We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG&#180;s laboratory is supported by the University of Z&#252;rich, by a fellowship of the "Deutsche Forschungsgemeinschaft" and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the "Staatssekretariat f&#252;r Bildung und Forschung" in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).

Not: Bu protokol, doku hazırlanması, lazer yardımlı mikrodiseksiyon ve transkripsiyon profilleme için RNA çıkarma açıklanır. Her zaman protokol tüm adımları boyunca eldiven kullanın. Eğitim ve kullanılan her kimyasal için güvenlik talimatlarını dikkate alın. Xylol zararlıdır ve eldiven nüfuz edebilir ve bu metanol toksik olması, özellikle unutmayın. kullanılan tüm araçlar için, buna göre kullanıcı kılavuzlarına başvurun. Züccaciye ve Diğer Ekipman gelen RNAse Faaliyet 1. Kaldırma <ol><li> Kullanımdan önce önce, RNaz içermeyen kalitesini sağlamak için 180 ° C&#39;de ~ 8 saat boyunca pişirme için alüminyum folyo ile bir cam sarın. </li><li> Herhangi bir metal yüzeyleri tedavi (örn cımbız çifti) yanı sıra çalışma tezgahı ve uygun bir RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile ısıtma plakası. Daha sonra, dekontaminasyon çözüm kaldırmak için RNAse içermeyen su ile yüzeyleri yıkayın. Daha sonra,% 70 EtOH ile daha yüzeyleri temizlemek. </li><li> Tüm plas kullantik sarf malzemeleri (örneğin, borular) yepyeni herhangi ön işleme tabi tutulmadan. Varsa, ücretsiz RNAse için sertifikalı plastik sarf malzemelerini kullanın. </li></ol> 2. Doku Fixation <ol><li> çiftçi sabitleyici 10 ml hazırlama (3: 1; hac / hac etanol: asetik asit), buz üzerinde yeni bir 15 ml tüp içinde. (Kullanmadan önce her zaman taze Çiftçi fiksatif hazırlamak). Bir alternatif olarak, non-çapraz bağlama sabitleyici etanol: asetik asit (5: 1; hac / hac) 18 kullanılabilir. </li><li> ilgi gelişme aşamasında tomurcukları toplamak için cımbız ince bir çifti kullanın. Hemen buz gibi soğuk fiksatif tomurcukları daldırın. ~ Tespiti için Arabidopsis veya Boechera 20 tomurcukları veya çiçek sabitleştirici 10 ml kullanın Not:. Öncesinde tespitin daha küçük parçalar üretmek için bir jilet ile çiçek incelemek için tavsiye edilir büyük çiçekler ile bitki türlerini kullanırken. <ol><li> inflor 3 büyük çiçek tomurcukları - olgun gametofitleri elde etmek için, 2 emasculatehasattan önce 2 gün Escence. </li></ol></li><li> buz ile bir kurutucu alt doldurun. Ya doğrudan onlar üzerinden düşmeyecek şekilde buz içine koyarak veya uygun bir tutucu kullanarak, örnekleri, örneğin, çiçek içeren tüpler açın ve buz koyun. Vakum vakum serbest bırakmak için önce 15 dakika boyunca sızmak. <ol><li> 15 dakika boyunca bir kez vakum süzmesi tekrarlayın. </li></ol></li><li> buz üzerinde vakum ve mağaza gecede (~ 12 saat) bırakın. Bir kapak veya alüminyum folyo ile buz kovası Kapak ve çözülme buz önlemek için bir 4 ° C oda veya buzdolabında kova saklayın. Not: fiksasyon süresi uzatılması tavsiye edilmez. </li></ol> 3. Doku Gömme, İnce Kesit ve LAM için Slaytlar Montaj <ol><li> Doku gömme. <ol><li> Saf etanol ve RNAse içermeyen su ile hazırlanmış,% 70 etanol ile fiksatif değiştirin. daha sonra işlenene kadar buz üzerinde örneklerin bırakın. embe başlatNumunelerin dding gün. Hiçbir doku işleme makineleri mevcuttur durumda, başka bir yerde 9,11 açıklandığı gibi manuel gömme devam ve adım 3.1.11 ile devam edin. </li><li> Yavaşça bir cımbız ile doku gömme kasetler örnekleri aktarın. Sıkıca kasetleri kapatın. KRİTİK ADIM: Bu kademe sırasında numunenin da kısmen kurumasını önlemek. cımbız ile numunelerin sıkmaktan kaçının. Not: ideal kaset eğimli yüzeyinde yazarak, bir kalem kullanılması gereken kasetleri etiketlemek için. </li><li> Tüm malzemeler kasetleri aktarılır ve gömme makinesi yüklenebilir kadar% 70 etanol içinde tomurcuk veya çiçek yüklü gömme kaseti