This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.

Deneysel Kur 1. Hesaplamalar <ol><li> Alg ve / veya Denklem 1 kullanılarak tüm deney için gerekli olacaktır kontrolleri için gerekli bakteri kültürlerinin hacmini hesaplayın: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52455/52455equation1.1.jpg" /> Y ve z gün başına gerekli kontrollerin sayısını eşittir gün sayısına eşittir. </li><li> Denklem 2 kullanılarak deney için ko-kültürler için gerekli olan yosun ve / veya bakteri kültürlerinin hacmi hesaplanır: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/52455/52455equation1.2.jpg" /> NOT: Herhangi bir bileşik ekran &#39;eş-kültürün&#39; deneyler değiştirmek mümkündür; sadece deneysel tasarım uygun çözücü nihai bileşik ve alg konsantrasyonlarını ayarlayın. </li><li> Erken-üstel alg kültürünün son hacmini hesaplamak için Denklemler 1 ve 2 kullanın (genellikle 5 gün ~ 10 4 hücre / ml ama bu performi tarafından tespit edilmelidir(Bu hacim Denklem 3 kullanılarak adım 2.3) için gerekli olan deney için gerekli ng bir alg büyüme eğrisi): <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/52455/52455equation1.3.jpg" /></li><li> Denklem 4 kullanılarak (bu ses adımı 4.2 için tabi) deney için gerekli olan 10 4 cfu / ml bakteri kültürü (ya da istenilen aşılama konsantrasyonu) son hacmini hesaplamak için Denklemler 1 ve 2 kullanın: <img alt="Denklem 4" src="/files/ftp_upload/52455/52455equation1.4.jpg" /> NOT: Hatayı pipetle için hesap adımlar 1.3 ve 1.4 ek 10 ml ve gerçekleştirilen herhangi bir test kullanın (akım sitometri, örneğin, SU-PAM, mikroskopi, vb) 0 d. Deneysel tasarım sığdırmak gerekirse, bu ses düzeyini artırın. NOT: 8 günlük deney örneği hesaplama Bölüm 10. bkz medya tarifleri için ek tabloya bakın. </li></ol> Deneysel Kur 2. Büyüyen alg Hücreler <ol><li> Yalıtmak veya eldeaktif aksenik alg kültürü büyüyor. </li><li> Aseptik transferi 1 sağlanması steril ortamda alg (örneğin, L1 veya benzeri deniz alg ortamı, Malzemeleri ve Ekipmanları tabloya bakınız) içine alg kültürünün son hacminin% 10,: taze ortamda alg kültür 9 seyreltme. Bu suş için önceden belirlenen büyüme koşulları kullanılarak bir gündüz inkübatör içinde seyreltilmiş Alga büyütün (örneğin, 16 ile 18 ° C: 8 saat aydınlık: karanlık döngüsü sık kullanılır). </li><li> Yosun son hacmi olduğunu 9 seyreltme ve: Kültür erken üstel faz, yeniden kültür ulaştığında, aynı steril alg ortamda alg (örneğin, L1 veya benzeri deniz alg orta), nihai konsantrasyonu 1 sağlamak Hesaplanan V A (adım 1.3) eşit. NOT: Bu kültürler aksenik sağlamak için önemlidir. (Genel deniz bakteriyel ortama örneğin, Marine 20 ul tablet kaplama ile kirlenme tüm alg medya ve alg stok şişeleri testEt suyu 2.216,% 1.5 agar veya benzeri) ile takviye edilmiştir. </li><li> Erken üslü faz (~ 10 4 hücre / ml) alg kültür büyütün. NOT: Her alg suşu kültür koşullarına bağlı olarak benzersiz bir büyüme eğrisi vardır. Erken üstel faz (~ 10 ml / 4 hücreleri) (yani, akış sitometrisi veya mikroskopi kullanılarak) hücre yoğunluğuna bağlı olarak bir alg büyüme eğrisi gerçekleştirerek belirlenebilir. </li></ol> 3. Aşılama için bakteriyel hücrelerin hazırlanması <ol><li> (Seçilen bakteri ortamı ve büyüme koşullarında bir büyüme eğrisi yaparak durağan faz olarak bakteri bakteri konsantrasyonu (cfu / ml) ve optik yoğunluk (OD), önceden tespit örneğin, 25 ° C ve 160 rpm&#39;de 2216 Deniz Broth ) veya benzeri. Adım 3.7 doğru hücreleri sulandırmak için, daha sonra hücrelerin (adım 3.3) büyümek için bu bilgileri kullanın. </li><li> Aseptik örneğin% 1.5 agar plakası (2216 esnek Deniz Broth bir izole ve taze yetiştirilen bakteriyel koloni transferiörneğin, bakteri sıvı ortam (5 mL,% 1.5 agar ve benzeri deniz bakteriyel katı ortam) ile iliştirilmemiş, Deniz Broth 2216 veya benzeri deniz bakteri ortamı). </li><li> (- Bakterinin bağlı, 36 saat ~ 12) bir yuvarlanma tambur veya çalkalayıcı üzerinde sabit faz için bakteri büyür. Yosun hücreleri, erken bir üssel evreye (~ 10 4 hücre / ml) ulaşmış olduğu, aynı zamanda - bakteri hareketsiz faz (10 9 hücre / ml ~ 10 8) ulaşır ve böylece deney planı. </li><li> Bir pipet kullanarak, ortam içine bir test tüpüne bağlı herhangi bir biyofilm yıkama. Pipet steril 1.5 ml&#39;lik bir mikrotüp içine iyi karışmış Bakteri kültürünün 1 mi. 14,000 x g&#39;de 1 dakika santrifüj uygulayın. </li><li> Sökün ve pelet (bakteri hücreleri) aksatmadan süpernatant (bakteriyel medya) atmayın. (Pelet) ile mikrotüpe steril alg medya (örneğin, L1 veya benzeri) 1 ml ekleyin. Vortex Mikrotüp alg medya pelet tekrar süspansiyon. </li><li> İkinci yıkama:adımı 3.5 tekrarlayın. NOT: Bu besin kompozisyonu değiştirebilecek gibi önce iyice onlarla yosun aşılamak için hücrelerden bakteri medya, hücre döküntü, atılır proteinler ve küçük moleküllerin kaldırmak amacıyla alg medya ile bakteri hücreleri yıkamak için kritik alg medya ekrana biyoaktif molekülleri tanıtmak veya. </li><li> Seri olarak arzulanan son bakteriyel konsantrasyon (cfu / ml) daha fazla konsantre edilir, 100-kat bir son konsantrasyona kadar, alg ortam içinde yıkanmıştır bakteriyel hücreleri seyreltin. Adım 4.2 alg medyada yıkanmış ve seyreltilmiş olan hücreleri içeren mikrotüpü kaydedin. NOT: 0 d bakteri alg: 1 oranını 1 olan dayalı deney planlayın. Aşama 3.7 başlangıç ​​hücreleri seri 10 6 hücre / ml olacak şekilde seyreltilir, böylece deney için istenen ilk bakteri konsantrasyonu yapmak için, 10 4 hücre / ml &#39;dir. </li></ol> Deney için 4. hazırlanması Bakterileral Ayarı <ol><li> 4 steril otoklava cam konik şişeler hazırlayın ve bunları etiket: a) &#39;alg kontrolü şişesi&#39;, b) &#39;seyreltilmiş bakteriyel stok şişesi&#39;, c) &#39;bakteriyel kontrol şişesi&#39;, ve d) &#39;ko-kültür şişesi&#39;. </li><li> Bakteriyel süspansiyon sulandırmak son hacim = V B (adım 1.4) steril alg medya ile 3.7 1:99 adım. Şişe etiketli seyreltilmiş bakteriyel stoku (adım 4.1) seyreltme olun. NOT: Bir önceki örnekte (adım 4.2), bu 1:99 seyreltme 10 4 cfu / ml&#39;lik bir son konsantrasyon verir. Girdap şişesi hücreleri karıştırın. </li><li> Pipet V kontrol seyreltilmiş bakteriyel stoktan (adım 1.1) ve bakteriyel kontrol şişeye koyun. </li><li> Bakteriyel kontrol şişesi içine steril bir alg ortamı pipetle V kontrol (bu da 1: 1 seyreltme). Girdap şişesi hücreleri karıştırın ve adım 7.3 için kenara. </li><li> Seyreltilmiş bakteriyel stoktan Pipet V ko-kültürAşama 6.1 kenara şişeyi set eş-kültür şişesine şişe. NOT: Aynı anda aynı yosun birden ortak kültürleri yaparken tek tek her bir suş V eş-kültür yeniden hesaplamak ve sonra adımı tekrarlayın için gerekli olan (yani, iki farklı bakteriyel bir ko-kültür bir kumanda ile izolatları) ayrı ayrı ko-kültür için 4.5. Bu Denklem 5&#39;te gösterilen iki ko-kültürleri içerir adım 1.3 hesaplanan V A geliştirmek için gereklidir: <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/52455/52455equation4.5.jpg" /></li></ol> Deneysel Kur için Yosunlar hazırlanması 5. <ol><li> Hücreler de karışık görünen kadar hafifçe geniş ağız pipet ile (adım 2.4) erken üstel alg kültürü karıştırın. </li><li> Alg kontrol balona alg stok şişesinden Pipet V kontrol. Yavaşça 10 ml&#39;lik pipet kullanarak pipetle. Sonra gündüz inkübatör alg stok şişe dönmek. </li><li> Pipet V devamalg kontrol şişeye steril alg ortamının rol (bu da 1: 1 seyreltme). Adım 7.4 için gerekli olana kadar, günlük inkübatör şişeyi ve yer karıştırmak için girdap. </li></ol> 6. hazırlanması Deneysel Co-kültür <ol><li> Yavaşça adım 4,5 bakteriyel ko-kültür balona alg stok şişesi V eş-kültür pipetle. Adım 7.5 için gerekli olana kadar günlük kuluçka ko-kültür şişesi getirin. NOT: bakteri kontrolü bakteri konsantrasyonu deneysel ko-kültür bakteriyel konsantrasyon eşit olmalıdır. Benzer şekilde, alg kontrol yosun konsantrasyonu deneysel ko-kültür yosun konsantrasyonunu eşit olmalıdır. Aynı başlangıç ​​bakteri ve yosun konsantrasyonlarına sahip olarak, nüfus yoğunluğu deney boyunca karşılaştırılabilir. </li></ol> 7. Mikrotiter Plakaları ayarlama <ol><li> Şekil 1 &#39;deki gibi bir steril 48 oyuklu mikrotitre plakası bölün.Steril seyreltici veya non-fotosentetik ya örneklerini içeren dış kuyuları üzerinde etiketleyin. Not: plaka havuzları bir randomizasyon aynı günde alınan numuneler için yapılabilir. Örneğin, kadran 1 deneyde 1 d örneklenmiş olacak; 4 ve C2 - - Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, 4 steril bir çözelti ile doldurulmuş plakanın çevre boş rasgeleleştirilmelidir kuyu B2. </li></ol><img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52455/52455fig1highres.jpg" /> . Aşağıdaki gibi 48-çukurlu bir mikro-titre plaka kuyuları örnek bir yerleşimin Şekil 1 şematik temsili doldurulacak şunlardır: sütun 1 ve 6, A-F kuyular ( <img alt="Çember 1" src="/files/ftp_upload/52455/circle1.jpg" /> )), PBS (ya da başka steril çözelti / ortam 1x 1 ml ile doldurulur. Satırlar A ve E, kuyular 2-8 ( <img alt="Çember 2" src="/files/ftp_upload/52455/circle2.jpg" /> ) 1 ml bakteri kontrolü ile doldurulur; rows B ve E kuyuları 2-8 ( <img alt="Circle 3" src="/files/ftp_upload/52455/circle3.jpg" /> ) 1 ml alg kontrolü ile doldurulur; satırlar C ve D, kuyular 2-8 ( <img alt="Çember 4" src="/files/ftp_upload/52455/circle4.jpg" /> ), 1 ml&#39;lik eş-kültür ile doldurulur. 