Supported by grants from the Department of Defense (W81XWH-09-1-0127), the NIH (2-R01-CA089569), the Elsa U. Pardee Foundation, a Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research Pilot Study Award, and generous philanthropic support from Section of Urology and Section of Research in the Department of Surgery, University of Chicago.

Tüm fareler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine ve Chicago Hayvan Kaynak Merkezi&#39;nde Üniversitesi gözetiminde göre, muhafaza korunur ve ötenazi uygulandı. Deneysel Çalışmalar 1. hazırlanması Hayvanlar <ol><li> Hayvanlar taşıma ve kullanım potansiyeli fizyolojik etkilerinden kurtarmak için, yeni konut ve çevre gelmesini bekleyin. Not: Aşağıdaki tekniğin tüm fareler ticari olarak temin edilebilir suşlar için de geçerlidir. Bir deney için kullanılan hayvanların sayısı, çalışma tasarımına bağlıdır ve istatistik gelen istişare ile yapılmalıdır. </li></ol> 2. Kimlik ve Periton Fat Depolarında İzolasyonu. <ol><li> CO 2 doz aşımı ve ölüm onaylamak için ikincil bir fiziksel yöntemle hayvanların Euthanize. </li><li> Hasat periton yağ deposu olarak iç organ çıkarılması (ikincil yöntemi), anne oluşturmaktadırke iç organları (Şekil 1A) ortaya çıkarmak için periton duvar üzerinden kasık papilla yakın bir orta hat kesi. </li><li> Omentum Fat (OM) için, forseps (Şekil 1C) ile periton boşluğuna gelen dalak uzatarak omental / pankreas kompleksi açığa. Yakından doku bağlantıları kırparak pankreas ve dalak omentum bırakın. Kalan pankreas dokusu 4 eksize emin olun. </li><li> Gonadal Fat (GF) için, doku bağlantıları (Şekil 1A üst righ t) 4 keserek yumurtalıklar ve rüsumat çevreleyen gonadal yağ kaldırmak için forseps kullanabilir. </li><li> Rahim Fat (UF) için, doku bağlantıları keserek rahim boynuzları ve rüsumat çevreleyen rahim yağ kaldırmak için forseps kullanabilir (Şekil 1A sağ alt) 4. </li><li> Mezenterik Fat (MF) için, ince bağırsak ve pilor arasındaki kavşak kesti. Forseps sıkıca kavrama serbest ucunu için kullanınince bağırsak ve uzak mezenterik yağ yavaş yavaş &quot;soyma&quot;. Diseksiyon makas kullanarak mezenterik kökünden mezenterik yağ bırakın (Şekil 1A sol alt) 4. </li><li> Splenoportal Fat (SF) için, pankreas dalak hilusu bağlayan doku ince yağlı bandı ortaya çıkarmak için forseps kullanarak dalak distal ucunu kaldırın. İlk dalak onu diseksiyon dikkatlice ardından pankreas onu bırakmadan tarafından splenoportal yağ tüketim (Şekil 1B) 4.. </li></ol> Giemsa boyanması Kullanılması 3. Sütlü Nokta Kimlik <ol><li> Tüketim omenta C57BL / 6 farelerinden alınan ve 16 saat süre ile 4 ° C&#39;de (O / N)% 5 nötr tamponlu formalin içinde çözmek (2.3 adım bakınız). </li><li> Sabit doku gömme parafin için, doku boyutu için uygun olan bir kalıbın seçin. Kalıbı doldurmak için parafin hazneden erimiş parafin dökün. Kaseti açın ve sıcak kullanmaAk, kalıp içine doku aktarın. <ol><li> Dikkatle uzunlamasına bölümleri üretmek için gömme parafin sırasında dokuları yönlendirin. Sıkıca yerinde kalıp ve basın üzerinde etiketli doku kasetini yerleştirin. Kalıp en az 30 dakika soğumasını bekleyin. </li></ol></li><li> Formalin ile fikse parafin gömülü (FFPE) doku blok uzaklıkta (4 mikron kalınlığında) seri kesitler kesin. Doku şerit parafin bloğu kapalı geliyor gibi bölümlere altında önceden temizlenir slayt yerleştirin. </li><li> Seri bölüm tüm omentum; toplamak ve Giemsa (3.6 bakınız) her üçüncü bölümü leke. Oda sıcaklığında O / N, tercihen hava ile kurumaya bölümleri ile cam slayt izin verir. Kurutulmuş slaytlar sabitlenmesi için hazırız. Giemsa lekeli slaytlar karşılaştırmalar için hematoksilen ve eozin ilk bölümü Leke. </li><li> Kisilenler iki ardışık 5 dk inkubasyon tarafından slaytlar Deparaffinize. Aşağıdaki iki sıralı inkubasyon slaytlar rehidrate:% 100 etanol,% 95 etanol ve son olarak da wa dokununter. <ol><li> Kurutma slaytları önlemek için gerekli önlemleri alın. Oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın. </li></ol></li><li> Tamamen% 5 Giemsa çözeltisi ihtiva eden bir Coplin kavanoza slaytlar daldırın ve oda sıcaklığında 4 dakika boyunca inkübe (musluk suyu hazırlanan a / h). Hava-kuru, 60 saniye musluk suyunda slaytlar durulayın ve montaj medyayı kullanarak lamel ile monte edin. </li><li> Görüntü üretici yazılımı ile Tüm Slayt Tarayıcı ve işlem kullanılarak boyandı slaytlar. ImageJ yazılımı kullanarak 4 Giemsa lekeli omental bölümlerde sütlü nokta hacmini ölçmek. </li></ol> İn