saklayın. Bu amaçla,% 70 etanol ile dolu cam boyama oluk kullanımı. </li><li> Makinenin imbikten doku işlemci sepeti çıkarınız ve üst bakan eğimli yüzeyler ile ve aynı yönde sepete gömme kasetleri aktarın. CRIKortikal ADIM: dokuların herhangi kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde bu gerçekleştirin. aynı anda bir çok gömme kasetleri işleme durumunda, önceden örnekleri yükleme% 70 etanol ile dolu uygun bir RNazsız kaba sepeti yerleştirin. </li><li> sepet kapağı koymak ve imbik geri sepet koyun. imbik kapatın. Not: Doku işlemci otomatik numune kurutur Ksilol için çözücü değiştirir ve erimiş parafin mumu ile sızma yapar. Tipik haliyle, bu gece boyunca yapılır. </li><li> Doku işlemci programı başlatın. Tavsiye edilen standart ayarlar infiltrasyonu, ardından 1 saat% 70 EtOH, üç kez 1 saat% 90 EtOH, üç kez 1 saat% 100 EtOH, iki katı 1 saat% 100 Xylol, bir kez 1 saat, oda sıcaklığında 15 dakika% 100 ksiloldür iki kez 1 saat ve 56 ° C&#39;de 11 de 3 saat bir süre için, parafin mumu ile. Not: Engelleme istasyonu erimiş balmumu ile hazır olmasını sağlamak için, başlamadan önce birkaç saat makineyi açmak veyayaklaşık başlangıç ​​zamanı seçmek için zamanlayıcı işlevini kullanın. Not: durumda doku 56 ° C&#39;de yerine 3 saat arasında 56 ° C&#39;de, hemen ardından olası parafın balmumu uzun inkübasyon süreleri olan işlenemez. Cihazın kullanım kılavuzuna başvurun. &quot;Boş imbik&quot; komutu onaylanana kadar Tipik olarak, dokularla kasetleri otomatik olarak erimiş mum içinde kalır. Doku işlemci başlatırken balmumu erimiş değilse, imbik% 70 etanol ile doldurulur ve başlamak için hazır olana kadar programın beklemede kalır. </li><li> imbikten boşaltın ve hemen bir engelleme istasyonunda 56 ° C&#39;de parafin banyosu örnekleri aktarın. sepet kapağını kaldırın ve kapağı ile engelleme istasyonunun parafin banyosu kapsamaktadır. </li><li> sepete kasetleri olduğu gibi bloke istasyonu yüzeyinde Kazık kadar taze dengeleme bölümleri 56 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı. Not: Bir etanol dayanıklı kalıcı marker kullanmak olabilird dengeleme tepsileri alt etiketlemek için. Aseton dayanıklı kalıcı belirteçler tavsiye edilmez. </li><li> bloke istasyonu kullanılarak, 56 ° C&#39;de eritilmiş parafin mumu ile önceden ısıtılmış taze plastik dengeleme tepsi doldurun. , Parafin banyosu kapağını kaldırın bir seferde sadece tek bir kaseti pick up ve bir cımbız kullanarak dengeleme tepside 56 ° C&#39;de sıvı parafin balmumu kasetlerden örnekleri aktarın. KRİTİK ADIM: hızlı çalışarak kaseti işlerken örnek çevreleyen balmumu herhangi sertleşmesini kaçının. <ol><li> balmumu sertleşmeden önce bir hazırlık iğne kullanılarak ihtiyaçlarına göre tüm örnekleri yerleştirin. Tipik olarak, çok sayıda çiçek her bir yönde yaklaşık 1 cm aralıklı dengeleme tepsi şeklinde düzenlenmiştir. </li><li> Tüm örnekler aktarılır kadar adımı tekrarlayın 3.1.9. </li></ol></li><li> geri doku işlemciye sepet koyun ve uygun bir program (kullanım kılavuzuna bakın) kullanarak imbik temizleyin. </li><li> Doku işlemci ve engelleme istasyonu kapatın. Adım 3.1.13 ile devam edin. </li><li> durumda, herhangi bir doku infiltrasyonu makinesi ve hiçbir gömme istasyonu mevcuttur, 56 ° C&#39;de parafin eritmek için bir ısıtma fırını kullanımı. bankta, plastik dengeleme tepsiler içinde erimiş balmumu doldurmak balmumu örnekleri aktarmak, ve örnekleri konumlandırmak için hazırlık iğne kullanın. </li><li> 4 ° C&#39;de depolamadan önce numune 3 saat - parafin ~ 1, oda sıcaklığında sertleşmeye izin verin. Numuneler, daha sonra taze işlenmiş ya da birkaç aya kadar saklanabilir. </li></ol></li><li> LAM için ince kesit ve slaytlar hazırlanması. <ol><li> aşağıdan mum blok aydınlatan bir ışık Masanın üzerinde, çevredeki plastik tepsiler alınan numuneler ile parafin mumu kaldırın. , Doku