Work in the authors' laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, "Ideas" Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.

Declaração de ética: Rato criação e manipulação estão em conformidade com os regulamentos UK Home Office e as orientações do comitê de ética UCL, cumprindo com os Animais (procedimentos científicos) Act de 1986 do Reino Unido e dos seus regulamentos de alteração 2012. Nota: Todas as soluções devem ser feitos com pirocarbonato de dietilo (DEPC) - água tratada para destruir qualquer RNase residual. Para o tratamento DEPC, adicione DEPC (1 ml por litro), agitar vigorosamente até que todos os glóbulos DEPC desapareceram depois autoclave para degradar o DEPC. 1. RNA Probe Synthesis <ol><li> CUIDADO: Ao manusear formamida, usar Equipamentos de Proteção Individual (EPI) e usar uma cabine de segurança. Preparar tampão de hibridação: água desionizada com 50% (v / v) de formamida desionizada, NaCl 200 mM, EDTA 5 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, tratada com DEPC 5 mM de NaH 2 PO 4, 5 mM de Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml de ARNt de levedura, 1 × soluti de Denhardtno, e 10% w / v de sulfato de dextrano. </li><li> Escolher um clone de ADN que contém a sequência de cDNA do gene de interesse num plasmídeo com promotores de ARN-polimerase. Para este exemplo, utilizar um clone de ADN pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), com T7 e promotores da polimerase de ARN de Sp6 para Aspa (Recurso Figura 1). </li><li> Preparar DNA de plasmídeo linearizado como molde. <ol><li> Cresça o clone de ADN, extrair o plasmídeo com um kit de purificação de plasmídeo em pequena escala de acordo com o protocolo do fabricante e a sequência com a T7 e os iniciadores universais SP6. </li><li> Digerir o ADN do plasmídeo 1020 ug com uma enzima de restrição que corta na extremidade 5 &#39;da cadeia com sentido do cDNA. Para este exemplo, usamos 100 unidade Sal I para digerir o plasmídeo pCMV-SPORT6- Aspa. Incubar durante 1,5 horas a 37 o C. </li><li> Executar uma pequena alíquota num gel de agarose para verificar que o plasmídeo é linearizado totalmente. </li></ol></li><li> Purifica-se oplasmídeo linearizado utilizando fenol-clorofórmio. <ol><li> Adicionar 1/10 volume de 3 M de acetato de sódio, um volume de Tris 10 mM HCI (pH 8,0) - fenol equilibrado e um volume de clorofórmio / álcool isoamílico (IAA) (24: 1). </li><li> Centrifugar a 16000 xg durante 1 min à temperatura ambiente (20 - 25 ° C, TA) e extrai-se fase aquosa superior. </li><li> Adicionar um volume de clorofórmio / IAA, centrifugar a 16000 xg durante 1 min e extrair fase aquosa superior. </li><li> Repita o passo 1.4.3. </li><li> Adicionar 2 volumes de etanol e deixou-se a -20 ° C durante 1 h ou O / N. </li><li> Centrifuga-se a 16000 xg, a 4 ° C durante 10 min. Descartar o sobrenadante. </li><li> Lava-se a pastilha com etanol frio a 70% e ressuspender em approximatively um ADNc ug por 2,5 ul em TE (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 7,5). </li></ol></li><li> Sintetizar as duas sondas, uma marcada com digoxigenina (DIG) e a outra com isotiocianato de fluoresceína (FITC). <ol><li> Seleccione a RNA polimerase adequada para fazer o anti-sesonda NSE (complementar para o ARNm alvo). Para este exemplo, utilizar ARN-polimerase T7 para fazer sonda Aspa. </li><li> Prepare a reacção de transcrição in vitro: adicionar 1 ug do ADN linearizado, 4,0 ul 5 tampão de transcrição X, 6,0 ul de DTT 100 mM, 2,0 ul de 10x DIG ou FITC ARN rotulagem mistura contendo dNTP, 1 ul de inibidor de RNase, e 20 - 40 unidades de polimerase de ARN; tornar o volume final até 20 ul com água tratada com DEPC. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 1,5 horas. </li></ol></li><li> RUN1 ul da reacção de transcrição num gel de agarose a 1,0% para verificar que a reacção funcionou. O gel deve mostrar o modelo linear e uma banda brilhante da sonda. </li><li> Completar o volume até 100 ul com tampão de hibridação e armazenar alíquotas de 10 uL a -80 ° C. </li></ol> 2. Perfusão, Fixação e Recolha de Tecidos <ol><li> CUIDADO: Ao manusear paraformaldeído (PFA), ambos sólida eaquosa, utilizar EPI e usar uma cabine de segurança. Preparar a solução de formaldeído por dissolução de 4% (w / v) de PFA em 1x tampão fosfato salino (PBS) utilizando calor (55 ° C). Filtra-se a solução de formaldeído com papel de filtro. </li><li> Preparar a solução de sacarose através da dissolução de 20% (w / v) de sacarose em água destilada e adiciona-se 0,1% (v / v) de DEPC. Deixe O / N à temperatura ambiente com uma tampa solta e, em seguida, autoclave. </li><li> Terminalmente anestesiar um ratinho por injecção intra-peritoneal de pentobarbital (50 mg / kg). Avaliar a profundidade da anestesia por pitada dedo do pé e ausência de reflexo de retirada indica anestesia profunda. </li><li> Uma vez que o mouse está sob anestesia profunda, fazer uma incisão abaixo da caixa torácica e cortar através da caixa torácica em ambos os lados, levante-a para expor o coração. </li><li> Inserir uma agulha de 25 G para o ventrículo esquerdo do coração. Fazer uma pequena incisão no átrio direito do coração. </li><li> Perfundir o animal com 20 ml de PBS e, em seguida, 40 ml de solução de formaldeído. Para P30 e mais velhosratinhos, utilizar uma taxa de perfusão de 12 ml / min, mas para os animais mais jovens usar uma taxa mais baixa (7-10 ml / min). </li><li> Dissecar o cérebro. <ol><li> Cortar a cabeça do rato com uma tesoura cirúrgica, fazendo uma posterior corte das orelhas. Fazer uma incisão na linha média na pele caudal e rostral trabalhar para remover a pele do crânio. </li><li> A partir da parte caudal, corte através da parte superior do crânio, ao longo da linha média e entre os olhos com uma tesoura íris. Remova o parietal e placas ósseas frontais inclinando um lado de uma placa de osso de cada vez e colocando-a fora com pinças. </li><li> Incline ligeiramente o cérebro para cima a partir da parte anterior com uma pinça e cortar os nervos ópticos e outros nervos cranianos. Levante cuidadosamente o cérebro fora do crânio. </li></ol></li><li> Coloque o cérebro em uma matriz cérebro coronal mouse. Cortar o cérebro em 3 de aproximadamente 4 pedaços mm com uma lâmina de barbear pena. </li><li> Transferir as fatias em solução PFA a 4% e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> cérebro transferênciafatias para tratada com DEPC 20% de solução de sacarose e incubar O / N a 4 ° C </li><li> Coloque cada fatia do cérebro em um cryomould seca, cercar com a temperatura ideal de corte médio (OCT) e congelar em gelo seco. Armazenar a -80 ° C. </li></ol> 3. cryosectioning <ol><li> Corte de 15 um secções de tecido congelado em um criostato e recolher as secções em lâminas de microscópio. Se necessário, molhar as seções com PBS tratado com DEPC e alise-os com um pincel fino. </li><li> Deixar as lâminas secar durante aproximadamente 1 h para assegurar que o tecido adere à lâmina. </li></ol> 4. Hibridização <ol><li> Preparar o tampão de lavagem de 65 ° C: 150 mM de NaCl, 15 mM de Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (1x ​​= citrato de sódio salino), 50% (v / v) de formamida e 0,1% (v / v) de Tween- 