vivo ve in vivo çalışmalar için Ex Yumurtalık Kanseri Hücreleri 4. Yayılım ve Hazırlama <ol><li> Bir ısı banyosu içinde 37 ° C hücre büyüme ortamının önceden sıcak 15 mi. Hücre hattı, geçit numara, tarih ve dondurulmuş stok hazırlayan kişinin adı ve tarih ile etiketleme uygun boyutta doku kültürü şişesi (örneğin, 75 cm 2 yüzey alanı) hazırlayınve kişinin hücreleri kaplama / çözülme kim. Not: Aşağı donma ve geçit sayısının tarihi metastatik fenotip etkileyebilir olarak metastaz çalışmalarda böyle ayrıntılı bilgi çok önemlidir. </li><li> Biyolojik güvenlik kabini, bir pipet, T-75 kültür şişesi içine 10 ml ortamda steril bir ortam kullanılması. Sıvı azot sisteminden hücrelerin bir şişe çıkarın ve hücre tipini onaylamak için etiketi kontrol edin. 37 ° C ısıya banyosunda ısıtılarak bir zamanda hücrelerin sadece bir şişe çözülme. </li><li> Steril tekniği kullanarak, pipet 1x10 6 kültür şişesi içine hücreleri çözülmüş. Hücreler takmak için izin inkübatör şişeyi yerleştirin. Yavaşça düzgün bir hücre süspansiyonu oluşturmak için ileri ve geri şişeyi sallayın. <ol><li> Doku kültürü inkübatöründe içine yerleştirilir ve CO2 ortamında% 5 37 ° C&#39;da koruyun. Hücreler O / N uymak için izin verin. </li></ol></li><li> Aspire medya ve taze önceden ısıtılmış büyüme ortamı ile değiştirin. Kuvöz ve tüm şişeyi koyunow hücreleri büyümek. Devrik bir mikroskop kullanarak her 2-3 günde bir görsel kontrol ile günlük olarak, hücre büyümesini izlemek. % 70-80 izdiham ulaştıktan sonra geçiş hücreleri standart hücre kültürü teknikleri kullanın. Not: Deneysel analizler hücreler aktif çoğalan emin olmak için% 70 izdiham hücreleri hasat için. </li><li> Kültür ortamı aspire ve steril fosfat tamponlu tuzlu su içinde 10 ml (PBS) ile durulayın. PBS aspire ve% 0.25 tripsin / EDTA (75 cm 2 yüzey alanı için 2 ila 3 ml) ekleyin ve 37 ° C &#39;de 5 dakika inkübe edilir. Görme hücreler müstakil teyit ve büyüme ortamı eşit hacimde ekleyin ve hafifçe tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için yukarı ve aşağı hücreleri pipetle. Not: It tripsin inaktive gibi büyüme ortamı serumu içeren önemlidir. Sonraki adımları sırasında hücre kaybını telafi etmek için verilen bir deney için gerekli olan sayıdan daha fazla hücreler 4 kat en az 2- hazırlanın </li><li> Yaşayabilir hücrelerin yüzdesini belirlemekHemasitometre veya otomatik bir hücre sayacı tripan mavi dışlama tahlili ile süspansiyon. Not: Burada, sadece hücre ≥% 96 uygulanabilir olduğu hücre preparatları kullanılır. </li><li> Bir 50 ml konik bir tüp şişeye hücre süspansiyonu aktarın. 4 o C&#39;de, 1100 x g&#39;de 5 dakika santrifüj Pelet hücreleri </li><li> Süpernatant aspire ve ml başına 2x10 6 hücre bir konsantrasyona PBS içinde hücre pelletini. </li></ol> Hücreleri 5. intraperitoneal enjeksiyon Deneylerde, fareler açıkça bu tekniği göstermek için, patojen maruz kalma riskini sınırlamak amacıyla bizim bariyer tesis içinde laminer hava akımı ya da biyogüvenlik kabini işlenir, beraberindeki video prosedürleri onaylı bir laboratuarda yapılmıştır: Not Hayvan çalışmaları için. Bu tekniğin anestezi altında hayvanlara gerektirmez. Onaylanmış protokoller kapsamında, bu TECHNIQ gerçekleştirmekCanlı hayvanlar üzerinde ue. Bu çalışma için, farelerin ilgili suşlarının kullanın. Örneğin: insan yumurtalık kanseri hücresinin (SKOV3ip.1 ve HeyA8) kolonizasyonu çalışması için immün sistemi baskılanmış, atimik çıplak farelerin kullanın; Fare yumurtalık kanseri hücreleri (ID8) kolonizasyon çalışma için, immunokompetan C57BL / 6 fareleri kullanır. <ol><li> Yük 500 şırıngaya tek bir hücre süspansiyonu ul ve steril kapaklı 25 G iğne koymak. Bu enjeksiyondan önce hücre kesme azaltır. </li><li> Ensesinden fare Pick up ve palmiye ve işaret parmağı ile kuyruk tutun ve halka ve (fare sol el ile sınırlandığını) küçük parmak arasında sol arka bacak düzeltmek. Not: travmatik karın organları önlemek o enjeksiyon sırasında hareket edemez, böylece de fareyi dizginlemek için. </li><li> Sadece dizlerinin üstünde karın üzerinde bir çizgi düşünün, ve hayvanın sağ tarafında bir noktayı bulmak ve orta hatta yakın. Giriş noktası için kranial ve biraz medialGeçen meme. Not: Farenin sağ tarafındaki iğneyi takma çekum önler ve bağırsak 11 delme riskini azaltır. </li><li> Yaklaşık 0,5 cm derinliğe kadar farelerin karın alt yan bölgesinde iğne takın. İğne kan damarı ya da diğer organlara nüfuz periton olmadığını doğrulamak için pistonu geri