Bu makalenin amacı, bleomisin tarafından insan periferik lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı değerlendirmek için Gama H2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı nicelleştirilmesinin uygunluğunu değerlendirmektir. Çeşitli faktörler çift iplikçik kopmalarına neden olabilir. Böylece hücrelere, hem Gama H2AX hem de 53 Bağlayıcı Protein 1'i içeren, çift iplikçik kırılmasının yakınında birlikte lokalize olabilen çeşitli onarım mekanizmaları sağlanır.
Tam kan örneklerini topladıktan sonra, 4.7 mililitre tam ortam içeren bir tüpe 300 mikrolitre numune ekleyin. Daha sonra mililitre bleomisin sülfat nihai konsantrasyonu başına beş mikrogram ekleyin. Her örnek için bir negatif denetim ayarlayın.
Tüpü iki saat boyunca 37 santigrat derecede bir termostata koyun. Numuneleri beş dakika boyunca 540 G'de santrifüj edin. Daha sonra pelet üzerine beş mililitre hipotonik çözelti ekleyin.
Daha sonra hemolize neden olmak için 400 mikrolitre pre fiksatif çözelti ekleyin. Numuneleri beş dakika boyunca 540 G'de santrifüj edin, ardından hücreleri sabitlemek için peletleri oda sıcaklığında beş mililitre metanol içinde en az 30 dakika boyunca tekrar askıya alın. Numuneleri beş dakika boyunca 540 G'de santrifüj edin, ardından peletleri beş mililitre fiksatif çözelti içinde tekrar askıya alın.
Bu adımı bir kez daha yineleyin. Beş dakika boyunca tekrar 540 G'de santrifüj yapın, ardından süpernatantı aspire edin, pelet süspansiyonu için yeterli çözelti bırakın. Yeniden askıya alınmış hücre peletini slaytların üzerine bırakın.
Anti-Gama H2AX ve anti-53BP1 primer antikorlarını içeren iki çözeltiyi bloke edici çözelti içinde çözünmüş olarak hazırlayın. Ardından slaytları PBS 1X'te iki kez yıkayın. Ardından slaytları engelleme çözeltisinde 30 dakika tutun.
Her slayta, blokaj çözeltisi içinde çözünmüş birincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinin 10 mikrolitresini ekleyin. Slaytları parafilmle örtün. Gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, PBS 1X'te beş dakika boyunca üç yıkama yapın. DyLight 488 ve Alexa Fluor 568 sekonder antikorlarını içeren iki çözeltiyi bloke edici çözelti içinde çözünmüş olarak hazırlayın. Daha sonra her slayta, blokaj çözeltisi içinde çözünmüş ikincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinden 10 mikrolitre ekleyin.
Slaytları parafilmle örtün ve iki saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bu ikinci inkübasyondan sonra, PBS 1X'te beş dakika boyunca üç yıkama yapın. Çekirdeklerin lekelenmesine karşı koymak için montajdan önce kapak fişlerinin üzerine DAPI ile 2,5 mikrolitre Antifade çözeltisi ekleyin.
Odakları kinetik olarak değerlendirmek için, prosedür şimdi tarif edilenle aynıdır. Son aşama, odakların gözlemlenmesi ve nicelleştirilmesidir. Gama H2AX ve 53BP1 odakları olmayan insan lenfositleri A, B ve C'de, farklı miktarlarda Gama H2AX ve 53BP1 odaklarına sahip insan lenfositleri gösterilmiştir.
Düşük düzeyde odaklar ko-lokalizasyon gözlenir. Beklendiği gibi, tedavi edilmemiş hücreler arasında hem Gama H2AX hem de 53BP1 odaklarının çok daha yüksek bir frekansı gözlenir. Ayrıca, iki belirtecin odak sayısında büyük bir fark gözlenir.
Gama H2AX ve 53BP1 odaklarının zaman içindeki seyri, aynı işleve katkıda bulunmalarına rağmen farklı bir davranış göstermiştir. Gama H2AX ve 53BP1 odakları analizi, hücresel yanıtı maruz kalma veya patolojik bağlamlarda değerlendirme yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, Gama H2AX ve 53BP1 çift immünofloresan, olayın gerçek sıklığını hafife almaya neden olabilir.
