Name: measuring dna damage and repair in mouse splenocytes after chronic in vivo exposure to very low doses of beta- and gamma-radiation
Uploaded: 2015-07-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).

Tüm fare kullanımı ve tedavi prosedürleri, yerel hayvan bakım komitesi tarafından yasama ve / veya hayvan bakım programları tarafından belirlenen ve onaylanan kurallara uymalıdır. Bu protokol açıklanan tüm yöntemler, yerel hayvan bakım komitesi onayı ile Hayvan Bakımı Kanada Konseyi kurallarına uygun olarak yapıldı. DİKKAT: radyoaktivite ile tüm çalışma (dahil, ancak radyoaktif hayvan dokuları, yatak atık taşıma, Trityum taşınması, dış γ-radyasyon sınırlı olmayan) Yasama ve / veya radyasyon koruma yetkilileri tarafından belirlenen kurallara uymak gerekir ve yetkili tarafından gerçekleştirilmelidir sertifikalı laboratuvar ve / veya tesis personel. 1. Hayvan Çalışması <ol><li> Hayvan gruplandırma <ol><li> Fareler, bir dış kuruluş gelen yapıyorsanız, hayvan barınağında en az 10 gün süreyle hayvan iklime alıştırmak. Çalışma birden fazla tedavi grupları içeriyorsa, hayvan tedarikçisi al gönderebilirsiniz sağlamaktek bir toplu iş olarak l hayvanlar. </li><li> Rastgele grup başına 10 farelerden oluşan gelişigüzel tedavi gruplarına tahsis fareler. C57BL / 6 suşu erkek fareler kullanıyorsanız, saldırganlık sorunları azaltmak için kendi tesislerinde çok genç C57BL / 6 erkek rasgele ön düzenlemek hayvan tedarikçisi var. </li></ol></li><li> İç β-Radyasyon Fareler Kronik Maruz <ol><li> YTO ve OBT çözeltiler (toz haline getirilmiş olan prolin, alanin ve glisin amino asitler karışımı) orjinal stok seyreltilmesi ile bir fare, içme suyu içinde çalışan trityum konsantrasyonları (10 kBq / L ve 1 MBq / L) hazırlayın. </li><li> Bir sıvı sintilasyon sayacı kullanılarak radyoaktivite ölçülerek, içme suyu içinde trityum nihai konsantrasyonlar doğrula. Gerekirse, konsantrasyonları ayarlayın. </li><li> Trityum suya erişim ad libitum sağlayarak bir ay boyunca hayvanları davranın. Tedavi su, iki haftalık dönemde düşük alırsa, daha fazla su ekleyin. Aksi takdirde, iki hafta şişe değiştirin. </li><li> Treat sahte-ışınlanmış kontrolfareler aynı. Ayrı bir &quot;temiz&quot; bir odada veya havadan trityum çapraz bulaşmayı önlemek için pozitif hava basıncı altında ayrı bir &quot;temiz&quot; raf tutun. </li></ol></li><li> Dış γ-Radyasyon Fareler Kronik Maruz Not: γ-ışınlama tesisi / ekipman konumuna bağlı olarak değişir. </li><li> Dozimetri mevcut yöntemler kullanarak, istenilen doz oranlarını üreten radyasyon alanlarına sahip bir γ-radyasyon kaynağından mesafeleri belirler. Hayvan kafesleri kapsayan alanlarda radyasyon alanlarının homojenliği sağlamak. Not: 1.7 μGy / h 1 MBq / gövde L tritium ile üretilen bir doz hızı eşdeğerdir. </li><li> Bir ay boyunca adım 1.3.1 belirlenen mesafelerde fare kafesleri koyarak fareler Açığa. 30 dakika γ-ışınlama günlük kesinti en aza indirin. Toplam absorbe doz ölçmek için termolüminesans dozimetreleri kullanın. </li></ol> 2. Kurbanlar ve Örnekleme <ol&gt; <li> Takılı 70 mikron hücre süzgeçler, 15 ml ve 1.5 ml tüpler ile steril cerrahi aletler, 60 mm petri kaplarına hazırlayın, hepsi bir biyolojik güvenlik kabini içinde% 5 fetal sığır serumu (FBS) ve yeri ile desteklenmiş RPMI medya. Işin sterilite sağlanması çok önemlidir. </li><li> Her bir 60 mm Petri kabı içine RPMI ortam 5 ml koyun. </li><li> Yerel hayvan bakım komitesi tarafından onaylanmış bir yöntem kullanılarak fareler Kurban. Servikal dislokasyon bu protokolü açıklanan splenosit çalışmaları için iyi bir seçimdir. (MFISH, sitokalasin bloğu mikronükleus ya da başka yaygın genetoxicity deneyleri için, örneğin), diğer deneyler için kan örnekleri gerekmektedir, ancak, izofluran ile anestezi