çekin. <ol><li> Herhangi bir sıvı aspire edilirse şırınga (ve örnek) 11 atın. A-yeşilimsi kahverengi veya sarı aspirat sırasıyla bağırsak veya mesane içine iğne penetrasyonu gösterir. </li></ol></li><li> Yavaş, sabit bir basınç kullanarak örnek enjekte edilir. İğneyi geri çek ve kafes fare dönün. Kesici kapta atmadan önce şırıngayı tekrarlamak etmeyin. </li><li> Belirli zaman noktalarında CO 2 boğulma ve hayati organ aracılığıyla Kurban fareler enjeksiyon sonrası. </li></ol> In vivo 6. Sütlü nokta kolonizasyonu <ol><li> Quantitasütlü noktalar kanser hücresi lokalizasyonu yon akışı sitometri kullanılarak <ol><li> (Adım 2.3 anlatıldığı gibi - 2,7) farelerin periton yağ depoları yalıtmak floresan enjekte edilen buz gibi soğuk PBS kanser hücrelerini ve acil yer dokuları etiketledi. <ol><li> Bu özel tekniğin için, ağırlık-maç omentum tüm adipoz yağ dokuları. Aktarım dokular serumsuz DMEM 1.5 ml ve% 0.1 (w / v) sığır serum albümini içeren 5 ml tüpler ayırmak için. Üç bağımsız farelerden toplanan Havuz dokular akış sitometrisi için yeterli bir hücre verimi sağlamak. </li></ol></li><li> Cerrahi makas kullanılarak ekleyin kıyma dokular (w / v) kollajenaz I. dönme karıştırma ile 30 dakika için 37 ° C &#39;de doku süspansiyonu inkübe% 0.4 ihtiva eden serumsuz DMEM 1,5 mi. <ol><li> Tercihe bağlı bir adım olarak, daha da çiğnenmesi ile doku ilişkisini. Bu durumda, yönlendirme döner düşük üzerinde 10 dakika süreyle masticate bir microstomacher torbasına doku kolajenaz süspansiyonu transfer5 dakika sonra torba. </li></ol></li><li> Bir naylon örgü filtre (60 mikron gözenek) aracılığıyla filtre örnekleri büyük enkaz kaldırmak için. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüj yoluyla hücreler toplamak ve süpernatan fraksiyonu atın. </li><li> ACK lisiz tamponu 900 ul ile birlikte 100 ul PBS hücre pelletini ve 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. 250 x g&#39;de santrifüjleyin hücreler 5 dakika süreyle tavlandı ve süpernatant atılır. <ol><li> Buz soğukluğunda PBS 250 ul hücre pelletini. Tek hücre süspansiyonu sağlamak için 60 mikron gözenek naylon örgü ile örnekler Filtre. Buz soğukluğunda PBS 250 ul ile durulayın. </li></ol></li><li> Sitometresi bir 561-nm sarı-yeşil lazer ile donatılmış bir akış ve 585 nm / 15 nm bant geçiren filtre kullanarak nüfusun floresan levhası &#39;hücre sayısını quantitate. Parental hücreler ve / veya uygun negatif kontroller 4 analizine dayanan tdTomato-pozitif hücreler için kapı ayarlayın. </li></ol&gt; </li><li> Mikroskobik ve makroskobik metastaz kantitasyonu <ol><li> İstenilen deneysel bitiş noktası (ler), izole ve hemen uygun sabitleme medyada dokuları yerleştirin. Örneğin sağlam gonadal, rahim ve 4 ° C&#39;de 48 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde mezenterik yağ deposu olarak daha büyük bir numune, düzeltildi. 2-16 saat boyunca 4 ° C &#39;de% 5 nötral tamponlu formalin içine (rahim ve mezenterik yağ omental ve splenoportal yağ, ve doku eşdeğer) daha küçük örnekler düzeltildi. <ol><li> Alternatif olarak, çıtçıt OCT gibi bir dondurma ortamda koyarak dokuları dondurma ve sıvı azot uygun bir miktarda içine bırakın. </li></ol></li><li> Aktarım, parafin içine gömülmek kadar 4 ° C &#39;de% 70 etanol ve saklamak için dokuların sabit. 3.2 ve 3.3 açıklandığı gibi gömün ve süreç doku. <ol><li> Mikroskobik metastazları varlığında ya da yokluğunda dokuları değerlendirmek için H &amp; E ile boyanmış bölümü kullanarak (örneğin, 50 hücre kümeleri). T onaylaböyle sitokeratin 8/18 için bir IHC leke olarak ikincil bir yöntem ile mikroskobik metastazlarının varlığı yumurtalık kanser hücrelerini tespit etmek. </li></ol></li></ol></li></ol> 7. Sütlü Nokta Kolonizasyon Ex Vivo <ol><li> Temel ex vivo omental organ kültürü koşullarının oluşturulması <ol><li> % 20 FCS içeren DME / F12 ortamı, 500 ul ihtiva eden bir on-çukurlu doku kültürü plakasının bir oyuk içinde tek bir kültür plakası takılır ve her omentum yerleştirin. 