Enteroidler bağırsak epitel hücrelerinden elde edilen üç boyutlu organoidlerdir. Onlar karmaşık fizyolojik etkileşimleri çalışma için idealdir, hücre sinyal, ve konak patojen savunma. Protokolümüz, bağırsak rezeksiyonu yapılan hastalardan bağırsak kök hücrelerini izole ettikten sonra insan enteroidlerinin nasıl kültürlendirilebildiğini açıklamaktadır.
Kültür medyamızda lipopolisakkaritin birlikte uygulanması, insan nekrotizan enterokolitinde görülenlere benzer histolojik, genetik ve protein ekspresyonu değişikliklerine yol açan enteroidlerde inflamatuar bir yanıta neden ollardır. Nekrotizan enterokolit ve potansiyel terapötik ajanların çalışmasının insan deneklerde, özellikle de çocuklarda etik açıdan zorlayıcı olduğu göz önüne alındığında, insan neokolitinin biyolojik olarak alakalı enterokolit modelini insan neonatal dokusu kullanarak kullanmak son derece arzu edilir. Bu tekniğin en büyük avantajı enteroidlerin insan bağırsak epitelinin birden fazla hücre tipini özetleyebilmeleri ve hayvan modellerinin ve hücre tabanlı sistemlerin tanınan sınırlamalarının üstesinden gelebilmeleridir.
Prosedürü göstermek için yardımcı Christie Buonpane, bir cerrahi ikamet ve Carrie Yuan, bizim laboratuvar dan bir laboratuvar teknisyeni olacaktır. Operatif süitte toplama sırasında, soğuk DPBS insan ince bağırsak doku örneği yerleştirin. Numuneyi soğuk DPBS'de kan ve dışkı temizlenene kadar yıkayın.
Numuneyi RPMI 1640 orta noktasında, crypt izolasyona hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın. Devam etmeye hazır olduğunuzda, numunenin dışkı ve kandan temiz olup olmadığını tekrar kontrol edin. Hassas kesme makas kullanarak herhangi bir aşırı yağ veya cerrahi klips ve zımba kaldırın.
Numuneyi ağırlıklendirin ve yaklaşık 0,75 ila 2,5 gram lık bir parçayı hedefleyin. Sonra, 0.5 santimetre parçalar halinde doku kesmek ve bir numaralı şelite 30 mililitre içeren bir tüp yerleştirin. Dört santigrat derecede 15 dakika düşük hızda çalkalayın.
Daha sonra, 100 mikrometre hücresüzlük yoluyla doku filtre ve üzerinden akış atın. Filtrelenmiş dokuyu, iki numaralı şelite tamponunun 30 mililitresini içeren bir tüpe ekleyin. Dört santigrat derecede 15 dakika düşük hızda çalkalayın.
100 mikrometrelik bir filtreden dokuyu filtreleyin ve akışı atın. Bundan sonra, daha sonra kullanmak için buz üzerinde bodrum membran matris 500 mikrolitre çözülme. 50 mililitrelik konik bir tüpte 10 mililitre soğuk DMEM'e biraz doku ekleyin ve 10 saniye boyunca elle şiddetle çalkalayın.
Bu süspansiyonu 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin ve akışı toplayın. Bu tüpü buzda tut. Ayrı bir 50 mililitre konik tüp soğuk DMEM başka 10 mililitre bazı doku ekleyin ve 10 saniye boyunca şiddetle elle çalkalayın.
Bu süspansiyonu 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin ve akışı toplayın. Bir ile dört arasında etiketli akış içeren dört konik tüpler olana kadar işlemi iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, çözeltiyi 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin ve akışı bir numaralı etiketli 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.
Bu işlemi ikiden dörde kadar olan tüpler için tekrarlayın. 15 mililitrelik tüpleri 200 kez G'de ve 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüj edin. Laminar akış kaputunda, her tüpten supernatant çıkarın ve atın.
Peletin hemen üstündeki doku bulutunu bozmaktan kaçının, bu bazı süpernatant'ı geride bırakmak anlamına gelse bile. Her tüp, pipet yukarı ve aşağı yavaş yavaş kalan supernatant ile pelet karıştırmak için. Karışımı her tüpten 200 kez G'de ve 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca tek bir iki mililitrelik konik tüpve santrifüje aktarın.
