Work in the authors' laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, "Ideas" Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.

Etik Beyanı: Fare hayvancılık ve taşıma Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler), Birleşik Krallık ve Değişiklik Yönetmeliği 2012 Yasası 1986 ile uyumlu, UK Home Office düzenlemeleri ve UCL etik komite kurallarına uygundur. NOT: Tüm çözümler dietil pyrocarbonate (DEPC) ile yapılmalıdır - herhangi bir kalıntı RNAaz ari yok etmek için arıtılmış su. tüm DEPC globülleri sonra kayboldu DEPC aşağılamak için otoklav kadar DEPC tedavi için, DEPC (litre başına 1 ml) ekleyin, şiddetle çalkalanır. 1. RNA Probe Sentezi <ol><li> DİKKAT: formamid tutarken, Kişisel Koruyucu Ekipman (KKE) aşınma ve güvenlik kabini kullanın. Hibridizasyon tamponu hazırlayın: DEPC ile muamele edilmiş% 50 (h / h) deiyonize formamid, mM Tris-HCI, pH 7.5, 200 mM NaCI, 5 mM EDTA, 10 ile, iyonu giderilmiş suyun 5 mM NaH 2 PO 4, 5 mM Na-2 HPO 4, 0.01 mg / ml maya tRNA, 1 x Denhardt solutiilgili ve% 10 / h dekstran sülfat ağ. </li><li> RNA polimeraz promotörüne sahip bir plazmid olarak, ilgi konusu genin cDNA dizisini ihtiva eden bir DNA klonu seçin. Bu örnek için, Aspa için T7 ve SP6 RNA polimeraz promoterleri (Ek Şekil 1) sahip bir pCMV-SPORT6 klon, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934) kullanın. </li><li> şablon olarak doğrusallaştırılmış plazma DNA hazırlanır. <ol><li> DNA klonunun büyütün T7 ve SP6 evrensel primerler ile üreticinin protokolüne ve sırasına göre, küçük-ölçekli bir plazmid arındırma kiti ile plazmid ekstrakte edin. </li><li> cDNA&#39;nın yönlü sarmal kolunun 5 &#39;ucunda kesen bir sınırlama enzimi ile 1.020 | ig plazmid DNA Digest. Bu örnek için, pCMV-SPORT6- Aspa plazmid sindirimi 100 birim SalI kullanın. 37 o C&#39;de 1.5 saat süreyle inkübe edin </li><li> plazmid tamamen doğrusallaştırılmış olup olmadığını kontrol etmek bir agaroz jel üzerinde küçük bir kısım çalıştırın. </li></ol></li><li> arındırmakfenol-kloroform kullanılarak doğrusallaştırılmış plazmit kullanmak avantajlıdır. <ol><li> 3 M sodyum asetatın 1/10 hacmi, 10 mM Tris HCI (pH 8.0), bir hacim ekleyin - dengelenmiş fenol ve kloroform / izoamil alkol (IAA), bir hacim (24: 1). </li><li> (- 25 ° C, RT 20) ve özü, üst sulu faz, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 1 dakika için 16,000 x g&#39;de kloroform / IAA, santrifüj, bir hacim ekleyin ve üst akıcı faz ekstrakte edin. </li><li> Adımı tekrarlayın 1.4.3. </li><li> Etanol 2 hacimleri ekleyin ve 1 saat ya da O / N -20 o C&#39;de bırakın. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin. süpernatant atın. </li><li> % 70 soğuk etanol ile pelet yıkanır ve TE içinde 2.5 ul başına approximatively 1 ug cDNA (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 7.5) yeniden askıya. </li></ol></li><li> İki prob, digoxigenin (DIG) ile etiketlenmiş bir ve flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile diğer sentez. <ol><li> Anti-se yapmak için uygun RNA polimeraz seçin(Hedefe mRNA tamamlayıcı) nse sonda. Bu örnek için, Aspa probu yapmak için T7 RNA polimerazını kullanır. </li><li> In vitro transkripsiyon reaksiyonu hazırlayınız: 1 linearize DNA ug, 4.0 ul 5 x transkripsiyon tamponu, 100 mM DTT, 6.0 ul 10x DIG ya da FITC RNA işaretleme karışımı içeren dNTP 2.0 ul, 1 ul RNaz inhibitörü ve 20 - Tr 40 RNA polimerazının birim; DEPC arıtılmış su ile 20 ul son hacmi oluşturuyor. </li><li> 1.5 saat 37 o C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> % 1.0 agaroz jeli üzerinde transkripsiyon reaksiyonunun IKAZ1 ul reaksiyon çalıştığı kontrol etmek için. Jel doğrusal şablonu ve prob parlak bir bant göstermesi