><td>Jackson laboratory</td><td>C57BL/6J strain</td><td></td></tr><tr><td>Ames&#039; medium powder</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Dissecting tool: forceps</td><td>Dumont</td><td>#4, #5, #55</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Dissecting tool: scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Dissecting tool: surgery knife</td><td>Surgistar</td><td>7514</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Razor blade (for chopper)</td><td>EMS</td><td>71970</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Chopper</td><td>handmade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrared viewer</td><td>Night Owl Optics</td><td>NOBG1</td><td>It shows bright view. Focusing small objects is an issue.</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td>excellent; makes consistent size pipettes.</td></tr><tr><td>Dark box</td><td>Pelican</td><td>dark box</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Patch clamp system</td><td>Scientifica</td><td>slice scope 2000</td><td>Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent.</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>multiclamp 700B</td><td>Excellent and easy control.</td></tr><tr><td>Acquiring software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp software</td><td>Excellent and easy control.</td></tr><tr><td>Light source (LED)</td><td>Cool LED</td><td>pE-2 4 channel system</td><td>Excellent</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Q-imaging</td><td>Retiga 2000</td><td>Excellent</td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td>handmade</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques

망막은 시각 체계의 관문이다. 영상 신호 처리 메커니즘을 이해하기 위해 망막 신경 네트워크 기능을 조사. 네트워크의 망막 신경 세포는 다양한 아형 포함한다. 양극성 세포, 신경절 세포 및 무 축삭 세포의 10 개 이상의 아형은 형태 학적 연구에 의해 확인되었다. 망막 뉴런의 여러 아형 모션 및 컬러 같은 시각적 신호의 뚜렷한 기능을 인코딩 및 다중 신경 경로를 형성하는 것으로 생각된다. 그러나, 영상 신호 처리의 각 신경 세포의 기능적 역할은 완전히 이해되지 않습니다. 패치 클램프 방법이 근본적인 문제를 해결하는 데 유용합니다. 여기에, 프로토콜을 제공한다 어두운 적응 조건에서 패치 클램프 녹음을 사용하여 마우스 망막 신경 세포에서 빛 유발 시냅스 응답을 기록합니다. 마우스 눈 O / N 암순응이며, 망막 슬라이스 제제는 적외선 조명을 이용하여 시청자 암실에서 해부. 적외선하지 않습니다마우스의 광 수용체를 활성화하고, 따라서 그들의 빛 응답 성을 유지합니다. 패치 클램프 망막 뉴런의 광 유발 된 응답을 기록하는데 사용된다. 형광 염료는 신경 학적 아형의 특성을 기록하는 동안 분사된다. 이 절차는 마우스 망막에 각각의 신경 세포의 생리 학적 기능을 결정하기 위해 우리가 할 수 있습니다.

대표적인 제제는 슬라이스 슬라이스 제제 평면에서 신경절 세포를 나타내는 감광체, 직선 위치에있다.도 1에 도시하지 않고, 여과지로부터 박리된다. 슬라이스가 기울어 진 경우, 제제의 일부만 어려운 패치 클램프 적절한 셀을 식별 할 수있는 초점이다. 레코딩을위한, 일반적으로 빛나는 표면을 갖는 좋은 소마, 심지어 둥근 형상 및 가시적 어두운 플라크를 선택하는 것이 중요하다....

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Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

recording-light-evoked-postsynaptic-responses-neurons-dark-adapted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K 조회수.  Wayne State University School of Medicine. We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

비디오: Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

생물학

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices

Source: Hellmer, C. B., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52422">Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the recording of light-evoked post-synaptic responses in a dark-adapted mouse retinal tissue slice preparation. The retinal slice is placed in a recording chamber, and a recording pipette is used to establish electrical continuity with a retinal ganglion cell. Light pulses are applied to generate excitatory post-synaptic potentials in the ganglion cells, which are recorded by the pipette.

마우스 망막 절편의 뉴런에서 빛을 유발한 시냅스후 반응(Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices)

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Experimental ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

Source: Richevaux, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59534">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Solutions for acute slice ...

Electrophysiology Techniques

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

Source: Kinnavane, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63077">Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

쥐 뇌 절편에서 시냅스 사건의 광유전학적 자극 및 전기생리학적 기록

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Electrophysiology and ...