sonrasında içi kardiyak ponksiyon kullanın. </li><li> Baş sizden uzağa bakacak şekilde, sırt yatma hayvan yerleştirin. % 70 etanol ile fare aşağı püskürtün. Forseps kullanarak, üretral açılış anteriora cildi kapmak ve perine bölgesinde makas ile küçük bir kesi yapmak. <ol&gt; <li> Bu kesi itibaren, sadece altında kas duvarı cildi kesip değil dikkatli olmak, göğüs boşluğuna ventral orta hat boyunca kesilir. Orta hatta uzak cildi parçalara ayır. </li><li> Forseps ile karın duvarı kavrayın ve karın boşluğunu açmak için kas duvarının medyan ekseni boyunca kesti. </li></ol></li><li> Hafifçe aynı anda makas ile bağ dokusu uzakta kesim sırasında üzerinde çekerek nazikçe steril forseps ile sürükleyici ve dalak tarafından tüketim. </li><li> 1.5 ml tüp içinde dalak (dalak yaklaşık 1/10) ve yerine küçük bir parça kesin. Ek bileşen ilave deneyler için -80 ° C&#39;de daha sonra depolama için sıvı azot içinde dondurularak. </li><li> Önceden tevzi RPMI ortam 5 ml bir 60 mm Petri kabı içinde bir hücre süzgecinden içine dalak kalan yerleştirin. </li><li> Bir sonraki fare devam edin. Not: Çıkarılan dalak medya ile 60 mm yemekleri tutulabilir farelerin kalan feda iken (en fazla 2 saat boyunca)ed. 5 ve 15 fareler arasında, katılan insan sayısına bağlı olarak, bir gün içinde işlenebilir. </li></ol> Splenosit kültürleri 3. hazırlanması <ol><li> Kavisli ucu ile steril forseps ile bir hücre süzgeç içine kıyma ile dalak homojenleştirin. </li><li> Hücre süzgecinden çıkarın ve 15 ml&#39;lik bir tüp içine 60 mm çanak filtre hücre süspansiyonu toplanır. </li><li> Hücrelerin geri kalanı toplamak için ortam 5 ml hücre süzgecinden durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj tüpleri. </li><li> Boşaltın süpernatan ve RPMI, 10 ml pelet yeniden askıya. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj tüpleri. </li><li> Boşaltın süpernatan ve RPMI, 5 ml tam içinde topağın tekrar askıya. </li><li> 25 ml&#39;lik bir doku kültürü şişesi içine Aktarım hücre süspansiyonu, 4 ml bir CO2 inkübatör kaldırma (37 ° C,% 5 CO2,% 80 nem) </li></ol> 4. Radyasyon Zorlu ve Sabitleme <ol><li> Transferi4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g buz ve santrifüj üzerinde 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine adım 3.8 hücre süspansiyonu 1 ml kalmıştır. Bu örnek ölçülen DNA hasarı, bir DNA onarım eğrisinin oluşturulması için, her iki tedavi kaynaklı hasar ve t = 0, veri noktasını temsil eder. </li><li> Dikkatle bir vakum pompası kullanılarak süpernatant aspire. Yavaşça TBS tamponu (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCI, 2.7 mM KCI) 1 ml pelet yeniden askıya. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj tüpleri. Dikkatle bir vakum pompası kullanılarak süpernatant aspire. Yavaşça TBS 300 ul pelet yeniden askıya. </li><li> Düşük hızda bir girdap ile karıştırılarak birlikte, -20 ° C,% 100 etanol içinde 700 ul ilave edin. Kapağı kapatın ve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin. </li><li> -20 ° C&#39;de örnekleri saklayın. Etanol içinde sabit splenositler γH2AX sinyal içerisinde herhangi önemli bir kayıp olmadan en az 12 ay boyunca -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Zorlu bir γ-rad ile adım 3,8 splenosit kültürleri saçmak<html> Mevcut ışınlama cihazı kullanarak bir doz hızı ≥ 200 mGy / dk 2 Gy iation dozu. Not: Bu ışınlama amacı tamir makineleri meydan DNA DSB ikna etmektir. X-ışınları, aynı zamanda bu amaç için kullanılabilir. </li><li> Hemen bir CO 2 inkübatör kültürleri dönün. </li><li> 1 saat zorlu 2 Gy radyasyon sonrası, biyolojik güvenlik kabini için inkübatör kültürleri kaldırın. Temsili bir numune kısım toplamak için, yavaşça buz üzerinde 1.5 ml tüp bir pipet ve hücre süspansiyonu transferi 1 ml kullanarak hücrelerin yeniden askıya. CO 2 inkübatör hücre kültürleri dönün. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj tüpleri. Dikkatle bir vakum pompası kullanılarak süpernatant aspire. Yavaşça TBS 1 ml pelet yeniden askıya. </li><li> Tekrarlayın 4.3 adımları - 4.5. </li><li> 24 saat zorlu 2 Gy γ-radyasyon, hasattan sonra ve adım 4.8 açıklandığı gibi 24 saat numunenin = at düzeltmek - 4.10. </li></ol>tle &quot;&gt; 5. Anti-γH2AX Antikor ile Immunofluorescent Etiketleme Not: Genellikle, 15 - 30 günlük örnekler immunofluorescently etiketlenmiş ve tek seferde akış sitometresi ile analiz edilebilir. Tedavi grupları arasında bir karşılaştırma sağlamak için her bir gruptan bir örnek (ler) içerir. Ayrıca daha detaylı bilgi için 16 referans bakın. <ol><li> Buz üzerinde etiketli numune sayısı için tüplerin seti işlenecek ve yer hazırlayın. 12 x 75 mm kapatılmamış cam tüpler kullanın. Sterilite, bu iş için gerekli değildir. (&quot;2nd Ab sadece&quot;) Sadece ikincil antikor ile etiketleme için bir ek tarihsel kontrol örneği ekleyin. Bir çalışma içinde çalıştırmak sitometri her akışında bu tarihi kontrol örneği kullanın. </li><li> Her tüpe buz soğukluğunda TBS 0.5 ml ilave edilir. </li><li> 5 saniye süreyle -20 ° C&#39;de, girdap gelen sabit splenositlerin çıkarın ve TBS ile hazırlanan borular için 0.5 ml&#39;lik bir şişe aktarılır. -20 ° C depolama geri numunelerin kalanını yerleştirin veYedek örnek olarak tutun. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj splenositler. Süpernatant boşaltacaktır ve yavaşça% 1 FBS içeren buz gibi soğuk TBS içinde 1 ml pelet yeniden askıya </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüje hücreleri. TST tamponunda (TBS içinde% 0.05 Triton X-100,% 2 FBS) 1 ml pelet yeniden askıya hafifçe süpernatant boşaltacaktır ve. Buz üzerinde 20 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüje hücreleri. Süpernatant boşaltacaktır ve yavaşça 1 seyreltilmiş birincil anti-γH2AX antikoru 200 ul pelet yeniden askıya: TCT tampon maddesi içinde 150. &quot;2nd Ab sadece&quot; kontrol numunesi için TDT 200 ul kullanın. </li><li> 45 &#39;lik bir açıda dönen bir çalkalayıcı üzerinde Pozisyon borular - 60 ° ve oda sıcaklığında 300 xg&#39;de 1.5 saat çalkalanır. </li><li> TCT tampon maddesi içinde 200 seyreltme: tüpler kuluçka iken, bir 1 Alexa-488 ile konjüge edilmiş keçi anti-fare ikincil antikoru yeterli bir hacmi (200 ul / numune) hazırlanması. Not: Alexa-488 içeren tüm çalışmakonjuge antikor (5.10 aşağıda 5.16 adımları) loş ışık koşullarında yapılmalı ve etiketli örnekler alüminyum folyo tüpler sararak ışıktan korunmalıdır. </li><li> 1.5 saat inkübasyon işlemi tamamlandıktan sonra, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de Her bir tüp ve santrifüj% 2 FBS içeren buz gibi soğuk TBS içinde 1 ml. % 2 FBS içeren TBS içinde 1 ml pelet yeniden askıya hafifçe süpernatant boşaltacaktır ve. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Aşama 5.8 ile ilgili ikincil antikor çözeltisinin 200 ul pelet yeniden askıya hafifçe süpernatant boşaltacaktır ve. </li><li> Aşama 5.7 olarak 1 saat süre ile bir çalkalama platformu üzerinde inkübe edin. </li><li> % 1 FBS içeren buz gibi soğuk TBS 1 ml ilave edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant boşaltacaktır ve yavaşça buz soğukluğunda TBS içinde 1 ml pelet yeniden askıya. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant boşaltacaktır ve yavaşça 50 ug / ml ihtiva eden TBS içinde 0.5 ml pelet yeniden askıyapropidiyum iyodür. </li><li> Işıktan korunan, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Alet özgü protokoller 16 kullanarak bir akış sitometresinde örnekleri analiz edin. Numune başına en az 10.000 hücre okuyun. </li></ol>