24 ila 48 saat ve / veya ek bir zaman noktası için bir% 5 CO2 ortamında 37 ° C &#39;de, organ kültürleri koruyun. Her durumda (örneğin, ortam türü / zaman noktası) için üç bağımsız omenta (üçlü numuneler) kullanın. </li><li> Doku bütünlüğünün değerlendirir H &amp; E bölümlerinde nekrotik adipositler karşı sağlıklı Sayma Adım 3&#39;te açıklandığı gibi düzeltmek ve süreç örnekleri, deneysel uç noktalar da dokuların bütünlüğünü doğrulamak için. Den en az ~ 120 hücre5 biyolojik örnekler 10, bu canlı doku yüzdesini formüle etmek gereklidir. </li><li> Doku fonksiyonu,% 20 FCS ile DME / F12 ortamı, 500 ul ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka ayrı kuyularda yer omenta (n = 3) ölçmek. Omenta 24 saat boyunca bir% 5 CO2 ortamında 37 ° C &#39;de ortam koşullandırılması için izin verin ve daha sonra, bir IL-6, ELISA tahlilinde 10 kullanım için 250 ul çıkarın. </li></ol></li><li> SKOV3ip.1-GFP hücreleri ile fare omentum ex vivo ko-kültür <ol><li> Büyüme ve ml başına 2 x 10 6 hücre konsantrasyonunda bölüm 4 ve tekrar süspansiyon tarif edildiği gibi floresan etiketlendi hücrelerini hazırlamak. </li><li> Kültür ucun zara doku yapıştırıcısı ~ 6 ul uygulayın ve hava ile kurumaya için izin verir. Herhangi bir aşırı yapıştırıcı kaldırmak için steril su ile iki kez zarı yıkayın. Hava laminar kaputun altında membranlar kurulayın. </li><li> Dikkatle omenta tüketim ve yapışkan kaplı memb ekleyinrane steril forseps kullanılarak. Doku öncesinde medya ekleyerek 1 dakika zarının uymak için izin verin. Her kültür insert her omentum üstüne hücre süspansiyonu 500 ul ekleyin. DME / F-12 10 2,5 ml transwell odasının çevresini doldurun. </li><li> % 5 CO2 ortamında 37 ° C &#39;de 6 saat süre ile hücre süspansiyonu ile omenta inkübe edin. Dikkatle çıkarın ve ~ 10 ml PBS ile omenta yıkayın. Uygun bir floresan görüntüleme sistemi 10 kullanılarak floresan kanser hücresi odaklar gözünüzde canlandırın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bast, R. C., Hennessy, B., Mills, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+ovarian+cancer:+new+opportunities+for+translation.">The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (6), 415-428 (2009).</li><li>Bowtell, D. D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+and+evolution+of+high-grade+serous+ovarian+cancer.">The genesis and evolution of high-grade serous ovarian cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (11), 803-808 (2010).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18+Familial+Cancer+and+Prophylactic+Surgery.">Chapter 18 Familial Cancer and Prophylactic Surgery.</a> Diagnostic Pathology of Ovarian Tumors. , 277-288 (2011).</li><li>Clark, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milky+Spots+Promote+Ovarian+Cancer+Metastatic+Colonization+of+Peritoneal+Adipose+in+Experimental+Models.">Milky Spots Promote Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Peritoneal Adipose in Experimental Models.</a> The American Journal of Pathology. 183 (2), 576-591 (2013).</li><li>Platell, C., Cooper, D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+omentum.">The omentum.</a> World Journal Of Gastroenterology: WJG. 6 (2), 169-176 (2000).</li><li>Hagiwara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milky+spots+as+the+implantation+site+for+malignant+cells+in+peritoneal+dissemination+in+mice.">Milky spots as the implantation site for malignant cells in peritoneal dissemination in mice.</a> Cancer Research. 53 (3), 687-692 (1993).</li><li>Gerber, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+Attachment+of+Peritoneal+Tumor+Metastases+to+Omental+Immune+Aggregates+and+Possible+Role+of+a+Unique+Vascular+Microenvironment+in+Metastatic+Survival+and+Growth.">Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth.</a> The American Journal of Pathology. 169 (5), 1739-1752 (2010).</li><li>Liebermann-Meffert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+omentum.+Anatomy,+embryology,+and+surgical+applications.">The greater omentum. Anatomy, embryology, and surgical applications.</a> The Surgical Clinics of North America. 80 (1), 275-293 (2000).</li><li>Collins, D., Hogan, A. M., O&#8217;Shea, D., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Omentum:+Anatomical,+Metabolic,+and+Surgical+Aspects.">The Omentum: Anatomical, Metabolic, and Surgical Aspects.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 13 (6), 1138-1146 (2009).</li><li>Khan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+metastatic+colonization+of+human+ovarian+cancer+cells+to+the+omentum.">In vitro metastatic colonization of human ovarian cancer cells to the omentum.</a> Clinical, &amp; Experimental Metastasis. 27 (3), 185-196 (2010).</li><li>Shimizu, S., Hans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+Administration.">Routes of Administration.</a> The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).</li><li>Vang, R., Shih, I. -. M., Kurman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fallopian+tube+precursors+of+ovarian+low-+and+high-grade+serous+neoplasms.">Fallopian tube precursors of ovarian low- and high-grade serous neoplasms.</a> Histopathology. 62 (1), 44-58 (2012).</li><li>Folkins, A. K., Jarboe, E. A., Roh, M. H., Crum, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+to+pelvic+serous+carcinoma+and+their+clinical+implications.">Precursors to pelvic serous carcinoma and their clinical implications.</a> Gynecologic Oncology. 113 (3), 391-396 (2009).</li><li>Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+serous+carcinoma:+recent+concepts+on+its+origin+and+carcinogenesis.">Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis.</a> Journal of Hematology, &amp; Oncology. 5 (1), 8 (2012).</li><li>Kurman, R. J., Shih, I. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+pathogenesis+of+epithelial+ovarian+cancer:+a+proposed+unifying+theory.">The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory.</a> The American Journal Of Surgical Pathology. 34 (3), 433-443 (2010).</li><li>Crum, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distal+fallopian+tube:+a+new+model+for+pelvic+serous+carcinogenesis.">The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis.</a> Current Opinion In Obstetrics, &amp; Gynecology. 19 (1), 3-9 (2007).</li><li>Crum, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+BRCA:+The+Tubal+Fimbria+Emerges+as+an+Origin+for+Pelvic+Serous+Cancer.">Lessons from BRCA: The Tubal Fimbria Emerges as an Origin for Pelvic Serous Cancer.</a> Clinical Medicine, &amp; Research. 5 (1), 35-44 (2007).</li><li>Foulkes, W. D., Narod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+risk+and+family+history.">Ovarian cancer risk and family history.</a> The Lancet. 349, 878 (1997).</li><li>Antoniou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Average+Risks+of+Breast+and+Ovarian+Cancer+Associated+with+BRCA1+or+BRCA2+Mutations+Detected+in+Case+Series+Unselected+for+Family+History:+A+Combined+Analysis+of+22+Studies.">Average Risks of Breast and Ovarian Cancer Associated with BRCA1 or BRCA2 Mutations Detected in Case Series Unselected for Family History: A Combined Analysis of 22 Studies.</a> The American Journal of Human Genetics. 72 (5), 1117-1130 (2003).</li><li>King, M. -. C., Marks, J. H., Mandell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+York+Breast+Cancer+Study+Group+Breast+and+ovarian+cancer+risks+due+to+inherited+mutations+in+BRCA1+and+BRCA2.">New York Breast Cancer Study Group Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2.</a> Science. 302 (5645), 643-646 (2003).</li><li>Kj&#230;r Kr&#252;ger, S., Gayther, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+and+genetic+susceptibility+in+relation+to+the+BRCA1+and+BRCA2+genes.+Occurrence,+clinical+importance+and+intervention.">Ovarian cancer and genetic susceptibility in relation to the BRCA1 and BRCA2 genes. Occurrence, clinical importance and intervention.</a> Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 85 (1), 93-105 (2006).</li><li>Easton, D. F., Ford, D., Bishop, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+and+ovarian+cancer+incidence+in+BRCA1-mutation+carriers.+Breast+Cancer+Linkage+Consortium.">Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 56 (1), 265-271 (1995).</li><li>Rebbeck, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Oophorectomy+in+Carriers+of+BRCA1or+BRCA2Mutations.">Prophylactic Oophorectomy in Carriers of BRCA1or BRCA2Mutations.</a> New England Journal of Medicine. 346 (21), 1616-1622 (2002).</li><li>Olivier, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcome+of+prophylactic+oophorectomy+in+BRCA1/BRCA2+mutation+carriers+and+events+during+follow-up.">Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up.</a> British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Development of therapies to target disseminated cells requires a mechanistic understanding of metastatic colonization, the critical first step in the development of peritoneal disease. To address these issues we report approaches that can be used to discern how the omentum&#8217;s unique tissue composition and architecture promote ovarian cancer metastatic colonization. Distinguishing features of our approach are: 1) the focus on early events in the colonization process; 2) comparison of milky spot-containing an...

En katı tümörlerin aksine, yüksek dereceli seröz yumurtalık kanseri (HGSC) için metastazlar periton boşluğuna 1 ile sınırlıdır. Böylece, etkili periton tedaviler potansiyel kontrol etmek veya ortadan kaldırmak HGSC olabilir. Şu anda, standart bir tedavi yaklaşımı kemoterapi 1-3 ile kombine cerrahi sitoredüksiyon olduğunu. Ne yazık ki, hastaların büyük çoğunluğu deneyim ve hastalığın tekrarlama komplikasyonlara yenik. Bu kasvetli istatistikler metastatik kolonizasyon geliştirilmiş anlayış ihtiyacını göstermek, süreç hangi kanser hücreleri, kullanmak ve metastaz 2 oluşturmak için konak dokuları içinde çoğalmaya lokalize. Omentum metastazı HGSC 4-7 tercih edilen erken bir sitedir. Diğer periton adipoz aksine, omentum yağ dokusu, periton homeos kilit rol oynayan B, T ve NK hücreleri ve makrofajlar bulunur sütlü noktalar, olarak bilinen sıradışı bağışıklık yapıları içeriyortasis 8,9. Fizyolojik fonksiyonlara ek olarak, süt noktalar, yumurtalık kanseri, metastatik kolonizasyon 4 aktif bir rol oynadığı bulunmuştur. Hızlı ana süt noktalar yumurtalık kanser hücreleri, salgılanan bir kemotaktik faktör doğru hareket ettiğini göstermektedir; deneysel metastaz tahlilleri, SKOV3ip.1, CaOV3 ve HeyA8 (insan) ve ID8 (C57BL / 6 fare) kullanılmaktadır. İlginçtir, kanser hücreleri sütlü noktalar (yani, gonad ve rahim yağ) 4 eksik periton adipoz kolonize yok. Sütlü nokta kolonizasyonu düzenleyen mekanizmaları belirlemek amacıyla, biz metastatik kolonizasyon 4 süresi boyunca hücresel ve moleküler olayların sorgulama sağlayan ksenogref modellerini optimize ettik. Bu tarifnamede tarif edilen yaklaşımların özel bir avantajı, tam olarak, in vivo olarak entegre edilmiştir ve m ex vivo modeller kullanıcıların hipotezleri test sağlayan doku mimarisi ve işlevi üzerinde vurgulamasıdıretastatic kolonizasyon 4,10. Içeren veya sütlü noktalar eksikliği ya periton yağ depolarında kanser hücre lokalizasyonu ve büyümeyi karşılaştırarak, araştırmacılar arasında ve fizyolojik ilgili dokularda yumurtalık kanseri hücrelerinin ilerleyici büyüme için sütlü noktalar içinde adipositlerde ve hücrelerin göreceli katkısını (ler) test edebilirsiniz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection Tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geimsa</td>
			<td>Fluka/Sigma Aldrich</td>
			<td>48900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Without calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stomacher</td>
			<td>Seward Labsystems</td>
			<td>Stomacher 80 Biomaster</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microstomacher bag</td>
			<td>Stomacher Lab Systems</td>
			<td>BA6040/Micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture plate insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer metastatic colonization of milky spot structures in peritoneal adipose