içeren bir kare mum blok parçalara ayır örn., Bir RNAse ücretsiz jilet kullanarak bir tomurcuk veya çiçek. Bu amaçla, her zaman mum blok üst kısmına doğru örnekleri yönlendirmek (ayrıca bkz <strong&gt; Şekil 1). <ol><li> Aynı anda LAM için kullanılması gereken tüm örneklerin mum blok hazırlayın. </li></ol></li><li> sertleştirilmiş parafin ile dolu kasetleri gömme işlemek için bloklar takın: Bir Etanol lamba kullanılarak uygun bir spatula ucunda küçük bir parça veya parafin mumu damlacık eritmek ve gömülü dokuları ile (destek bloğu düzeltmek için sıcak balmumu kullanın üstte). <ol><li> bal mumu, 4 ° C&#39;de en az 20 dakika boyunca sertleşmeye izin verin. </li></ol></li><li> Işık masaya bir jilet ile örnek çevreleyen artı balmumu çıkarın. Paralel kenarları (Şekil 1) ile bir kare yüzey tutmak için emin olun. </li><li> 42 ° C&#39;ye kadar ısıtma plakası ayarlayın. </li><li> Güvenle microtome örnekleri montaj ve 6 hazırlamak - 10 mikron kalınlığında kesitler. mikrotom kullanılarak için üreticinin talimatlarına bakınız. Not: ince kesitler genellikle daha iyi yapısal çözünürlük, highe RNA büyük miktarda verecektir ikenR kalitesi daha kalın bölümleri ile elde edilebilir. Boechera hücreleri gametofitleri olgun için biz varsayılan olarak 7 mikron kullanın. mikrotom bıçak üzerinde örnekleri ile oldukça yavaş hareket eden genellikle daha iyi histoloji ile sonuçlanır. </li><li> LAM slaytlar onları yerleştirmeden önce alt kısmında siyah karton plastik bir kutu içine 15 cm - Her zaman yaklaşık 10 bir uzunlukta parafin kurdeleler aktarın. </li><li> Eğer mümkünse, bir diseksiyon-kapsamında, örneğin faiz hücreye veya doku tipleri, ovüllerin içeren parafin şeritler parçaları önceden seçmek ve gerisini atın. </li></ol></li><li> LAM için slaytlar hazırlanması. <ol><li> ısıtma plakası üzerinde üstüne düz bir yüzeye sahip - metal çerçeveli slaytlar gerekli miktarda (10 genellikle 5) yerleştirin. </li><li> Pipet ~ 1 - sürgünün plastik parça üzerine RNazsız su 2 mi. plastik pencereler span yeterince uzun 5 cm - Bir jilet kullanarak, yaklaşık 4 kısa parçalara parafin kurdeleler kesti. UBir cımbız ve ideal parafin şeritler slaytlar plastik pencereler birbirine paralel yerleştirmek için bir hazırlık iğne se. Dikkatle suyu çıkarmak ve geri slaytlar yerleştirmek için bir ucunda slayt kaldırın. <ol><li> Seçenek olarak ise, kimyasal bir başlık altında ısıtma plakası yerleştirin. yüzeyinin nemlendirilmesi için yetecek sürgünün plastik kısmına küçük bir metanol hacmi halinde (bu slaytlar hafif dalgalı neden olur). slaytlarda parafin şeritler yerleştirin. Not: mümkünse toksisite nedeniyle, metanol kullanımını önlemek. Ancak, bu aşamada metanol kullanımı su monte edilmesi ile elde edilen kalite yetersiz olması durumunda, RNA kalitesini artırmak yapar. elde edilen RNA kalitesi soruşturma altında hücre tipi ve türler ile değişir gibi, yeni bir proje başlangıcında bu alternatifleri test faydalıdır. </li></ol></li><li> ~ 12 saat boyunca 42 ° C&#39;de bir gece boyunca ısıtma plakası üzerinde slaytlar kurutun. ısıtma plakası Kapakslaytlar dokunmaz bir plastik kapak. plastik kapak hava değişimini önlemek olmadığından emin olun. Bu kapak amacı pipet kutuları veya benzeri üzerine yerleştirilebilir için kaldırılması gerekir. <ol><li> Seçenek olarak ise, iki saat en az ya da doku tamamen kuru görünene kadar kuruma süresini azaltır. koleksiyona dilimleme zaman azaltılması RNA kalitesini artırabilir. </li></ol></li><li> Bir kimyasal Kaputun altında, de-mum slaytlar uygun slayt tutucuları kullanarak ksilolde 10 dakika süreyle 2 kez. Tamamen kuru tutulur metal çerçeve geniş ucunu dokunarak slayt çıkarılmasını sağlamak için sadece değil, her slaytın plastik parçayı batığın emin olun. </li><li> slaytlar LAM öncesinde kimyasal başlık altında ~ 10 dakika kurumasını bekleyin. Not: hemen