<ol>
	<li>Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptive+response+modifies+latency+for+radiation-induced+myeloid+leukemia+in+CBA/H+mice.">The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice.</a> Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).</li><li>Shadley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+adaptive+response+in+human+lymphocytes.">Chromosomal adaptive response in human lymphocytes.</a> Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).</li><li>Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+[3H]thymidine-induced+adaptive+response+of+human+lymphocytes+to+subsequent+doses+of+X-rays+involves+the+induction+of+a+chromosomal+repair+mechanism).">Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism).</a> Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).</li><li>Mitchel, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dose+window+for+radiation-induced+protective+adaptive+responses.">The dose window for radiation-induced protective adaptive responses.</a> Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).</li><li>Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+no-threshold+relationship+is+inconsistent+with+radiation+biologic+and+experimental+data.">The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data.</a> Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).</li><li>Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+stability+and+the+DNA+double-stranded+break+connection.">Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection.</a> Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).</li><li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+repairing+DNA+double-strand+breaks.">Sensing and repairing DNA double-strand breaks.</a> Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+(125)IdU-induced+DNA+double-strand+breaks+with+gamma-H2AX+antibody.">Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody.</a> Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).</li><li>Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus+on+histone+variant+H2AX:+to+be+or+not+to+be.">Focus on histone variant H2AX: to be or not to be.</a> FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).</li><li>Taneja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2AX+phosphorylation+as+a+predictor+of+radiosensitivity+and+target+for+radiotherapy.">Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy.</a> J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+histone+H2AX+in+spheroids,+tumors,+and+tissues+of+mice+exposed+to+etoposide+and+3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide.">Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide.</a> Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).</li><li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions.">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4 (2010).</li><li>Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+DNA+double-strand+breaks+is+not+modulated+by+low-dose+gamma+radiation+in+C57BL/6J+mice.">Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice.</a> Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).</li><li>Runge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+interpretation+of+ionizing+radiation-induced+gammaH2AX+foci+by+the+novel+pattern+recognition+system+AKLIDES(R).">Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R).</a> Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).</li><li>Jucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FociCounter:+A+freely+available+PC+programme+for+quantitative+and+qualitative+analysis+of+gamma-H2AX+foci.">FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci.</a> Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).</li><li>Garty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RABIT:+a+rapid+automated+biodosimetry+tool+for+radiological+triage.">The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage.</a> Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).</li><li>Kovalchuk, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+DNA+repair+in+radiation-exposed+mice.">Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice.</a> Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).</li><li>Rube, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+in+the+context+of+chromatin:+new+molecular+insights+by+the+nanoscale+detection+of+DNA+repair+complexes+using+transmission+electron+microscopy.">DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy.</a> DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).</li><li>Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+stress+genes+by+low+doses+of+gamma+rays.">Induction of stress genes by low doses of gamma rays.</a> Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).</li></ol>