4, bu plakalar boyunca randomize ve buna göre etiketlenmiş olmalıdır - plaka 4 kadran (A2, A5, D2 ve D5) Bu kadran 1 her özel örnekleme günleri ayrılmıştır. Her gün içinde biz alg kontrolü (rastgele tavsiye ederiz <img alt="Çember 5" src="/files/ftp_upload/52455/circle5.jpg" /> ) Ile ko-kültür ( <img alt="Circle 6" src="/files/ftp_upload/52455/circle6.jpg" /> Bir rasgele sayı üreteci kullanılarak) kuyular. Alg kültürlerin gölgeleme önlemek için 1x PBS ve / veya bakteriyel kontrol tüpler üzerine kapak etiketleyin. <ol start="2"><li> Pipet 1 mi 1x Fosfat tampon çözeltisi (PBS, pH 7.4) veya Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi uygun oyukları içinde, başka steril çözelti. Yavaşça ve dikkatle bu gerçekleştirin. PBS olacak change alg ve / veya ko-kültür ortamının iyonik gücü diğer kuyular kadar dikkatli ele de Splatters eğer. </li><li> Pipet kuyulara bakteri kontrol kültürünün 1 ml bakteri kontrolü (Şekil 1) etiketli. Bakteriyel çökmesini önlemek için her plaka pipetle önce bakteriyel şişeyi girdap. </li><li> Pipet 1 bir geniş ağızlı bir pipet ucu (Şekil 1) kullanılarak, alg kontrol etiketli kuyulara alg kontrol kültürü ile yıkanmaktadır. Bakteriyel şişeye gibi düzenli alg şişesi girdap. Alg lavabo veya yüzer eğilimi ise bir görsel homojen kültürünü korumak için gerekli olduğu gibi, düzenli olarak girdap. </li><li> Geniş ağızlı bir pipet, pipet uygun oyukları içinde, eş-kültür, 1 ml (Şekil 1) kullanılması. Alg şişeye olarak düzenli ko-kültür balon dönen. </li><li> İstenilen sıcaklığa ve gündüz ışık döngüsünde bir günlük inkübatör parafilm ve yerde her plaka Seal (: 8 saat ışık: 16 ile 18 ° C karanlık döngüsü sık kullanılır). Ayrılmakhazır olana kadar gündüz inkübatör plakaları PAM okumaları (Bölüm 8) almak. Sağlamak için, tüm plakalar tutarlı ışık maruz sağlamak için aynı yönde yönlendirilmiştir. </li><li> PBS, alg ortam, alg stoku ve alg kontrol 20 ul tablet alın ve uygun bir seçici olmayan ortam üzerinde levha de (örneğin,% 1.5 agar ile takviye edilmiş Deniz Broth 2216) ve 18 plakalar inkübe - 72 ve 25 ° C hr kirlenme test etmek için. Büyüme bakteri içermemelidir çözümleri herhangi görünüyorsa, daha sonra bu verilerin kullanılmamalıdır. </li><li> Okuma deneysel 0 d PAM fluorometri (adım 8.1 bakınız) alg kontrolü ve ko-kültür şişelerinden geri kalan örnek kullanarak PAM fluorometri okumaları alın. Başka bir 0 d ölçümleri de kalan alg kontrol, bakteri kontrolü ve ko-kültür numuneleri ile yapılmalıdır. </li></ol> Stok Örneklerden 8. alarak PAM Fluorometri Okumalar <ol><li> SU-PAM sıfırokumalar 8 çekmeden önce temiz bir küvete steril alg medya ile. </li><li> Pipet deneyde kullanılan aynı alg ortamın 2.7 ml içeren temiz bir küvet içinde alg kontrol ya da ko-kültür şişelerinden 300 ul. Geniş ağızlı bir pipet ucu ile hafifçe örnek ve seyrelticiyi karıştırın. </li><li> Wipe-off doku ile küvetin dışından tüm parmak izlerini SU-PAM içinde küveti yerleştirmeden önce. </li><li> SU-PAM içine küveti yerleştirin. Kapağı ile örnek örtün ve 3 dakika karanlık adapte sağlar. Koyu uyum kez su yosunu türlerine bağlı olarak değişir ve deneyde kullanılan belirli alg için belirlenmelidir. Alg gündüz kuluçka 16,17 karanlık döngüsünün ortasında sırasında SU-PAM okumaları alarak uzun karanlık adaptasyonu kez (&gt; 20 dk) kaçının. </li><li> Karanlık adaptasyon sonra, F 0 düğmesine basın. 1 alg ortamında: floresan okumaları 3900 üzerinde ise, örnek 1 seyreltin. Ek 3 dakika ve tak karanlık adapteea yeni okuma. F 0 ve F m okumaları 3900 altında olana kadar alg ortamda 1: F 0 veya F m okumaları 3900 üzerinde hala varsa, örneklemin 1 sulandırmak devam ediyor. NOT: alg örnek 1 seyreltilmiş ise örneğin: Nihai floresan kaydederken bu dilüsyonlarının hesaba emin olun seyreltme tüpü iyi gelen ilk transferi sırasında 9, sonra 500 alg floresan okuma ters ile çarpılmalıdır seyreltme faktörü ve tüp gerçek floresan (bu durumda 10) daha sonra 5.000. </li><li> F 0 ayarladıktan sonra, F m değerleri almak için SAT tuşuna basarak her 90 saniyede okuma doyurarak darbe (SAT-Pulse) alır. Okumalar arasındaki zaman aralığı alg gerginlik bağlı olarak ayarlanabilir. Sil örnek. </li><li> Kalan numuneler için 8.6 - 8.1 tekrarlayın adımları. </li></ol> Mikrotiter Tabaklar 9. alarak PAM Fluorometri Okumalar <ol><li> EtiketAlg kontrol ve oyuklar C2 - 4 - bakteriyel ko-kültür için 4 (Şekil 1 &#39;de bord düzeni bakınız) kuyu B2&gt; 3 mi hacminin 6 steril numune tüpleri. </li><li> Kısım her bir tüp içine steril alg ortamı 2.7 mi. </li><li> Gündüz inkübatör tüpleri yerleştirin ve onları alg 30 dakika için yetiştirilen edildi sıcaklığına gelmesini bekleyin. </li><li> Inkübatör mikrotiter plaka çıkarmadan önce aktif seyreltme tüplerine kuyulardan kültürünü transfer ederken, sadece 9.5 adımları (folyoyu çıkarın alüminyum folyo (veya benzeri) ile plaka kaplama ile sınırlıdır karanlık ortama alıştırılmış kuyulara o ışık nüfuz sağlamak - 9.7). </li><li> Aseptik yavaş yavaş yukarı ve aşağı pipetleme geniş bir ağız pipet ile (iyi B2) de ilk mikrotiter plaka karıştırın. </li><li> (Geniş ağızlı bir pipet ucu ile karşılık gelen numune tüpüne 300 ul de B2 (Şekil 1) için kuluçka ve aseptik olarak transfer seyreltme tüpleri elde ediliralg ortam içinde örnek) 9 seyreltme Bu a, 1&#39;dir. </li><li> Kalan Kuyular için 9.6 (B3,4 ve C2 - - 4) tekrarlayın 9.5 adımları. </li><li> Alüminyum folyo ile örtün ve örnek tüpleri SU-PAM için hazır olana kadar gündüz inkübatör onları geri. </li><li> 8.7 - 8.1 adımlarda açıklandığı gibi SU-PAM okumaları gerçekleştirin. Inkübatör dönmeden önce parafilm mikrotiter plaka Seal. </li><li> Deneyin süresi boyunca planlanan zaman aralıklarında okumaları tekrarlayın. Frekans ve örnekleme uzunluğu deney başında planlanmalıdır. </li></ol> 10. Numune Deneyi Örnek deney bir bakteri (Phaeobacter gallaeciensis BS107) ve mikroalgi (Emiliania huxleyi suşu (CCMP3266)) bir 10 günlük ko-kültür. Bir alg kontrolü, bakteriyel kontrolü ve bakteriyel-alg deneysel ko-kültür içerir. <ol><li> 1 adımları (gerekli bakteri ve yosun stokları hacimleri hesaplayın.1-1,4) <img alt="Denklem 10" src="/files/ftp_upload/52455/52455equation10.1.jpg" /></li><li> 36 ml ortam içinde yosun 4 ml aşılayarak, alg stokları, 40 ml kadar olan bir V A hazırlamak ve erken üstel büyüme ~ 10 4 hücre / ml (2.1 adım - 2.4) değerinde bir hücre yoğunluğu elde edilene kadar kuluçkaya bırakıldı. </li><li> (10 4 hücre / ml olacak bakteri nihai konsantrasyon) algli ortam ile 40 ml arasında bir V B Kısım 3&#39;de elde edilen 10 6 hücre / ml bakteri 400 ul seyreltilmesiyle Bakteriyel stok balon hazırlayın. </li><li> Aktarım bakteriyel kontrol şişeye bakteriyel stokunun yarısından (20 mi) ve bakteriyel kontrolü yapmak için yosun ortam 20 ml ilave ediniz. Aktarım yarısı (20 ml) alg alg kontrol şişesine stok ve alg kontrolü (Bölüm 5) makyaj alg medya 20 ml ekleyin. Ko-kültür kurmak için ko-kültür şişesine bakteriyel stokunun kalan 20 ml aktarın ve alg stokunun kalan 20 ml ile karıştırın (Bölüm6). </li><li> İki önceden etiketlenmiş mikrotitre plakaları (Şekil 1), her bir çukura 1 ml 1 x PBS (pH 7.4), kontrol ve ko-kültür Pipet. 