gerekir. </li><li> melezleme tamponu ile 100 ul birimi oluşturacak ve -80 ° C&#39;de 10 ul alikotları saklayın. </li></ol> 2. perfüzyon, Fiksasyon ve Doku Koleksiyonu <ol><li> DİKKAT: (PFA) paraformaldehid taşırken hem katı hem deSulu, PPE giymek ve bir güvenlik kabini kullanın. ısı (55 ° C) PFA 1x olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi (ağ / hac)% 4 çözülmesiyle formaldehid çözeltisi hazırlayın. filtre kağıdı ile formaldehit çözüm Filtre. </li><li> damıtılmış su içinde sükroz (ağ / hac)% 20 eritilerek sukroz çözeltisi hazırlayın ve% 0.1 (h / h) DEPC çözeltisi ilave edilir. gevşek kapaklı ve otoklav ile oda sıcaklığında O / N bırakın. </li><li> Son aşamada pentobarbitonun intra-peritoneal enjeksiyonu (50 mg / kg) ile fare uyuşturan. ayak tutam anestezi derinliği değerlendirmek ve geri çekme refleksi yokluğu derin anestezi gösterir. </li><li> Fare derin anestezi altına alındıktan sonra, göğüs kafesine altında bir kesi yapmak ve her iki tarafta göğüs kafesinin kesti, kalp maruz kaldırın. </li><li> kalbin sol ventrikül içine 25 G iğne takın. kalbin sağ atrium küçük bir kesi yapmak. </li><li> 20 mi, PBS ile hayvan ve daha sonra 40 mi formaldehid çözeltisi serpmek. P30 ve üzerifareler, 12 ml / dk&#39;lık bir perfüzyon oranı kullanıldığında daha genç hayvanlar daha düşük bir oranı kullanım için (7-10 ml / dakika). </li><li> beyin teşrih. <ol><li> Kulağımıza gelen bir kesim posterior yaparak cerrahi makas ile fare kafasını Sever. deride bir kaudal orta hat kesi yapmak ve kafatası cilt kaldırmak için rostrally çalışır. </li><li> kaudal kısmından başlayarak, orta hat boyunca kafatasının üst kısmından ve İris makasla gözler arasındaki kesti. Bir kemik plaka bir tarafını her zaman devrilir ve cımbız ile kapalı yakalamaya tarafından parietal ve frontal kemik plakaları çıkarın. </li><li> Yavaşça cımbız ile ön kısmından yukarı doğru beyin tilt ve optik sinirleri ve diğer kranial sinirler kesilir. Yavaşça kafatası dışına beyin kaldırın. </li></ol></li><li> Bir fare koronal beyin matriks içine beyin yerleştirin. Bir tüy jilet ile 3 yaklaşık 4 mm parçalar halinde beyin dilimleyin. </li><li> % 4 PFA çözeltisi içine dilim aktarın ve 4 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> aktarım beyindilim-DEPC işlenmiş% 20 sukroz çözeltisi ve 4 ° C &#39;de, O / N kuluçkalanması </li><li> kuru cryomould içine her beyin dilim koyun, optimum kesme sıcaklığı (OCT) orta ile çevreleyen ve kuru buz üzerinde dondurma. -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 3. Cryosectioning <ol><li> Bir kriyostat içinde donmuş doku 15 mikron bölümleri kesmek ve mikroskop lamı üzerine bölümleri toplamak. Eğer gerekirse, DEPC ile muamele edilmiş, PBS ile bölümleri ıslak ve ince bir fırça ile düzleştirin. </li><li> Doku slayt uygun olduğundan emin olmak için yaklaşık 1 saat boyunca kurumaya slaytlar bırakın. </li></ol> 4. Melezleme <ol><li> 65 ° C yıkama tamponu hazırlayın: 150 mM NaCI, 15 mM Na-3 Cı 3H 5 O (COO) 3 (= 1x tuzlu su, sodyum sitrat), 50% (h / h) formamid ile% 0.1 (h / h) Tween 20. </li><li> 100 mM maleik asit, 150 mM NaCI,% 0.1 (h / h) Tween-20, pH 7,5: MABT tamponu hazırlayın. </li><li> DIG etiketli ve FITC-işaretlenmiş (iki prob seyreltind) hibridizasyon tampon maddesi içinde 1 / 1.000 65 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış ve iyice karıştırın. </li><li> Her bir slayt, coverslipwith fırında pişmiş (200 ° C) lamelleri üzerine hibritleme karışımının yaklaşık 300 ul uygulayın ve nemli bir oda içinde 65 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin. </li><li> önceden ısıtılmış yıkama tampon içeren bir Coplin kavanoza slaytlar aktarın. Yıkama tamponu ile 65 ° C &#39;de iki kez 