işleme değil Slaytlar doku bir kaç saat kadar için yukarı bakacak şekilde 42 ° C&#39;de geri ısıtma plakası üzerine yerleştirilebilir. Bu daha fazla işlem kadar RNA kalitesinden ödün gelen herhangi bir nem önleyecektir. </li></ol></li></ol> 4. Lazer yardımlı mikrodiseksiyon (LAM) Not: LAM için prosedür kullanılan alet ile değişecektir. Bu protokolün bazı detayları belirli bir alet ve elektrostatik kuvvetlerin bir kapak yapma kullanımı örnek toplamak teknolojiye uyarlanmıştır. Buna ek olarak, ayrıntıları bile yazılımın farklı sürümleri arasında değişebilir. ayrıntılı bir açıklama ve enstrüman ve yazılım özel talimatlar için üreticinin talimatlarına ve kullanıcı el kitapları başvurun. <ol><li> LAM (bilgisayar, mikroskop, lazer kontrol kutusu) için cihazlar üzerinde geçin. </li><li> mikroskop ve lazer direksiyon programını başlatın. </li><li> kontrol kutusu üzerindeki ilgili düğmeye basarak lazer açın. </li><li> kapak tutucu içine (diffusor 0,5 ml) bir kap yerleştirin ve enstrüman konumlandırmak. </li><li> mikroskopi için bir cam slayt ile LAM slayt destekleyin. Emin olun sürgünün düz bir yüzeyeEkli doku cam slayt karşı karşıyadır. </li><li> altında cam slayt ile enstrüman slayt yerleştirin. </li><li> 4X Amaç seçin. Programda, &quot;yukarı&quot; pozisyona kapağı taşımak ve slayt tarama yapmaya devam seçin. </li><li> slayt yoluyla arama ve ilgi yapılarını belirlemek. Bulabilir ve kesme adımı için tam konumuna geri hareket edebilmek için slayt üzerinde konumlarını kaydedin. </li><li> Uygun hedefi (örneğin 40X veya 60X) seçin. </li><li> Gerekirse, lazer hızı, odak ve lazer gücünü ayarlamak ve aynı zamanda aracın kullanım kılavuzuna bakarak sahne hareketi kalibre edin. Bir hesap özel ilgi doku için ayarlandıktan sonra, ayarlar yeniden kullanılabilir. </li><li> ideal doku olmadan zarının bir parçası, programın &quot;lazer atış&quot; düğmesine basarak tek bir atış ile lazer konumunu doğrulayın. <ol><li> Gerekirse, inci izleyerek lazer pozisyonunu kalibreenstrüman e üreticinin talimatları. </li></ol></li><li> basılı sağ fare düğmesini tutarak, monitörde yazılım penceresinin dört bir yanına bariz bir yapıya taşıyarak hedefi kalibrasyonunu doğrulayın. bariz yapısına göre elin pozisyonu dört köşesinden aynı olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde, yazılım kılavuzuna aşağıdaki amaçları kalibre. </li><li> &#39;Aşağı&#39; konumunda kap, hücre tipi veya ilgi dokusu, örneğin, yumurta hücresinin sınırlarını işaretlemek için &#39;el kalem&#39; aracını kullanın. &#39;Kes&#39; tuşuna basarak lazer ile ilgi hücre parçalara ayır. Not: Genellikle, ihtiyaçlarını kesit tekrarlanması hücre etrafında sınır tamamen seferde disseke olmasaydı. Bu durumda, otomatik olarak bir standart olarak bölümün iki tekrarlar yapmak için yazılım ayarlanması önerilir. </li><li> Kapağı kaldırın ve ilgi yapısı ile bir sonraki kaydedilmiş konuma geçmek. Adımı tekrarlayın 4.13Bir slayttan ilgi tüm hücreleri toplanır kadar prosedürün bir sonraki hücre bölümleri incelemek için. Emin kapak yeni bölüm kap boş pozisyona yapışıyor bir şekilde konumlanmasına dikkat edin. Not: dokuların büyük parçaları izole edilmesi tavsiye edilir (örneğin, bütün çiçekler ya da parçalarının bölümleri) taze kap tek hücre bölümlerinin izolasyonu sonra her slayt. Bu RNA kalite kontrolü için de kullanılabilir. </li><li> slayt çıkarın ve adımları 4.4 tekrarlayarak sonraki slayta devam - 4.14 ile 4.9 ve 4.13. </li><li> tüm slaytlar ilgi hücre tipleri kadar adımı yineleyin 4.15 ve ilgili adımlar izole edilmiştir. Not: ~ 4 daha uzun süre hasat için tavsiye edilmez - Aynı kap 5 saat. </li><li> Görme numunenin spesifik olmayan kirlilikleri dışlamak için LAM sonra kapağı yüzeyini kontrol edin. olmayan disseke dokular folyo ile korunmaktadır iken, toz nedeniyle elektrostatik yapışma yüzeyine sopa