0 d ölçümleri (kob sayımı, SU-PAM (Bölüm 8), alg hücre morfolojisi mikroskopik gözlem ve akış sitometri için alg hücre fiksasyon) yapmak için kalan kontrolleri ve ortak kültürler 3 ml kullanın. </li><li> 0 d ölçümleri (Bölüm 8) alınmıştır aynı zamanda her zaman 10 gün boyunca günde bir kez alg kontrolü ve ko-kültür için SU-PAM okumaları alın ve. </li></ol> İlgi 11. Diğer Parametreler <ol><li> Bakteri CFU konsantrasyonu belirlemek: steril 1x PBS (veya benzeri) bakteri kontrolü ve ortak-kültürünün bir seri seyreltme yerine, daha sonra% 1.5 agar (veya benzeri) ile takviye edilmiş Deniz Broth 2216 plakasını bırakmak ve büyümek cfu sayısı dikkate Her bir oyuk 18 Bakteri CFU / mL değerini hesaplamak için. </li><li> Alg hücre konsantrasyonunu değerlendirmek için: alg kontrolü ve ko- düzeltmekglutaraldehid% 0.15 nihai konsantrasyona sahip kültür. -80 ° C&#39;de 10 sıvı azot içinde koyu, daha sonra flaş dondurucuda dakika ve mağaza inkübe edin. Süreç akış sitometresindeki (FACS Calibur veya benzeri) tüm numuneler alg hücreleri saymak için. </li><li> Alg kültürleri ve mikroskopi (yani, ışık mikroskobu, Epifloresans veya benzeri) kullanılarak bakteriyel-alg ko-kültür: alg hücre morfolojisi gözlemleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Scarratt, M. G., Marchetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+microbial+responses+to+iron+enrichment+in+the+Subarctic+Northeast+Pacific:+Do+microcosms+reproduce+the+in+situ+condition?.">Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition?.</a> Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).</li><li>Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+activation+and+recruitment+of+metacaspases+in+the+unicellular+coccolithophore,+Emiliania+huxleyi.">Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).</li><li>Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+physiology+of+Synechococcus+and+Prochlorococcus:+influence+of+light+and+temperature+on+growth,+pigments,+fluorescence+and+absorptive.">Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive.</a> Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).</li><li>Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytoplankton+calcification+in+a+high-CO2+world.">Phytoplankton calcification in a high-CO2 world.</a> Science. 320 (5874), 336-340 (2008).</li><li>Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+nutrients+on+growth+and+lipid+accumulation+in+the+green+algae+Dunaliella+tertiolecta.">Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta.</a> Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).</li><li>Lv, J. -. M., Cheng, L. -. H., Xu, X. -. H., Zhang, L., Chen, H. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+lipid+production+of+Chlorella+vulgaris+by+adjustment+of+cultivation+conditions.">Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions.</a> Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).</li><li>Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+the+photosynthetic+apparatus+of+Dunaliella+tertiolecta+(Chlorophyceae)+to+nitrogen+and+phosphorus+limitation.">Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation.</a> Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).</li><li>MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Cultures+to+Investigate+the+Physiological+Ecology+of+Microalgae.">Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae.</a> Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).</li><li>Blaise, C., Vasseur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algal+microplate+toxicity+test.">Algal microplate toxicity test.</a> Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).</li><li>Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+measuring+growth+and+loss+rates+in+microalgal+cultures.">A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures.</a> J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).</li><li>Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+fluorometric+microplate+algal+toxicity+assay+for+riverine+periphytic+algal+species.">Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species.</a> Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).</li><li>Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Jekyll-and-Hyde+chemistry+of+Phaeobacter+gallaeciensis.">The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis.</a> Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).</li><li>Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+recording+of+photochemical+and+non-photochemical+chlorophyll+fluorescence+quenching+with+a+new+type+of+modulation+fluorometer.">Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer.</a> Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).</li><li>Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+quantum+efficiency+of+photosystem+II+of+symbiotic+dinoflagellates+of+corals+after+heat+stress,+and+of+bleached+corals+sampled+after+the+1998+Great+Barrier+Reef+mass+bleaching+event.">Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event.</a> Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).</li><li>Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+rates+of+Ulva+(Chlorophyta)+measured+by+pulse+amplitude+modulated+fluorometry.">Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry.</a> Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , (2013).</li><li>Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence--a+practical+guide.">Chlorophyll fluorescence--a practical guide.</a> J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).</li><li>Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+optimize+the+drop+plate+method+for+enumerating+bacteria.">How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria.</a> J. Microbiol. Methods. 44 (2), 121-129 (2001).</li><li>Kooten, O., Snel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+chlorophyll+fluorescence+nomenclature+in+plant+stress+physiology.">The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology.</a> Photosynth. Res. 25 (3), 147-150 (1990).</li><li>Maxwell, K., Johnson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence--a+practical+guide.">Chlorophyll fluorescence--a practical guide.</a> J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).</li><li>Schreiber, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse-Amplitude-Modulation+(PAM)+Fluorometry+and+Saturation+Pulse+Method:+An+Overview.">Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview.</a> Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).</li><li>Roh&#225;&#269;ek, K., Bart&#225;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+of+the+modulated+chlorophyll+fluorescence:+basic+concepts,+useful+parameters,+and+some+applications.">Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications.</a> Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).</li><li>Da Silva, J. M., da Silva, A. B., P&#225;dua, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulated+chlorophyll+a+fluorescence:+a+tool+for+teaching+photosynthesis.">Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis.</a> J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).</li><li>Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthesis+assessment+in+microphytobenthos+using+conventional+and+imaging+pulse+amplitude+modulation+fluorometry.">Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry.</a> Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bir minyatür formatta Alg büyüme. Bir deney içinde, çoğaltma arttığı bir mikrotiter plakası içinde bir 1 ml kültür hacmi için alg kültürlerin minyatür sağlar. Bu alg bir deney boyunca sağlıklı olmasını sağlamak için önemlidir; alg besin gereksinimleri yerine getirilmesini sağlamak için, çeşitli alg medya değerlendirmek için mikrotiter plaka biçimini kullanarak, bir büyüme eğrisi (Şekil 2) gerçekleştirin. Ayrıca, gün ışığı döngüsü...