The authors declare that there are no known competing financial interests.

Bu makalede sunulan protokol iyonize radyasyon dahil olmak üzere çeşitli kimyasal ve fiziksel ajanların düşük seviyelerde, genotoksik etkilerini inceleyen in vivo çalışmalar büyük ölçekli fare yürütülmesi için yararlıdır. Bizim eşsiz spesifik patojen içermeyen bir hayvan tesisi GammaBeam 150 ışınlayıcılar ile donatılmış ve 30 metre uzunluğundaki ışınlama salonu yüzlerce ya da farelerin hatta binlerce düşük ya da çok düşük doz oranı aydınlatılmasını kapsayan yaşam ...

(Kitle iletişim araçlarının şiddetlenir) radyasyon ve Hiroşima ve Nagasaki atom bombalama ve nadir nükleer santral kazalarının görüntüleri ile tahrik radyasyon halkın korku iyonize düşük ya da çok düşük dozlarda ya potansiyel zararlı etkileri üzerinde önemli tartışma, yol açmıştır çok sıkı radyasyondan korunma yönetmeliği ve potansiyel bilimsel haklı değildir standartları. Son üç yıl içinde, çok sayıda raporlar zararlı olmaması ve düşük doz radyasyon 1-4 tarafından uyarılan potansiyel olarak yararlı biyolojik etkiler varlığını hem de belgelenmiştir. büyük radyasyon sağlık risk faktörü radyasyon yüksek veya orta doz alan atom bombası kurtulanların epidemiyolojik çalışmalara dayanarak tahmin edilen kanser olasılığı vardır. (Yani doğrusal-no-eşik veya LNT modeli olarak adlandırılır) Bu verilerin lineer ekstrapolasyonu düşük dozlarda kanser riskini tahmin etmek için kullanılır. Ancak, bu yaklaşım, dünya çapında bilimsel kabul almadıve ağır 5 tartışmalıdır. Daha çalışmalar bu konuyu açıklığa kavuşturmak ve muhtemelen radyasyondan korunma standartlarını iyileştirmek için gerekli olduğu açıktır. Bu tür çalışmalar, DNA hasarı oranları, DNA tamiri ve mutasyon olarak ve son puan (insan etkileri tahminde için en iyi) in vivo hayvan modellerinde kronik tedaviler (çevresel ve mesleksel maruziyet en iyi yaklaşım), içermelidir. DNA mutagenez ve kanser gelişimi 6 yol açabilir radyasyon etkileri ve eksik ya da yanlış onarım zarar için öncelikli hedef olduğu bilinmektedir. DNA çift iplikli sonları (DSB), DNA lezyonlarının en zararlı türlerinden biri olan ve hücre ölümü ve tümörogenez 7 yol açabilir. Dolayısıyla, önemli bir güvenilir ve doğru bir düşük doz radyasyon ve / veya kimyasal kirleticilerin gibi diğer stres, maruz kaldıktan sonraki DSB düzeyini ölçmek mümkün edilir. En duyarlı ve spesifik belirteçler biriDNA DSB γH2AX 8 olarak adlandırılan, fosforile edilmiş histon H2AX, henüz diğer belirteçler ve yöntemler 9,10 önerilmiştir. Bu H2AX moleküllerinin binlerce indüklenen bir DSB yakınında, bir anti-γH2AX antikoru ve floresan mikroskobu 11 immünofloresan etiketleme tek tek DSB saptanmasını sağlayan γH2AX oluşumunda yer olduğu tahmin edilmektedir. cevap 30 dakika ila 60 maksimuma ulaşan, çok hızlıdır. Kanıt γH2AX sonları sitelere diğer onarım faktörleri çekerek ve kırık DNA uçlarını çapa ve (12 gözden) diğer onarım proteinleri için erişim sağlamak için kromatin yapısını değiştirerek DNA DSB tamirini kolaylaştırır var. DNA DSB onarım tamamlanması üzerine, γH2AX fosforile de ve / veya bozulmaya uğrar ve yeni sentezlenen H2AX molekülleri kromatin 10 etkilenen bölgelerde γH2AX yerini alır. ΓH2AX oluşumunu ve kaybı olabilir İzleme,Bu nedenle, DNA DSB onarım kinetik kesin bir tahmininin sağlanması. Bu yaklaşım, Radyosensitivitenin 13-15 ile ilişkili olduğu gösterilmiş olan radyasyon ve hızı ve kalıntı DSB seviyelerinin yüksek dozlarda ışınlandı, çeşitli insan tümör hücre çizgilerinde DSB onarım incelemek için kullanılmıştır. Biz bu deneysel bir yaklaşım modifiye ve DNA DSB düzeyleri ve tamiri (Şekil 1) Kronik γ- ve β-radyasyon düşük dozlarda etkilerini incelemek için canlı bir fare çalışmasında bunu uyguladık. İlk olarak, içme suyu içinde çözülmüş β-radyasyon için toz haline getirilmiş, su (HTO) şeklinde ya da trityum tarafından yayılan (hidrojen-3) ya da organik olarak bağlanmış trityum (OBT) farelerin bir uzun vadeli kronik maruz kalma gerçekleştirmek için bir yöntem ortaya koymaktadır . İki form birikir ve / ya da farklı vücut ve dolayısıyla dağıtma, farklı biyolojik etkilere beklenmektedir. Her iki form nükleer endüstride potansiyel tehlikeler vardır. Bu tedavibunların nispi biyolojik etkinliğinin değerlendirilmesi için çok önemlidir, iki radyasyon türlerinin doğru bir karşılaştırmasını izin vermek için, bir eşdeğer bir doz oranında γ-radyasyonuna kronik maruz kalınması ile paraleldir. Beta-radyasyon γ-radyasyon, yüksek enerjili fotonların den çok farklı kılan, elektron oluşmaktadır. Bu nedenle farkı, Β-radyasyon çoğunlukla iç sağlık tehlikesi temsil eder ve γ-radyasyon ile karşılaştırıldığında farklı biyolojik etkilere neden olabilir. Bu komplikasyon β-radyasyon için YTO yaydığı maruz düzenlenmesi üzerinde önemli tartışmalar sonuçlandı. Böylece, halk için içme suyu YTO düzenleyici düzeyleri Avrupa&#39;da 100 Bq / L Avustralya&#39;da 75,000 Bq / L arasında değişmektedir. Bu γ-radyasyon eşdeğer dozlara tibial osteotomi biyolojik etkilerini karşılaştırmak için, bu nedenle çok önemlidir. İkincisi, DNA DSB oranı immunofluorescently tespit γH2AX etiketli kullanarak kronik maruziyetin tamamlanmasıyla izole splenositlerde ölçülürflow sitometri tarafından ed. Bu in vivo maruz kalma açtığı DNA hasarının ölçüde değerlendirilmesini sağlamaktadır. Ancak, bu gibi düşük düzeyde maruz DNA DSB tespit edilebilir herhangi bir fiyat vermeyebilir beklemek mantıklıdır; Bunun yerine, bazı gizli değişiklikleri / yanıtları DNA hasarı onarmak için hücrelerin yeteneğini etkileyebilir ki beklenebilir. Bu değişiklikler bulursa, olabilir, ya uyarıcı (zararlı bir etki üreten) (faydalı bir etki oluşturarak) ya da inhibitör. önerilen protokol hasarı önemli miktarda üretir radyasyon yüksek bir doz ile ekstre splenositlerin zorlayarak bu tür değişiklikleri ortaya sağlar (örneğin, 2 Gy yaklaşık 50 hücre başına DNA DSB veya 3 üretilmesi -. Toplam γH2AX seviyesinde 5 kat artış) . Daha sonra, DSB onarım başlangıç ​​ve bitiş yansıtan oluşumu ve γH2AX kaybı, akış sitometrisi tarafından izlenir. Bu şekilde, taban ve DNA DSB tedavisi kaynaklı seviyeleri sadece ölçülen edilebilir, ancakAyrıca hücrelerin yeteneği üzerindeki potansiyel etkisi yanıt ve onarım DNA hasarı çok daha yüksek stres seviyeleri tarafından uyarılan.