Yüksek dereceli seröz over kanseri (HGSC), yaygın periton metastazı nedeni, son derece kötü prognoz devam eder; Kadınların% 30&#39;dan azının 5 yıl teşhisten sonra hayatta. Omentum HGSC metastaz oluşumunun tercih edilen bir edilir. Bu mikro-klinik önemine rağmen, yumurtalık kanseri ilerlemesine omental adipoz dokudan katkısı örüntüsü oldukça kalır. Bu damar yoğun yuvalar çevreleyen süt B, T oluşmaktadır noktalar, ve NK hücreleri, makrofajlar ve projenitör hücreleri olarak bilinen yapılar içeren, omental adipoz olağan değildir. Sütlü noktalar periton homeostazı için gerekli olan omentum fizyolojik fonksiyonları, önemli bir rol oynamaktadır. Bu süt noktalar da periton adipoz yumurtalık kanseri, metastatik kolonizasyonunu periton metastaz gelişimini önemli bir adım teşvik göstermiştir. Burada yaklaşımlar biz değerlendirmek ve başına sütlü noktalar ölçmek için geliştirilen açıklamakadipoz itoneal ve in vivo ve ex vivo hem de omental doku yumurtalık kanseri hücresi metastatik kolonizasyon işlevsel katkı çalışma. Bu yaklaşımlar, böylece yaygın periton metastazı gelişimine sütlü nokta yapılarına hücrelerin ilk lokalizasyonu yumurtalık kanseri metastazı oluşumu çalışma sağlayan, fare modelleri ve hücre hatları ek genelleştirilebilir.