Fitoplankton fizyolojisi geleneksel konik şişelerinde 20 ml lik karboya 1-7 5 L arasında değişen orta-ölçek deneylerinde incelenmiştir. Her zaman noktası için tekrarlanan örnekleri ödün yönetilemez bir deney düzeneği oluşturur gibi bu deneysel ölçek, deneysel izleme Subsampling gerektirir. azaltmak veya büyük miktarlar subsampling ve sözde çoğaltma sınırlamaları ortadan kaldıracak alg fizyolojisi deneyleri için deney hacmini küçülterek aynı gündüz inkübatör alanını kullanırken yeteneği bağımsız deneyler sayısını artırmak için. Bir mikro-titre plakası biçimi deneysel olarak değişik koşullarda yosun kontrol etmek için bir 1 ml kültür hacmi kullanılarak yosun biyo-deneyler için geliştirilmiştir. Bu küçük hacimli deneysel çoğaltır sayısı artırılmalıdır için, izin verir nedeniyle tekrarlanan numuneler arasında bir azalma değişkenlik deneysel tekrarlanabilirlik artırır(Şekil 2) 12 140 gün boyunca deney kontroller (örneğin, aksenik alg kültürler) muhafaza ederken, deneyler ve gerçek çoğaltma sağlar. Bu mikrotiter plakası formatında kolayca gibi, deneysel sorular çeşitli uyarlanmıştır: bir bakteri olan alg ev sahibi ile bir, simbiyotik nötr veya patojenik etkileşim var mı? Bir yosun bir bileşik uyarıcı eklenmesi veya toksik mi? Bu ve diğer sorular bu yeni formatı 9-11 kullanarak hızlı, yüksek verimli bir şekilde ele alınabilir. 48-çukurlu mikrotitre kültürü plakası, her biri 1 mi de tek bir zaman noktasında örneklenir bağımsız deney düzeneği olmasını sağlar. Çeşitli parametreler dahil olmak üzere bu 1 ml hacminde örneklenmiş, ancak bunlarla sınırlı olmamak kaydıyla: SU-Pulse-Genlik Modülasyonlu (SU-PAM) fluorometri (Malzemeler ve Ekipmanları tabloya bakınız) 1 kullanarak klorofil floresan ve fotokimyasal parametreler3. SU-PAM fluorometri yosunu 13 ile yapılan deneyler izlemek için kullanılabilecek bir hızlı ve invazif olmayan bir tekniktir. 14,15 (SU-PAM 4 ml hacim - - bir 2 ortamında seyreltilmiş kültür, 300 ul 150), küçük bir kültür hacmi fotosentez verimi ve PSII sağlığı ölçülebilir. SU-PAM fluorometri ek olarak, bu kurulum dahil olmak üzere diğer çeşitli parametreler ölçmek için kullanılabilir, ancak bunlarla sınırlı değildir: alg hücrelerinin ve yosun hücre morfolojisindeki değişiklikler ekli bakteri görselleştirmek için mikroskopi; Birim (cfu) sayısını oluşturan bakteri kolonisi; ve alg hücre sayımı ve belirlenmesi alt popülasyonlar için flow sitometri.