30 dakika için slaytlar yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında, 10 dakika süreyle MABT ile üç kez slaytlar yıkayın. </li></ol> FITC Probe 5. Görselleştirme <ol><li> ISH engelleme tamponu hazırlayın: MABT% 2 bloke reaktif ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş koyun serumu. </li><li> İsteğe bağlı: Gerekli antikor çözümleri hacmini azaltmak için slayt doku bölümleri etrafında daireler çizmek için bir hidrofobik kalem kullanın. </li><li> ISH nemlendirilmiş bir odada Blokaj tamponu ile oda sıcaklığında 1 saat için slaytlar inkübe edin. </li><li> bir yaban turbu peroksidaz ile 4 ° C&#39;de (POD) de slaytlar O / N inkübe - konjugatD, anti-FITC antikoru 1/500 (h / h) ISH engelleme tamponu seyreltilmiştir. </li><li> % 0.1 (h / h) Tween-20 (PBST) ile PBS içeren bir Coplin kavanoza slaytlar yerleştirin. her PBST içinde 10 dakika süre ile 3 kere yıkayın ve taze PBST ile değiştirin. </li><li> Kullanımdan hemen önce, Amplifikasyon seyreltici olarak 100 kez seyreltilmesi ile floresan tiramid hazırlar. Bu örnek için, FITC-tiramid kullanımı. </li><li> slaytlar bu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. </li><li> Bir Coplin kavanoza slaytlar yerleştirin ve 10 dakika süre ile PBST içinde 3 kez yıkayın. </li></ol> DIG Probe 6. Görselleştirme <ol><li> 0.1 M Tris-HCl, pH 8.2 hazırlanır. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat için ISH bloke edici tampon ile slaytlar inkübe edin. </li><li> bir alkalin fosfataz (AP) ile 4 ° C&#39;de slaytlar O / N inkübe seyreltildi 1 / 1.500 (h / h) ISH engelleme tamponu, anti-DIG antikoru ile konjüge edilmiş. </li><li> 10 dakika için üç kez MABT ile yıkayınız. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0.1 M Tris-HCI pH 8.2 ile iki kez yıkanır. </li><li>Kullanımdan hemen önce, 0.1 M Tris, pH 8.2 tabletler çözülmesiyle Hızlı Kırmızı solüsyon hazırlanır. 0.22 um&#39;lik bir filtreden filtre solüsyonu. </li><li> nemli bir oda içinde Hızlı Kırmızı çözelti ile 37 ° C&#39;de slaytlar inkübe edin. uygun gelişimi için geçen sürenin de, çökeltinin oluşumuna izlemek için flüoresan mikroskop ile düzenli slaytlar edin. 3 saat - Bu örnekte, 2, sonra reaksiyonu durdurun. </li><li> 10 dakika için üç kez PBST ile yıkanır. </li></ol> 7. İmmünhistokimya <ol><li> IHC bloke tamponu hazırlayın:% 10 PBST (birincil antikor konak için farklı türlerin) (h / h) serum. </li><li> IHC nemlendirilmiş bir odada, oda sıcaklığında 1 saat süre ile blokaj tamponu ile slaytlar inkübe edin. </li><li> Primer antikor hazırlanması (birincil antikor konakçıya farklı türlerin)% 5 serum ile PBST içinde, uygun bir seyreltme oranında primer antikor seyreltin. Bu örnekte, 1/400 (h / h) seyreltmede bir tavşan anti-olig2 antikor kullanımı. </li><li>4 ° de CO / N primer antikor çözeltisi içinde inkübe edin. </li><li> 10 dakika için üç kez PBST ile yıkanır. </li><li> İkincil antikor hazırlanması: Bu örnekte ve% 0.1 (h / h) Hoechst 33258. (farklı bir birincil antikor konak türlerin)% 5 ile PBST içinde, uygun bir seyreltme oranında (hac / hac), serum, bir florofor-konjuge sekonder antikor seyreltik 1 / 1.000 (h / h) seyreltmede ikincil antikor Alexa647 bir eşek anti-tavşan kullanın. </li><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin. </li><li> 10 dakika için üç kez PBST ile yıkanır. </li></ol> 8. Montaj <ol><li> Kısmen oda sıcaklığında slaytlar kuru ve, floresan montaj ortamına sahip monte edilir. Hızlı Red için 570 nm, FITC için 488 nm, olig2 immüno için 647 nm ve Hoechst için 350 nm: 10X altında konfokal mikroskop sonra, 20X ve aşağıdaki uyarma dalga boyları ile 4 farklı kanalları kullanarak 63X hedefleri görüntü kuru ve slaytlar bırakın . </li></ol>

<ol><li>Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+as+intrinsic+components+of+non-cell-autonomous+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).</li>
<li>Baslow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylaspartate+in+the+vertebrate+brain%3A+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.</a> Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).</li>
<li>Hoshino, H., Kubota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canavan+disease%3A+clinical+features+and+recent+advances+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Int%22%5BJournal%5D)">Canavan disease: clinical features and recent advances in research.</a> Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).</li>
<li>Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+human+aspartoacylase+cDNA+and+a+common+missense+mutation+in+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease.</a> Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).</li>
<li>Divry, P., Mathieu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+deficiency+and+N-acetylaspartic+aciduria+in+patients+with+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease.</a> Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).</li>
<li>Bartalini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+diagnosis+of+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Childs+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Biochemical diagnosis of Canavan disease.</a> Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).</li>
<li>Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetylaspartate+in+the+CNS%3A+from+neurodiagnostics+to+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology.</a> Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).</li>
<li>D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occurrence+of+N-acetylaspartate+amidohydrolase+%28aminoacylase+II%29+in+the+developing+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat.</a> J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).</li>
<li>Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+regional+distribution+of+aspartoacylase+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue.</a> J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).</li>
<li>Sommer, A., Sass, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+aspartoacylase+%28ASPA%29+and+Canavan%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan.</a> Gene. 505 (2), 206-210 (2012).</li>
<li>Klugmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+distribution+of+aspartoacylase+in+the+postnatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain.</a> Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).</li>
<li>Madhavarao, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+aspartoacylase+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system.</a> J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).</li>
<li>Hershfield, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+is+a+regulated+nuclear-cytoplasmic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme.</a> Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).</li>
<li>Moffett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+aspartoacylase+expression+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system.</a> Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).</li>
<li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+is+restricted+primarily+to+myelin+synthesizing+cells+in+the+CNS%3A+therapeutic+implications+for+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease.</a> Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).</li>
<li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+of+aspartoacylase+in+oligodendrocytes+parallels+CNS+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination.</a> Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu protokol immün tarafından takip In situ hibridizasyon çift RNA için bir adım-adım prosedürü sağlar. Biz Aspa birkaç beyin bölgelerindeki olgun oligodendrosit ifade edilmektedir onaylamak için bu protokolü kullanılır. Bu çok aşamalı prosedür hassasiyetini etkileyebilir ve kaçınılmalıdır pek çok potansiyel tuzaklar vardır. İlk olarak, transkripsiyon reaksiyonu için tüm çözümleri ve depolama tamponlar RNaz ücretsiz olması gerekir. İkinci o...