<table><tbody><tr><td>HTO: tritiated water, [3H]</td><td>locally obtained from a nuclear reactor&amp;nbsp;</td><td></td><td>stock activity 3.7 GBq/mL;&amp;nbsp; can be substituted with HTO from Perkin Elmer</td></tr><tr><td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET348005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET004005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET323005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>tritiated water, [3H] (HTO)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET001B005MC</td><td>substitute for HTO of local origin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GammaBeam 150 irradiator</td><td>Atomic Energy of Canada Limited</td><td>locally manufactured</td><td>can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td>Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL</td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051-100ML</td><td></td></tr><tr><td>anti-gH2AX antibody, clone JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody</td><td>Life Technologies (formerly Invitrogen)</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P006-EAAN</td><td>500 ml bottles Absolute Ethanol</td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>2682550</td><td>microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5</td><td>sterile polypropylene centrifuge tubes</td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td>Linde</td><td>P110403</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm uncapped glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>K60B1496126</td><td>disposable borosilicate glass tubes with plain end</td></tr><tr><td>T25 flasks</td><td>VWR</td><td>CA15708-120</td><td>nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)</td></tr><tr><td>scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td>Wagner scissors 12 cm sharp/sharp</td></tr><tr><td>forceps, straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>Semken forceps 13 cm, straight</td></tr><tr><td>forceps, curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td>Narrow Pattern forceps 12 cm, curved</td></tr><tr><td>60 mm petri dishes</td><td>VWR</td><td>CA25382-100</td><td>BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm</td></tr><tr><td>cell strainers, 70 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Falcon cell strainers 50/case</td></tr><tr><td>PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td></tr><tr><td>TBS recipe: to make 10x stock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 g TRIS HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253-1KG</td><td>Trizma hydrochloride</td></tr><tr><td>88 g NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Sodium Chloride</td></tr><tr><td>2 g KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Potassium Chloride</td></tr><tr><td>Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring dna damage and repair in mouse splenocytes after chronic in vivo exposure to very low doses of beta- and gamma-radiation