<table><tbody><tr><td>10 cu. ft. Diurnal incubator (6012-1)</td><td>Caron Corporate</td><td>112310-6012-1-11</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.caronproducts.com&quot;&gt;www.caronproducts.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, Vent/Close Cap, 7 ml working volume, 200/cs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N156340</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.ca&quot;&gt;www.fishersci.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Multiwell TC Plates &amp;ndash; 48-well</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>353078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com/&quot;&gt;www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>P1000 Gilson The Pipetting Standard&amp;mdash;Gilson&#039;s Pipetman</td><td>Mandel Scientific Company Inc.</td><td>GF-F123602</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mandel.ca&quot;&gt;www.mandel.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>P10mL Gilson The Pipetting Standard&amp;mdash;Gilson&#039;s Pipetman</td><td>Mandel Scientific Company Inc.</td><td>GF-F161201</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mandel.ca&quot;&gt;www.mandel.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Wide Orifice Tips nonsterile [100&amp;ndash;1,250 &amp;micro;l]</td><td>VWR International</td><td>89079-468</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ca.vwr.com&quot;&gt;www.ca.vwr.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ultrafine Tips nonsterile [100&amp;ndash;1,250 &amp;micro;l]</td><td>VWR International</td><td>89079-470</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ca.vwr.com&quot;&gt;www.ca.vwr.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml]</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9402151</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.ca&quot;&gt;www.fishersci.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED)</td><td>Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany</td><td>EDEE0232</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.walz.com&quot;&gt;www.walz.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K)</td><td>Caron Corporate</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.caronproducts.com&quot;&gt;www.caronproducts.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sodium chloride (crystalline/certified ACS), Fisher Chemical</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.ca&quot;&gt;www.fishersci.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BD Difco Marine Broth 2216</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com&quot;&gt;www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BD Bacto Agar</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com&quot;&gt;www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>L1 Medium Kit, 50 L</td><td>NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota</td><td>NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ncma.bigelow.org&quot;&gt;www.ncma.bigelow.org&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