olabilir. <ol><li> To görsel, kapağı kontrol cihazdan slayt kaldırmak. &#39;Aşağı&#39; pozisyonunda kapak tutucu yerleştirin ve 4X amacı ile yüzeyi kontrol edin. </li><li> toz küçük parçalar görebilir durumda, küçük bir (2 | il) pipet ile kaldırın. Alternatif olarak, geri enstrüman üzerinde slayt monte slayt (hiçbir dokuların) ücretsiz bir parçası kapağını yerleştirin ve tamamen lazer kullanarak kontaminasyonu yok. </li></ol></li><li> Yakın kapaklar ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C&#39;de kuru bölümler dondurma. Gerekirse, numuneler bir kaç haftaya kadar saklanabilir. Ancak, bu aşamada hızlı bir şekilde işlem yapılarak, tavsiye edilir. </li></ol> 5. RNA İzolasyonu ve Kalite Kontrol Not: RNA&#39;nın küçük miktarlarda uygun herhangi bir yöntem ile izole edilebilir. Bu protokolde RNA küçük miktarlarda tanımlanan bir RNA izolasyon kiti kullanımı tarif edilmektedir. üreticinin talimatlarına uyun. <ol><li> bağlı numune ile tüpleri kullanınkap, ya doğrudan ya da -80 ° C ila çıkarıldıktan sonra. <ol><li> tüplerin açık ve dikkatli bir şekilde filtre ipuçlarını kullanarak her bir tüp çeperine ekstraksiyon tamponu 11 ul pipetleyin. örnekler arasındaki ipuçları değiştirin. </li><li> Kapağı kapatın ve tüpün kapağı aşağı ekstraksiyon tamponu sallayın. </li><li> 42 ° C&#39;ye ısıtılmış bir ısıtma fırın içinde aşağı kap tüpleri yerleştirin. imalatçının talimatlarına uygun olarak 30 dakika boyunca inkübe edin. </li></ol></li><li> Kolon hazırlanması için üreticinin yönergelerini izleyin ve tüplerin alt kısmında özü toplamak. <ol><li> tek tek her tüp / cap için 5.1.2 - Birden fazla kap malzeme bir örnek birleştirilebilir gerekiyorsa, adım 5.1.1 ile devam edin. </li><li> (Üreticinin talimatlarına bakınız) sonra, tek bir tüp içinde, bir örnek için özleri havuzu ve EtOH eşdeğer miktarda ilave edilmeden önce, bir pipet ile toplanmış özü miktarını ölçün. </li><li> Emin olun Et miktarıOH Yükleme işleminden sonra kolon toplanmış özü hacmine eşit önce ilave edildi. </li><li> EtOH ile RNA yağış sonrasında, üreticinin talimatlarına aşağıdaki sütunlardan yükleme hızla devam edin. 100 xg santrifüj adımla protokol devam edin. </li><li> Her bir toplama tüpünün içeriği kolonundan geçirildi sonra, akış oranı, aşağıdaki üreticinin talimatlarına kaldırmak için 30 saniye için 16,000 x g santrifüj adımı gerçekleştirmek. </li><li> üreticinin talimatlarına uygun RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması ile devam ediniz. </li><li> sütun elüsyon tamponu Yükleme işleminden sonra kolon, 1 dakika boyunca inkübasyona izin verin. üreticinin talimatlarına talimatları izleyerek santrifüj tüpleri yüklenmeye devam. Not: elüsyondan önce, 100 xg&#39;de 1 dakika boyunca Ek bir santrifüj işleminin elüsyon verimliliğini artırabilir protokolde belirtilen. </li></ol></li><li> Çürük RNA Özüadımlar bu protokolün 5.2.7 5.1 aşağıdaki RNA kalite kontrolü için Rols (büyük doku bölümleri). </li><li> RNA kalite kontrolü yükü için 1 ul üreticinin talimatlarına aşağıdaki bir RNA Pico Chip kullanarak Bioanalyzer her bir kontrol numunesinin seyreltilmemiş toplam RNA. Not: ekstre RNA doğrusal amplifikasyon ve mikrodiziler veya RNA-DİZ 7,11,13,14 kullanılarak transcriptome analizi için kullanılabilir. İdeal olarak, kalite kontrol tedarikçi bir dizi amplifikasyonu için uygun kitler sağlar en az 7 arasında bir RNA Bütünlük sayısı (RIN), uygun örnekler 9&#39;da verilmiştir göstermelidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).</li><li>Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+female+gametophyte.">The female gametophyte.</a> Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).</li><li>Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomixis:+Molecular+strategies+for+the+generation+of+genetically+identical+seeds+without+fertilization.">Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization.</a> Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).</li><li>Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomixis+-+the+asexual+revolution.">Apomixis - the asexual revolution.</a> Science. 274, 1322-1323 (1996).</li><li>Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+future+for+apomixis.">A bright future for apomixis.</a> Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).</li><li>Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+germline+formation:+molecular+insights+define+common+concepts+and+illustrate+developmental+flexibility+in+apomictic+and+sexual+reproduction.">Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction.</a> Development. 142, 229-241 (2015).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomictic+and+sexual+germline+development+differ+with+respect+to+cell+cycle,+transcriptional,+hormonal+and+epigenetic+regulation.">Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation.</a> PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarging+cells+initiating+apomixis+in+Hieractium+praealtum+transition+to+an+embryo+sac+program+prior+to+entering+mitosis.">Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis.</a> Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).</li><li>Wuest, S. E., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+applied+to+floral+tissues.">Laser-assisted microdissection applied to floral tissues.</a> Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).</li><li>Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+expression+profiling+of+rare+cell+types+as+exemplified+by+its+impact+on+our+understanding+of+female+gametophyte+development.">Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).</li><li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes.">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20, 1-7 (2010).</li><li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+plant+cells+from+tape-transferred+paraffin+sections+promotes+recovery+of+structurally+intact+RNA+for+global+gene+profiling.">Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling.</a> Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).</li><li>Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development.">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).</li><li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes:+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing.">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685 (2012).</li><li>Mau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+apomicts+trapped+in+the+ecological+niches+of+their+sexual+ancestors.">Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors.</a> Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).</li><li>Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+transcriptionally+active+regions+of+sexual+and+apomictic+Boechera.+demonstrates+independently+derived+apomictic+lineages.">Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages.</a> Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).</li><li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species.">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li><li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments.">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li><li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Protokol Farklı Hücre ve Doku tipleri için uygundur Transcriptome ile kombine LAM mikroarrayler veya analizleri RNA-Seq gelişimsel ya da fizyolojik süreçleri 7-11,13,14 düzenleyen gen aktivitesinin spesifik kalıpları içine anlayışlar kazanmak için değerli bir araçtır. Ancak, herhangi bir belirli hücre tipi için bu yöntemin uygunluğu, yapısal konular kritik olarak bağlıdır. Hücre açıkça görülebilir ve LAM için kullanılan kuru bölüm...