Düşük doz radyasyon yüksek radyasyon dozları tarafından üretilen etkilerden nicelik ve nitelik olarak farklı biyolojik etkileri çeşitli üretebilir. Doğru ve bilimsel haklı bir şekilde, çevre, mesleki ve halk sağlığı güvenliği ile ilgili sorulara yanıt ağır doğru radyasyon ve kimyasal madde iyonize olarak düşük doz kirleticilerin, biyolojik etkilerini ölçmek için yeteneği dayanır. DNA hasarı ve onarımı nedeniyle kanser gibi potansiyel uzun vadeli sonuçları, sağlık riskleri en önemli erken göstergeleridir. Burada fare dalak hücrelerinde DNA hasarı ve onarımı üzerine γ- ve β-radyasyon düşük dozlarda in vivo maruz kalma kronik etkisini incelemek için bir protokol açıklar. DNA çift iplikli kırılmalara bir genel kabul görmüş kalem kullanarak, γH2AX denilen fosforile histon H2AX, biz DNA hasarı sadece düzeylerini değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek değil, aynı zamanda değişirDNA onarım kapasitesi potansiyel in vivo pozlarda düşük dozda tarafından üretilen. Örneklerin çok sayıda immunofluorescently etiketli γH2AX hızlı, doğru ve güvenilir bir ölçüm sağlar akım sitometrisi. DNA çift sarmallı mola onarımı (DNA onarımını tetiklemek için tatili yeterli sayıda üretmek için 2 Gy zorlu doz ayıklanır splenositlerin teşhir ederek ve isteyerek (1 saat sonrası radyoterapi) ve kalan DNA hasarını ölçerek 24 saat değerlendirilebilir post-ışınlama). Kalıntı DNA hasarı eksik onarımı ve uzun vadeli genomik instabilite ve kanser riski göstergesi olabilir. Kolayca in vivo çalışmalar (örneğin, kromozom anormallikleri, kemik iliği retikülositlerde Mikronukleus frekansları, gen ekspresyonu, vs.) gibi ölçülebilir diğer deneylerden ve son-nokta ile birlikte, bu yaklaşım, biyolojik etkileri arasında doğru ve bağlamsal değerlendirme sağlar düşük düzeyde stres.

Splenosit için beklenen grafikler burada açıklanan yöntem kullanılarak hazırlandı sitometrisi Şekil 2, akış örneklerini göstermektedir. Hücreler ilk &lt;elektronik hacim tarafı dağılım&gt; scatter plot dayalı kapılı (Şekil 2A ve 2B, elektronik hacim forward scatter eşdeğerdir). FL3 / propidyum iyot histogramlar (Şekil 2B ve 2E), normal hücre döngüsü dağılımı onaylayın. FL1 kanalı kullanılarak hesaplan?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation at JoVE.com

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Kronik sonra fare dalak DNA hasar ve Onarım Ölçme<em&gt; In Vivo</em&gt; Beta ve gamma-Radyasyonun Çok Düşük Doz Maruz Kalma

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

measuring-dna-damage-repair-mouse-splenocytes-after-chronic-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

11.0K Görüntüleme.  Canadian Nuclear Laboratories. A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented. 

Video: Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Kanser Araştırmaları

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Genetik

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas including genome integrity, genotoxicity, radiation biology, aging, cancer, and drug development. In response to DSB, the histone H2AX is phosphorylated at Serine 139 in a region of several megabase pairs forming discrete nuclear foci detectable by immunofluorescence microscopy. In addition, 53BP1 (p53 binding protein 1) is another important DSB-responsive protein promoting repair of DSB by nonhomologous end-joining while preventing homologous recombination. According to the specific functions of &#947;H2AX and 53BP1, the combined analysis of &#947;H2AX and 53BP1 by immunofluorescence microscopy may be a reasonable approach for a detailed analysis of DSB. This manuscript provides a step-by-step protocol supplemented with methodical notes for performing the technique. Specifically, the influence of the cell cycle on &#947;H2AX foci patterns is demonstrated in normal fibroblasts of the cell line NHDF. Further, the value of the &#947;H2AX foci as a biomarker is depicted in x-ray irradiated lymphocytes of a healthy individual. Finally, genetic instability is investigated in CD34+ cells of a patient with acute myeloid leukemia by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

This manuscript provides a protocol for the analysis of DNA double-strand breaks by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

ΓH2AX ve 53BP1 oluşumu ve DNA çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Biyomühendislik

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, including cancer. The cell is, therefore, provided with complex mechanisms to repair DSBs, and these pathways involve histone H2AX in its phosphorylated form at Ser-139 (namely &#947;H2AX) and p53 binding protein 1 (53BP1). As both proteins can form foci at the sites of DSBs, identification of these markers is considered a suitable method to study both DSBs and their kinetics of repair. According to the molecular processes that lead to the formation of &#947;H2AX and 53BP1 foci, it could be more useful to investigate their co-localization near the DSBs in order to set up an alternative approach that allows quantifying DSBs by the simultaneous detection of two DNA damage markers. Thus, this protocol aims to assess the genomic damage induced in human lymphocytes by the radiomimetic agent bleomycin through the presence of &#947;H2AX and 53BP1 foci in a dual immunofluorescence. Using this methodology, we also delineated the variation in the number of &#947;H2AX and 53BP1 foci over time, as a preliminary attempt to study the repair kinetics of bleomycin-induced DSBs.