a small volume bioassay to assess bacterial/phytoplankton co-culture using water-pulse-amplitude-modulated (water-pam) fluorometry

Kültür deney 1-7 boyunca alt örnekler, böylece mikroalg deneysel manipülasyonu için bilinen metotlar, kültürün büyük miktarda (5 L 20 mi) kullanmıştır. Büyük hacimlerde örnekleme çeşitli nedenlerle sorunlu olabilir: 1) toplam hacmi ve yüzey alanında bir değişime neden olur: deney sırasında kültür hacmi oranına; 2) Sözde çoğaltma (yani, aynı tedavi şişeye 8 örnekleri) genellikle oldukça gerçek çoğaltır (çoğaltmak tedaviler yani, örnekleme) daha kullanılır çoğaltmak; 3) Deney süresi toplam hacmine sınırlıdır; ve 4) aksenik kültürleri ya da her zamanki gibi bakteriyel Mikrobiyota kontaminasyon genel olarak alt-numûne alma sırasında oluşan uzun süreli deneyler sırasında bakımı zordur. mikrotitrasyon plakaları içinde en fazla 48 ayrı tedaviler ile 1 ml kültür, her için kullanılacak miktarlar çoğaltma etkinleştirirBir 12.65 x 8.5 x 2.2 cm plaka, böylece deneysel hacmi azalan ve herhangi bir tedavi subsampling olmadan geniş çoğaltma için izin. 9-11 tarama bakteriyel-alg ko-kültürler, alg fizyolojisi testleri ve toksin: Ayrıca, bu teknik deneysel olmak üzere çeşitli biçimlerde uyacak şekilde modifiye edilebilir. Bir yosun, bakteri ve / veya ko-kültürler ile bireysel çukurlar bunlarla sınırlı olmamak üzere çok sayıda laboratuar prosedürleri için örneklenmiş ama edilebilir: SU darbe genlik-modülasyonlu (SU-PAM) fluorometri, mikroskopi, bakteri koloni oluşturan birimi (cfu), sayımları ve akım sitometri. mikrotiter plaka formatı ve SU-PAM fluorometri kombinasyonu fotokimyasal verim ve numuneler, yüksek tekrarlanabilirlik arasındaki düşük değişkenlik diğer fotokimyasal parametrelerin birden hızlı ölçümler için izin verir ve bir deney boyunca bir damacananızı veya konik balon subsampling birçok tuzaklar önler .