Bundan sonra, supernatant çıkarın ve önceden çözülmüş bazal membran matris 500 mikrolitre pelet resuspend. 24 kuyu plakalı bir kuyunun ortasına bu süspansiyonun 50 mikrolitresini uygulamak için soğutulmuş pipet ucu kullanın. Bu örnek kubbe şeklinde görünmelidir.
Toplam 10 kuyuyu doldurmak için bu başvuru işlemini dokuz kez tekrarlayın. Polimerizasyona izin vermek için 24 kuyu plakasını 37 santigrat derecede %5'lik karbondioksit kuvöze aktarın. Sonra, her kuyuya tamamlanmış 500 mikrolitre insan minigut media ekleyin.
Aynı koşullar altında kuluçkaya yatarak bu ortamı iki günde bir değiştirin. İlk olarak, insan minigut media 500 mikrolitre gün sıfır plaka her kuyuda tam mililitre başına beş miligram konsantrasyonda LPS 10 mikrolitre ekleyin. %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kuluçkaya devam edin ve toplama kadar her iki günde bir eklenmiş ortamı değiştirin.
Parafin gömmeye hazırlanmak için, önce hafifçe ortamı çıkarın, bir mililitre PBS ekleyin ve enteroidleri lize etmemeye dikkat ederken bodrum membran matrisini eritmek için yavaşça yukarı ve aşağı pipet ler ekleyin. Pelet için beş dakika boyunca 300 kez G'den daha az bir hızda santrifüj ve sonra PBS kaldırın. % 4 paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında düzeltmek için bir saat için bir kenara tüp ayarlayın.
Pelet için beş dakika boyunca 300 kez G'den daha az bir hızda santrifüj ve sonra paraformaldehit kaldırmak. Bir mililitre PBS ve santrifüj ile 300 kereg'den daha az bir hızda beş dakika boyunca hafifçe yıkayın. Sonra PBS kaldırın.
Bu yıkama işlemini PBS ile bir kez tekrarlayın. Konik bir tüp içine doku işleme jel istenilen miktarda yerleştirin ve sıvı kadar 3 ila 10 dakika boyunca 65 santigrat derece kuru bir banyo kuluçka içinde ısıtın. Bundan sonra, pelet için erimiş doku işleme jeli ekleyin ve yavaşça karıştırın.
Bir coverslip içine küçük bir klonlama halkası yerleştirin. Pipet doku işleme jeli ve bir coverslip üzerine monte edilir klonlama halkaiçine enteroid karışımı. Doku işleme jeli ve enteroid karışımıbir saat boyunca dört derece santigrat katılaşmak için izin verin.
Daha sonra, parafin katıştırma için hazırlamak için% 70 etanol içine katılaşmış karışımı ile klonlama halkası batırın. Kaplamadan hemen sonra, taze izole bağırsak mahzenleri uzatılmış çubuklar olarak görünür. Birkaç saat içinde enteroidler yuvarlak bir görünüm alacak.
Önümüzdeki birkaç gün içinde enteroidler küreler oluşturmaya başlayacaklar. Tomurcuklanma 5 ila 10 gün arasında gerçekleşmelidir, enteroid toplama meydana gelmesi gereken zaman. Büyüyen enteroidler de polarite sergiler, merkezi lümen içeren, bir apikal sınır, ve bazilateral etki alanı.
Enteroidler aynı zamanda sağlam bir aktin sitoiskeleti ile temsil edilen yapısal bütünlüğü de gösterirler. Kültür birkaç gün sonra, LBS tedavi enteroids daha fazla apoptoz deneyimi ve kontrol grubuna göre daha düşük bir verim var. NEC'nin murine modellerinde insan NEC'sinde görüldüğü gibi, LPS tedavi edilen enteroidlerde kontrollere göre reseptör dört gibi bilançonun artması görülür.
Enteroidler de iyi kurulmuş qRT-PCR kullanılarak RNA ve protein ekstraksiyonu için toplanabilir ve batı lekeleme teknikleri gen ekspresyonu ve protein izolasyonu yapılabilir.