Merkezi sinir sisteminde (CNS) içinde en bol hücrelerdir glial hücreler, oligodendrositlerin (CNS myelinating hücreleri), oligodendrositler öncüleri (aynı zamanda &quot;NG2 hücreler&quot; olarak da bilinir OP), astrositler ve mikroglia içermektedir. Nörolojik hastalıklarda 1 glial hücreler ve bunların potansiyel rolleri fonksiyonları artan bir ilgi vardır. Örneğin, Canavan hastalığı (CD) genellikle yaş 2,3 10 yıl önce ölüme yol açan, erken süngersi leukodystrophy ve nöronların ilerleyici kaybı ile bebeklik döneminde başlayan bir kalıtsal nörodejeneratif bir hastalıktır. Yol Aspartoacyclase (ASPA&#39;nın) genindeki mutasyonlar ölçüde CD ASPA&#39;nın aktivitesi 4 düşürülen tespit edilmiştir. ASPA N-asetilaspartat (NAA) deasetilasyonu katalize bir enzim, yüksek beyin içinde konsantre molekülü üreten asetat, aspartat 5-7. Birçok CD hasta nedeniyle ASPA ac eksikliği NAA daha yüksek olduğunu göstermektedirtivity. Bazı çalışmalar NAA türetilmiş asetat gelişimi sırasında yağ asitleri / beyinde lipidlerin önemli bir kaynağı olabilir ve 3,5,6 aşağı kırılması NAA yetmezliği nedeniyle gelişimi sırasında miyelin sentezi azaldığı CD neden olabilir spekülasyon. ASPA ağırlıklı beyin böbrek, karaciğer ve beyaz cevherde bulunan ve CD&#39;deki ASPA önemli rolü verilir, beyindeki bu enzimin hücre ifadesi birkaç laboratuvarlar tarafından incelenmiştir. Beyinde ASPA enzimatik aktivite bakarak, daha önceki çalışmalarda beyin gelişimi sırasında ASPA aktivite artışı miyelinasyon 8-10 zaman sürecini paralellik bulundu. Hücresel düzeyde, enzimatik aktivitesi için hem de in situ hibridizasyon (ISH) ve immünohistokimya (IHC) deneyleri ASPA&#39;nın esas olarak beyinde konumlandığı, fakat nöronlar veya astrosit 11-16 oligodentrositler ifade olduğunu göstermektedir analizleri. Birkaç çalışmalarda ASPA da olabilir oCNS 12,14 olarak mikroglia olarak ifade edilebilir. Operasyonel olarak ASPA ifadesine Şimdiye kadar veriler sınırlıdır. Nöronlar, astrositler, OP&#39;lerle, yeni kurulan oligodendrositler, myelinating oligodendrositler, mikroglia, endotelyal hücreler ve perisitlere dahil fare serebral korteks farklı hücre tiplerinin transcriptomes RNA sıralanması 17 ile analiz edildi Yeni bir araştırmaya göre, ASPA sadece oligodendrositlere ifade edilir , oligodendrositlerin myelinating özellikle (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Beyinde ASPA ifade deseni bu çalışmalara rağmen, belirsizliklerin bir dizi kalır. Farklı teknikler gen ekspresyonu incelemek için kullanılabilir. IHC doku kesitlerinde bir gen ekspresyonunun işlevsel bir ürün (örneğin, protein) tespit etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. uygulama ve özgünlüğü tabi t gibi onun büyük yarar rağmen, bu tekniğin sınırlamaları vardırihtiyaç duyulan antikorun mevcudiyeti ve özgünlüğü o. Buna karşılık, ISH mRNA düzeyinde bir genin ekspresyonunu ortaya çıkarmak mümkün olma avantajına sahiptir. Bununla birlikte, özel hücre tipleri için bir gen ekspresyonunu lokalize etmek için aynı anda birden fazla prob kullanımı teknik olarak zor olabilir. Bu yazıda, bir proteinin floresan immüno ile in situ hibridizasyon çift floresan RNA birleştiren bir protokol açıklar. Biz fare beyninde Aspa salgılanma modelini incelemek için teknikler bu dizi kullandık. Bu yöntem, konfokal mikroskopi kullanılarak gen ekspresyonunun hassas çalışma sağlar.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>for ISH blocking buffer</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt&#039;s solution</td><td>Life Technologies</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Aspa cDNA clone</td><td>Source Bioscience</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Equilibrated phenol</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>Aldrich</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR International</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG NTP mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Fisher scientific</td><td>005479470</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge needle</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Cole-Parmer Instrument Co. Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>No.2 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Coronal Brain Matrix</td><td>World Precision Instruments</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Personna Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Tissue tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/microtome</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>for 65 &amp;deg;C wash buffer</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic pen</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-FITC POD-conjugated antibody</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&amp;trade; Plus Fluorescein System</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1,500</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-DIG AP-conjugated</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Fast red tablets</td><td>Roche</td><td>11496549001</td><td></td></tr><tr><td>.22 &amp;micro;M filter</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Olig2 Rabbit antbody</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 647-conjugated &amp;alpha;-rabbit antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-31573</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 confocal microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combining double fluorescence in situ hybridization with immunolabelling for detection of the expression of three genes in mouse brain sections