This protocol presents a method to assess the formation and repair of DNA double-strand breaks through the simultaneous detection of &#947;H2AX and 53BP1 foci in interphase nuclei of bleomycin-treated human peripheral lymphocytes.

İnsan Periferik Lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1'in İkili İmmünofloresansı

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a pseudostratified epithelium lining the lateral ventricles of the embryonic brain. Genotoxic stresses, such as ionizing radiation, have highly deleterious effects on the developing brain related to the high sensitivity of NSPC. Elucidation of the cellular and molecular mechanisms involved depends on the characterization of the DNA damage response of these particular types of cells, which requires an accurate method to determine NSPC progression through the cell cycle in the damaged tissue. Here is shown a method based on successive intraperitoneal injections of EdU and BrdU in pregnant mice and further detection of these two thymidine analogues in coronal sections of the embryonic brain. EdU and BrdU are both incorporated in DNA of replicating cells during S phase and are detected by two different techniques (azide or a specific antibody, respectively), which facilitate their simultaneous detection. EdU and BrdU staining are then determined for each NSPC nucleus in function of its distance from the ventricular margin in a standard region of the dorsal telencephalon. Thus this dual labeling technique allows distinguishing cells that progressed through the cell cycle from those that have activated a cell cycle checkpoint leading to cell cycle arrest in response to DNA damage.
An example of experiment is presented, in which EdU was injected before irradiation and BrdU immediately after and analyzes performed within the 4 hr&#160;following irradiation. This protocol provides an accurate analysis of the acute DNA damage response of NSPC in function of the phase of the cell cycle at which they have been irradiated. This method is easily transposable to many other systems in order to determine the impact of a particular treatment on cell cycle progression in living tissues.

Administration of two analogs of thymidine, EdU and BrdU, in pregnant mice allows the analysis of cell cycle progression in neural and progenitor cells in the embryonic mouse brain. This method is useful to determine the effects of genotoxic stress, including ionizing radiation, during brain development.

Genotoksik Stres sonrası nöral kök ve Fare Gelişmekte Beyin Progenitör Hücrelerinin Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü İlerlemesi

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Nörobilim

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Biyoloji

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and negatively impact patient quality of life and long term survival. Advances in the understanding of the biological pathways associated with normal tissue toxicities have allowed for the development of interventional drugs, however, current response studies are limited by a lack of quantitative metrics for assessing the severity of skin reactions. Here we present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe the instrumentation design of the DOS system as well as the inversion algorithm for extracting the optical parameters. Finally, to demonstrate clinical utility, we present representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema and compare the results with a commonly employed visual scoring. The described DOS method offers an objective, high through-put evaluation of skin toxicity via functional response that is translatable to the clinical setting.

We present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe DOS instrumentation design, optical parameters extraction algorithms and the animal handling procedures required to yield representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema.

Bir fare Modeli Kullanılarak Akut Radyasyondan Bağlı Cilt zehirlilik Kantitatif Değerlendirme optik tayf Diffüz

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Tıp

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of treatment, and help guide dose and schedule setting of therapeutics. From a single blood draw, peripheral blood mononuclear cells can be isolated and processed to analyze and quantify protein markers, and plasma samples can be used for the analysis of circulating tumor DNA, cytokines, and plasma metabolomics. Longitudinal samples from a treatment provide information on the evolution of a given protein marker, the mutational status and immunological landscape of the patient. This can only be achieved if the processing of the peripheral blood is carried out effectively in clinical sites and samples are properly preserved from the bedside to bench. Here, we present an optimized general-purpose protocol that can be implemented at clinical sites for obtaining PBMC pellets and plasma samples in multi-center clinical trials, that will enable clinical professionals in hospital laboratories to successfully provide high quality samples, regardless of their level of technical expertise. Alternative protocol variations are also presented that are optimized for more specific downstream analytical methods. We apply this protocol for studying protein biomarkers against DNA damage response (DDR) on X-ray irradiated blood to demonstrate the suitability of the approach in oncology settings where DDR drugs and/or radiotherapy have been practiced as well as in preclinical stages where mechanistic hypothesis testing is required.

This protocol details clinically implementable preparation of high quality PBMC and plasma biosamples at the clinical trial site that can be used for translational biomarker analysis.

Biyobelirteç Analizi için Klinik Çalışma Alanlarında Tek Bir Kan Çekiminden Periferik Kan Mononükleer Hücre Peletleri ve Plazma Hazırlanması

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

Kronik sonra fare dalak DNA hasar ve Onarım Ölçme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler