Genellikle PURE sistemi olarak bilinen rekombinant hücre içermeyen protein ekspresyon sistemi için bu protokol, gerekli protein saflaştırmalarını kolaylaştırmak için hücre kültleme ve hücre saflaştırmasını kullanır. Bu, zaman ve işçilik gereksinimlerini önemli ölçüde en aza indirir. OnePot yöntemi sadece uygun maliyetli değil, aynı zamanda zaman verimli olduğunu da kanıtlamıştır.
Hazırlık sürelerini birkaç haftadan üç iş gününe düşürır. Bu, PURE hücresiz platformu dünya çapında daha fazla laboratuvar için erişilebilir hale getirir ve sentetik hücresiz biyoloji için bu gerçekten güçlü platformun uygulanmasına yardımcı olur. Başlamadan önce, tüm suşların kendi proteinlerini iyi ifade ettiğinden emin olun.
Başlamak için, iki mililitre Sepharose reçinesi kullanarak metin elyazmasında açıklandığı gibi OnePot protein saflaştırması için sütunu hazırlayın ve ardından sütunu nikel sülfatla şarj edin. 20 mililitre LB medyayı 20 mikrolitre ampisilinle birleştirerek başlangıç kültürlerini hazırlayın. Steril 96 derin kuyu plakasının 35 kuyusuna 300 mikrolitre medya ekleyin.
Uzama faktörü termo kararsız veya EFTU hariç her birini kendi suşuyla aşılayın ve plakayı nefes alabilir bir zarla kapatın. EFTU kültürü için, 14 mililitrelik bir kültür tüpünde LB ortamı içeren üç mililitre ampisilin aşılayın. Bir OnePot ifade kültürü için yaklaşık üç mililitre EFTU kültürü yeterlidir.
Bir gecede dakikada 260 dönüşte sallanırken 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, steril şaşkın şişeye 500 mililitre LB ortamı ve 500 mikrolitre ampisilin aktarın. OnePot PURE kültürünü EFTU kültürünün 1,675 mikrolitresi ve derin kuyu plakasından her bir kültürün 55 mikrolitresi ile aşıla.
Kültürü dakikada 260 dönüş sallayarak veya kültürün optik yoğunluğu 0,2 ila 0,3'e ulaşana kadar 37 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın. 500 mikrolitre 0,1 milimolar IPTG ile kültürü teşvik edin ve üç saat daha büyüyün. Hücreleri 10 dakika boyunca dört santigrat derece ve 3, 220 kez G santrifüjleme ile hasat edin ve hücre peletini daha fazla kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Üçüncü gün, saflaştırmaları için gereken arabellek miktarlarını ölçün ve metinde belirtildiği gibi hepsine TCEP ekleyin. Kalan tamponları TCEP olmadan dört santigrat derecede saklayın. Yüklü sütunu 30 mililitre arabellek A ile dengele.25 mililitrelik A arabelleği geçtikten sonra sütunu alttan kapatın.
Hücreleri çözün ve hücre peletini 7,5 mililitre tampon A.Lyse hücrelerinde 130 watt'lık bir prob kullanarak yeniden kullanmak için serolojik bir pipet kullanın. Sonication başarılı olursa, çözüm koyu olacaktır. Hücreleri buzda tuttuğunuzdan emin olun ve probu tüpe dokunmadan yeterince derine yerleştirin.
Hücre kalıntılarını 21, 130 kez G'de 20 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleme ile çıkarın ve lisatı buzda tutun. Üst katmanı eşdeğer sütuna ekleyin. Sütunu üstten kapatın ve sızıntı olmadığından emin olun.
Bir tüp rotator kullanarak sütuna dört santigrat derecede üç saat kuluçkaya yatırın. İlişkisiz bileşenleri kolondan alın ve 25 mililitre tamponla yıkayın A.Sütunu 25 mililitre 25 milimoler imidazol tamponu ile yıkayın. Proteinleri beş mililitre 450 milimoler imidazol tamponu ile yağlayın ve eluted proteinleri her zaman buzda tutun.
Eluat'ı 25 mililitre HT tampon ile seyreltin ve karışımı buzda tutun. 15 mililitrelik santrifüj filtreye 15 mililitre ekleyin ve 1,5 mililitrelik bir hacme konsantre edin. Kalan 15 mililitreyi konsantre çözelti ile filtreye ekleyin ve bir kez daha 1,5 mililitreye konsantre edin.
Konsantre numuneye 10 mililitre HT tampon ekleyin ve bir mililitreye konsantre edin. Konsantre numuneyi kurtarın ve eşit miktarda stok tamponU B ekleyin ve daha fazla kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede depolayın. Arabellek değişimi sırasında, metinde belirtildiği gibi sütunu geri yükleyin.
Dördüncü gün, Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonu ölçün. Numuneyi 0,5 mililitre üç kilodalton kesme santrifüj filtresi ile mililitre başına 20 miligrama yoğunlaştırın. SDS sayfasını kullanarak OnePot PURE protein bileşimini doğrulayın.
Numunenin 2,5 mikrolitresini iki X Laemmli tamponunun 10 mikrolitresi ile karıştırılmış 7,5 mikrolitre su ile seyreltin ve ardından jel üzerine beş mikrolitre ve 2,5 mikrolitre yük yükleyin. SDS sayfasını metinde belirtildiği gibi çalıştırın. Reaksiyon için iki ila 10 nanomolar DNA kullanarak elektronik tablodaki ilgili sarı hücrelerdeki DNA konsantrasyonu ve uzunluğunu doldurun.
İstediğiniz toplam reaksiyon hacmini mikrolitrelerde doldurun. Gerekli reaktifleri dondurucudan çıkarın ve buzda çözün. Daha sonra, hesaplanan miktarda su, DNA ve enerji çözeltisini PCR tüpünün bir tarafına veya 384 kuyu plakasındaki bir kuyunun bir köşesine pipetlayın.
Pipet, hesaplanan protein ve ribozom çözeltisini bir PCR tüpünün diğer tarafına veya 384 kuyu plakasının karşı köşesine koyun. Reaksiyon bileşenlerini birleştirmek için yaklaşık 30 saniye döndürün. Plaka okuyucu deneyleri sırasında buharlaşmayı önlemek için 35 mikrolitre sıvı balmumu ekleyin ve plakayı şeffaf bir dolgu macunu ile kapatın.
37 santigrat derecede en az üç saat kuluçkaya yatır. Bir plaka okuyucuda okuma için, floresan yoğunluğunu her iki dakikada bir gerekli dalga boyunda ölçün. OnePot protein preparatı için daha sonra kullanılan tüm bireysel suşlarda dışavurum üzerinde başarılı burada gösterilmiştir.
Son OnePot PURE protein çözeltisinin genel bileşimi SDS sayfası tarafından analiz edildi. EFTU'nun beklendiği gibi diğer proteinlere kıyasla daha yüksek konsantrasyonda mevcut olduğu fark edilir. OnePot protein çözeltisinin sentez verimi, His etiketli veya etiketlenmemiş ribozomlarla birlikte zaman içinde eGFP floresan izlenerek analiz edildi.
Yeşil liste tRNA in vitro etiketleme sistemi veya Kumasi boyama kullanılarak etiketlenen üç farklı proteinin ekspresyon düzeyleri bir SDS sayfa jelinde analiz edildi. Fonksiyonel bir PURE sistemi için, tüm suşların ilgili proteinlerini iyi ifade etmeleri kesinlikle kritiktir. Bu teknik, PURE sisteminin biyolojik sistem mühendisliğine uygulanmasını kolaylaştırarak yeni genetik ağların, moleküler tanıların, terapötiklerin ve eğitim kitlerinin geliştirilmesini sağlar.