SU-PAM fluorometri okumaları. SU-Pulse-Genlik Modülasyonlu (PAM) fluorometri floresan (klorofil içeriği için bir proxy) ve alg kültürlerinin fotosentez verimini (PSII sağlık) belirlemek için hızlı ve etkin bir yöntemdir. PAM WinControl yazılımı için ham veri değerleri bir elektronik tablo (aşağıdaki koyu adapte alg örnekleri için temel parametreler) oluşturur: Koyu adapte hücrelerin F 0 = floresan F <s...

Watch this Scientific Journal Video about A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry at JoVE.com

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.

Küçük Hacim Biyodeneyler SU-Pulse-Genlik Modülasyonlu (SU-PAM) fluorometri Kullanma Bakteriyel / Fitoplankton Co-kültür değerlendirilmesi için

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

a-small-volume-bioassay-to-assess-bacterialphytoplankton-co-culture

Research

JoVE Journal

Environment

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

10.5K Görüntüleme.  University of Alberta. The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.

Video: A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling protocols include the assessment of resources available to the microbial community (dissolved organic carbon, particulate organic matter, inorganic nutrients), and a comprehensive description of the viral and bacterial communities (via direct viral and microbial counts, enumeration of autofluorescent microbes, and construction of viral and microbial metagenomes). We use a combination of methods, which represent a dispersed field of scientific disciplines comprising already established protocols and some of the most recent techniques developed. Especially metagenomic sequencing techniques used for viral and bacterial community characterization, have been established only in recent years, and are thus still subjected to constant improvement. This has led to a variety of sampling and sample processing procedures currently in use. The set of methods presented here provides an up to date approach to collect and process environmental samples. Parameters addressed with these protocols yield the minimum on information essential to characterize and understand the underlying mechanisms of viral and microbial community dynamics. It gives easy to follow guidelines to conduct comprehensive surveys and discusses critical steps and potential caveats pertinent to each technique.

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Su Kimya ve Deniz Mikrobiyoloji A Field Guide - Okyanusu&#39;nda gaybı Oyuncular çözülüyor

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

Çevre

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Biyomühendislik

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Akış sitometresi ile su biyofilmler karakterizasyonu

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

Floresan Etiketli Bakteriler Sucul Ekosistemlerde Organik Karbon Akışının Yeni Yollarını Ortaya Çıkaracak Bir İzleyici Olarak

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

Doğal Bileşik Kütüphaneleri Exploration uygundur Anti-biyofilm Tahliller Bir Platform

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Operation of Laboratory Photobioreactors with Online Growth Measurements and Customizable Light Regimes

The laboratory study of microalgae can be experimentally challenging. In addition to the cultivation requirements of non-photosynthetic microorganisms, phototrophs also require illumination. Routinely, researchers seek to provide custom light supplies, i.e., vary the light intensity and time over which it is delivered. Such flexibility is difficult with standard benchtop lights. Usually, cultivation studies also require growth comparisons between experimental treatments. Frequently, growth is assessed over an extended duration, e.g., multiple times a day over a week-long trial. Manual measurements can be time-consuming and lack data resolution. Therefore, photobioreactors (PBRs) with automatic growth monitoring and customizable light supply are useful for replicated experiments with multiple treatments. The current work presents the design, construction, and operation of laboratory PBRs. The materials are easily sourced and relatively inexpensive. The design could be duplicated with moderate skill. Each structure has a footprint of ~40 cm2 and hosts three 1 L glass bottles for triplicate replication. Bottles rest upon platforms containing magnetic stirrers and are arranged vertically within a 1 m high and 15 cm diameter polyvinyl chloride (PVC) pipe. The pipe interior is lined with light-emitting diodes (LEDs). These LEDs produce continuous light intensities from 0&#8211;2400 &#181;mol photons m-2 s-1 of photosynthetically active radiation (PAR). Users design a custom lighting program. The light intensity can be adjusted each second or held constant for longer durations. Oxygen produced from photosynthesis exits each bottle via a one-way volumetric gas sensor. Software is used to record gas sensor data. The amount of oxygen produced can be correlated to biomass growth. If biomass samples are required, a syringe can be used to extract culture. The method is suited for microalgae grown with bicarbonate as the carbon source. These PBRs are valuable to a laboratory that requires replicated experiments, light regime flexibility, and continuous high-resolution growth data.

This publication describes the design of laboratory photobioreactors (PBRs) with customizable light regimes. The growth of cyanobacteria or microalgae, using bicarbonate as their carbon source, is monitored continuously by measuring volumetric oxygen production. These PBRs facilitate rapid, replicated laboratory growth comparisons with little user intervention during experiments.

Laboratuvar Fotobiyoreaktörlerinin Online Büyüme Ölçümleri ve Özelleştirilebilir Işık Rejimleri ile Çalıştırılması

The laboratory study of microalgae can be experimentally challenging. In addition to the cultivation requirements of non-photosynthetic microorganisms, ...

Biyoloji

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf can measure PSII absorption cross-section (&#963;PSII), maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), effective photochemical efficiency (Fq&#8242;/Fm&#8242;), and non-photochemical quenching (NPQNSV) for various eukaryotic algae and cyanobacteria, almost all FRRf studies to date have focused on phytoplankton. Here, the protocol describes how to measure PSII photophysiology of an epizoic alga Colacium sp.&#160;Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), in its attached stage (attached to zooplankton), using cuvette-type FRRf. First, we estimated the effects of substrate zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. M&#252;ller 1776, Cladocera, Daphniidae) on baseline fluorescence and &#963;PSII, Fv/Fm, Fq&#8242;/Fm&#8242;, and NPQNSV of planktonic Colacium sp. To validate this methodology, we recorded photophysiology measurements of attached Colacium sp. on S. mucronata and compared these results with its planktonic stage. Representative results showed how the protocol could determine the effects of calcium (Ca) and manganese (Mn) on Colacium sp. photophysiology and identify the various effects of Mn enrichment between attached and planktonic stages. Finally, we discuss the adaptability of this protocol to other periphytic algae.

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II photophysiology and primary productivity. Here we describe a protocol to measure PSII photophysiology of epizoic alga, Colacium sp. on substrate zooplankton using cuvette-type FRRf.

Colacium sp.'nin Bağlı Aşamasının Fotofizyolojisinin Küvet Tipi Hızlı Tekrarlama Hızı Florometresi ile Ölçülmesi

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Küçük Hacim Biyodeneyler SU-Pulse-Genlik Modülasyonlu (SU-PAM) fluorometri Kullanma Bakteriyel / Fitoplankton Co-kültür değerlendirilmesi için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa Biyofilmler

Su Kimya ve Deniz Mikrobiyoloji A Field Guide - Okyanusu'nda gaybı Oyuncular çözülüyor