Beyin hücreleri, örneğin nöronlar, astrositler, oligodendrositler, oligodendrosit öncüleri ve mikroglia farklı gen ifadesinin saptanması, immün spesifik primer ya da sekonder antikorların yokluğuyla engellenebilir. Burada üçüncü geni tarafından kodlanan proteine ​​karşı yöneltilmiş yüksek özgüllük bir antikor ile immün ardından, iki gen spesifik problar ile in situ hibridizasyon, çift floresan kullanılarak aynı beyin kısmında üç farklı gen ekspresyonunu tespit etmek için bir protokol açıklar. Aspartoacyclase (ASPA) geni, mutasyonlar nadir insan beyaz madde hastalığı neden olabilir - Canavan hastalığı - oligodendrositler ve mikroglia ancak astrositler ve nöron ifade edilmesi düşünülmektedir. Bununla birlikte, beyinde ASPA kesin ifade deseni henüz belirlenmemiştir zorundadır. Bu protokol ASPA olgun oligodendrosit a bir alt kümesi olarak ifade edildiğini belirlemek için bize izin verdiND genellikle gen ekspresyon paterni çalışmalar çeşitli uygulanabilir.

Bu makalede, bir fare beyin bölümlerinde immüno ardından çift flüoresan ISH için bir yöntem tarif eder. Bu protokolün kısa bir açıklama ilk adım Aspa ve MBP (miyelin bazik proteini) özel problar sentezlemek oldu Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Probes sentezlenmiş olduğunu kontrol etmek için, her bir reaksiyonun küçük bir kısım, bir agaroz jel üzerinde yürütülmüştür. Hafif lineer şablonu ve RNA probu büyük miktarda <stro...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections at JoVE.com

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

14.0K Görüntüleme.  University College London. Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Video: Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Nörobilim

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Lipofilik boya birleştiren In situ Hibridizasyon, İmmünohistokimya ve Histoloji

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Gelişim Biyolojisi

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Genetik

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Kemirgen beyninde protein Ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

Farelerin Nöral Kök Hücreleri ve Beyinlerinde 5-Hidroksimetilsitozozin Insaptama

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections

<a href='https://app.jove.com/v/53976/combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling'>Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (2016).</a>This video demonstrates the use of double fluorescence in situ hybridization to visualize the expression of two RNA targets in mouse brain sections. The protocol involves sequential detection of RNA using probes labeled with fluorescein isothiocyanate and digoxigenin, followed by enzymatic signal amplification to enhance sensitivity. The resulting fluorescence enables co-localization analysis of the target RNAs within the tissue.

Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse ...

Çift Floresan birleştiren

Özet

Daha Fazla Video Keşfet