Periton Fat Depolarında Tanımlanması ve Histolojik İnceleme Brüt anatomik diseksiyon periton yağ (Şekil 1A) beş başlıca kaynaklarından dört belirlenmesini sağlar. Üst merkezine saat yönünde hareket eden şunlardır: omentum (OM; özetlenen) (ah), sol yumurtalık (ov), rahim yağ (UF) rahim boynuzları bağlı çevreleyen mide ve dalak, gonadal yağ (GF) üzerinde bulunan ve mezenter (MY) ince bağırsağın (si) bağlı. Yumurtalık (ov), ute...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose at JoVE.com

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Vivo ve Ex Vivo Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar içinde

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

in-vivo-ex-vivo-approaches-to-study-ovarian-cancer-metastatic

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Medicine

Unit 2

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

Cancer

SCIENTISTS IN ACTION

12.9K Görüntüleme.  The University of Chicago. We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Video: In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex Vivo Enfeksiyon Oncolytic Virüsler Canlı Doku

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Tıp

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Bir In Vitro</emMetastatik Büyüme Tümör Dormansi ve Switch Eğitim> Sistem

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

Bir İnsan<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aterosklerotik Plak Model Lezyon Biyoloji Eğitim için

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

Hücre Takip için vivo 19 F MRG

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Moleküler Kolorektal Kanser Hücrelerinin bir 3-Boyutlu Modeli İnvaziv tümör mikro Profili ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fibroblastlar

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model İnsan Meme Hormon Eylem Eğitim için

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Nanobody ve Antikor Temelli Doğrulama<em&gt; İn Vivo</emFarelerde&gt; Tümör Xenograftlarında NIRF-görüntüleme Deneyler kullanma<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sitometrisi ve Mikroskopi

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

İnsan Dupuytren en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Miyofibroblastların Çalışması ve Ekstrasellüler Matriks Etkileşimleri Kültür

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Rahim içi Telemetri Fare Kontraktil Basıncını Ölçmek<em&gt; İn Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...