Doku seviyesinde yapılan transkripsiyon çalışmalarda, son derece özel ama nadir hücre tiplerinin transcriptomes genellikle daha bol çevreleyen hücreler tarafından maskelenir. Bu son derece özel hücre tipleri için bir örnek, bitkilerde dişi üreme soy (tohum çizgisi) hücreleri bulunmaktadır. Kadın germ çiçek 1,2 dişi organ içinde, gelişmekte olan Yumurtacığa içinde tohum öncülerini belirtildi. megaspor anne hücre (MMC) kadın germline ilk hücresidir. Bu düşük megasporların bir tetrad oluşturulması için mayoz maruz kalır. Bir Sinsityum içinde, yani Tipik olarak, bu megasporların sadece biri hayatta ve sitokinez olmadan mitotik böler. Üç zıtlar iki synergid hücreleri, yumurta ve merkezi hücre: Bu mitoz tipik olarak dört hücre tipleri oluşur olgun gametofit oluşturmak üzere Hücreselleştirmeden tarafından takip edilmektedir. Yumurta ve merkezi hücreler dou sırasında iki sperm hücreleri tarafından döllenir olsun dişi gametlerin vardırble gübreleme gelişmekte tohum 1,2 embriyo ve endosperm yol vermek. 80 tohumlar yakından ilgili cinsi Boechera içinde çiçek başına geliştirmek - yaklaşık 50 iken cinsel model sistem Arabidopsis thaliana olarak, sadece ~ 50 tohum çiçek başına gelişir. Bu nedenle, kadın germ böyle hücre özellikleri ve farklılaşma gibi gelişim süreçlerini incelemek için mükemmel bir model yapma, sadece birkaç derece uzmanlaşmış hücre tipleri oluşur. Ayrıca, bitki üreme yöneten gen düzenleyici süreçlerine anlayışlar uygulamalı bir değer olabilir. Bitkilerde, tohumlar (Apomiksisin) aracılığıyla hem cinsel ve eşeysiz üreme oluşabilir. eşeyli üreme popülasyondaki genetik çeşitliliği oluşturur iken, anne bitki genetik olarak özdeş olan klonal yavrular oluşmasına yol açar apomiksis. Bu nedenle, apomiksis bile karmaşık anne genotipler can, tarım ve tohum üretimi uygulamaları için büyük bir potansiyele sahiptirbirkaç kuşak 3,4,5 üzerinde değişmeden muhafaza edilmesi. Apomiksis doğal olarak herhangi bir önemli bitki türlerinde oluşmaz, çünkü ürünlerde Apomiksisin mühendislik büyük ilgi 3,4,5 taşımaktadır. Ancak, bu uzun vadeli bir hedef Apomiksisin altta yatan genetik ve moleküler temeli yeterli detayda 6 anlaşılır değildir, çünkü elde etmek zordur. Lazer yardımlı mikrodiseksiyon (LAM) ve yeni nesil dizileme (NGS) kullanarak apomiktik üreme, hücre tipine spesifik transkripsiyonel profilleme düzenleyen transkripsiyon bazda içgörüler kazanmak için çok güçlü bir yaklaşım 7,8 temsil etmektedir. LAM ilk hayvan ve biyomedikal araştırmalar için kurulmuştur. Son birkaç yıl içinde LAM bitki biyolojisi 6,9,10 uygulanmıştır. Tek tek hücre ve doku tiplerinin profil sağlayan diğer yöntemlerin aksine, LAM markör hatları 6,9,10 üretilmesini gerektirmez. Bu nedenle, uygulama olabilirönceden moleküler bilgisi olmadan herhangi bir hücre veya doku tipine yalan. LAM diğer bir avantajı, hücre konumu ve / veya yapısal özelliklerine göre, kuru bölümlerde kabul edilebilir gibi sürece, herhangi bir hücre tipinde uygulanabilir olmasıdır. LAM işlem esnasında transkripsiyonel profili değişiklikleri önler sabit dokular kullanılan ek bir avantaja sahiptir. Çevrede, örneğin, çiçek dokusu dokusu, önceden parafın balmumu içine yerleştirilmeden olmayan bir çapraz bağlama sabitleyici sabitlenmiştir. Parafin gömme kurulan protokolleri 9,11 aşağıdaki elle yapılabilir. Ancak, balmumu ile dehidratasyon ve infiltrasyon için otomatik doku işlemci kullanımı genellikle RNA kalitesi ve doku morfolojisi korunması açısından yüksek tekrarlanabilirlik ile sonuçlanır. Reçine dokuların gömme alternatif strateji de başarılı bir LAM 8 hücre tip spesifik analizler için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bir autom kullanımıBirçok örnekleri kez zamanında eller en az gerektiren işlenebilir olarak mum gömmek için ated doku işlemci, çok zaman etkilidir. RNA kalitesi, tipik olarak önemli bir kayıp tespit ve gömme sırasında ortaya birlikte, mikrotom ile kesitlerin hazırlanması ve özellikle LAM kullanılan frameslides montaj RNA kalitesinin korunması için kritik bir aşama olarak kalır. Bu, daha önce not edilmiştir ve bir bant transfer sisteminin kullanımı, bu aşamada 12, daha iyi bir RNA kalitesi elde etmek tarif edilmiştir. Bununla birlikte, bu preparatların hazırlanması sırasında ilave bir zaman alan bir adım ekler ve özel ekipman gerektirmektedir. Aşağıda açıklanan optimize edilmiş protokol tekrarlanabilir GeneCHIPs ve Yeni Nesil Dizi (NGS) 7,11,13,14 yaklaşımları ile transkripsiyonel profilleme için yeterli kalitede RNA üretir. Buna ek olarak, kullanılan lazer mikrodiseksiyon mikroskobu ile izole edilmiş, hücre tipleri, yüksek saflıkta yatağından olaninely 7,11,13,14 üretti. Cins Boechera apomiktik üreme kilit adımları incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Boechera, farklı cinsel ve apomiktik katılımların çeşitli tanımlanmıştır ve Karşılaştırmalı için kullanılabilir 15,16,17 analiz eder. Cinsel Arabidopsis ve apomiktik Boechera Kadın germline hücrelerin hücre tipine spesifik transcriptomes bir karşılaştırma olarak, bu şekilde 7 apomiksis yöneten düzenleyici süreçlerin yeni yönlerini tanımlayan farklı şekilde ifade edilen genleri ve yolların tespit edilmiştir. Buna ek olarak, bu çalışma hücre tipine spesifik transkripsiyonel Lam uygunluğunu küçük ve nadir hücre tiplerinin analizi sunmaktadır. Daha önce bitki türlerinin çeşitli farklı hücre tiplerinin analizi için bu protokol kullanılır, ancak türlerin ve protokole dokuya özel modifikasyonları, bazı durumlarda gerekli olabilir var.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1,009,861,000</td>
			<td>absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3686,2500</td>
			<td>100% Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease free water</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASP200 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048043624</td>
			<td>tissue processor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black cardboard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be purchased in special paper shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA- and RNAse-free Frame Slides</td>
			<td>Micro Dissect GmbH</td>
			<td></td>
			<td>1,4 &#181;m PET-membrane; can also be purchased from Leica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumond Forceps</td>
			<td>Actimed</td>
			<td>0208-5SPSF-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exsiccator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z354074-1EA</td>
			<td>Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60010</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1000&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60010</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60020</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60200</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps precision</td>
			<td>VWE</td>
			<td>232-1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide holder</td>
			<td>Huber &#38; Co.AG</td>
			<td>10.0540.01</td>
			<td>F&#228;rbek&#228;sten nach Hellendahl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass staining trough</td>
			<td>Huber &#38; Co.AG</td>
			<td>10.0570.01</td>
			<td>F&#228;rbekasten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module Leica</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EG 1150 H</td>
			<td>blocking station, similar devises are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Drying Table</td>
			<td>Medax</td>
			<td>15501</td>
			<td>other models and/or suppliers are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket</td>
			<td>VWR ice bucket with lid&#160;</td>
			<td>10146-184</td>
			<td>similar buckets equally suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light table</td>
			<td>UVP An Analytical Jena Company</td>
			<td>TW-26&#160;</td>
			<td>white light transluminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10143562CE</td>
			<td>cut edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtome blade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FEAHS35</td>
			<td>S35 microtome blade disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI Cell Cut Plus Instrument</td>
			<td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM12475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast X-TRA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X882.2</td>
			<td>for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic balancing trays</td>
			<td>Semadeni AG</td>
			<td>2513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic box</td>
			<td>Semadeni AG</td>
			<td>2971</td>
			<td>Plastikdose PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic lid for heating plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preparation needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-7159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free microfuge tubes</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse ZAP Decontamination Solution</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automated Rotary Microtome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2245</td>
			<td>similar devises are equally suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Loc&#160; Histo Screen Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C-1000_AQ</td>
			<td>similar cassettes of other suppliers are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 &#181;l&#160;</td>
			<td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td>
			<td>50204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylol (Isomere) ROTIPURAN</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4436.2</td>
			<td>min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>process embedding cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14039440000</td>
			<td>Leica Jet Cassette I without lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF55</td>
			<td>other models and/or suppliers are suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted microdissection (lam) as a tool for transcriptional profiling of individual cell types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Numune Hazırlama ve LAM Ardıl Adımlar yapılır Birbirini takip eden bir dizi adım LAM (Şekil 1) tarafından seçilen hücre tiplerinden transkripsiyonel analiz için RNA&#39;nın hazırlanması gerekmektedir. Bu RNA nüfus hasattan sonra değişmeden kalmasını sağlamak için çiçek ve acil tespitin hasat başlar. Doku, sarılır, bölümlere ayrılır ve slaytlar üzerine monte edili...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types at JoVE.com

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

laser-assisted-microdissection-lam-as-tool-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Biology

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

9.2K Görüntüleme.  University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center. Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera. 

Video: Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Memeli Doku Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Biyoloji

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Mikroarray&#39;ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Takip inişi, Apoptosisi tersine Cep Survival Fenomeni için Stratejiler

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...