20. </li><li> Preparar tampão MABT: ácido maleico 100 mM, NaCl 150 mM, 0,1% (v / v) de Tween-20, pH 7,5. </li><li> Diluir as duas sondas (DIG-rotulados e FITC-Labelled) 1 / 1.000 em tampão de hibridação pré-aquecida a 65 ° C e misture bem. </li><li> Aplicar cerca de 300 ul de mistura de hibridação sobre cada lâmina, coverslipwith (C 200 o) lamelas de forno e incubar O / N a 65 ° C numa câmara humidificada. </li><li> Transferir as lâminas em um frasco Coplin contendo tampão de lavagem pré-aquecido. Lavam-se as lâminas durante 30 min, duas vezes a 65 ° C com tampão de lavagem. </li><li> Lavam-se as lâminas durante 10 minutos três vezes com MABT à TA. </li></ol> 5. Visualização do Probe FITC <ol><li> Preparar tampão de bloqueio ISH: MABT com reagente de bloqueio a 2% e 10% de soro de ovelha inactivado pelo calor. </li><li> Opcional: utilizar uma caneta hidrofóbico para desenhar círculos em torno das secções de tecido na lâmina para reduzir o volume das soluções de anticorpo necessários. </li><li> Incubar as lâminas durante 1 h à temperatura ambiente com tampão de bloqueio ISH numa câmara humidificada. </li><li> Incubar as lâminas O / N a 4 ° C com uma peroxidase de rábano (POD) - conjugadoanticorpo anti-FITC d diluído 1/500 (v / v) de tampão de bloqueio ISH. </li><li> Colocar as lâminas em um frasco Coplin contendo PBS com 0,1% (v / v) de Tween-20 (PBST). Lavar 3 vezes durante 10 min em PBST e substituir com PBST fresco de cada vez. </li><li> Imediatamente antes da utilização, prepare o tiramida fluorescente diluindo 100 vezes no diluente amplificação. Para este exemplo, utilizar FITC-tiramida. </li><li> Adicione isto a os slides e deixe por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Colocar as lâminas em um frasco Coplin e lavar 3 vezes em PBST durante 10 min. </li></ol> 6. Visualization da Sonda DIG <ol><li> Prepare 0,1 M Tris-HCl pH 8,2. </li><li> Incubar as lâminas com tampão ISH bloqueio durante 1 h à TA. </li><li> Incubar as lâminas O / N a 4 ° C com uma fosfatase alcalina (AP) -conjugated anticorpo anti-DIG diluído a 1 / 1.500 (v / v) de tampão de bloqueio ISH. </li><li> Lavar com MABT durante 10 minutos, três vezes. </li><li> Lavar duas vezes com 0,1 M de Tris-HCl pH 8,2, durante 5 min à TA. </li><li>Imediatamente antes da utilização, preparar solução Fast Red por dissolução dos comprimidos em 0,1 M de Tris pH 8,2. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um. </li><li> Incubar as lâminas a 37 ° C com uma solução de Fast Red numa câmara humidificada. À medida que o tempo para o desenvolvimento óptimo varia, verificar regularmente as lâminas com um microscópio de fluorescência para monitorizar a formação de precipitado. Para este exemplo, parar a reacção após 2-3 h. </li><li> Lavar com PBST, durante 10 minutos, três vezes. </li></ol> 7. Imuno-histoquímica <ol><li> Prepare tampão de bloqueio IHC: 10% (v / v) de soro (de uma espécie diferente de acolhimento anticorpo primário) em PBST. </li><li> Incubar as lâminas com IHC tampão de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente numa câmara humidificada. </li><li> Prepare anticorpo primário: diluir o anticorpo primário a uma diluição adequada em PBST com% de soro 5 (de uma espécie diferente de acolhimento anticorpo primário). Para este exemplo, utilizar um anticorpo de coelho anti-Olig2 a 1/400 (v / v) de diluição. </li><li>Incubar na solução de anticorpo primário a 4 ° CO / N. </li><li> Lavar com PBST, durante 10 minutos, três vezes. </li><li> Prepare o anticorpo secundário: diluir um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo em uma diluição apropriada em PBST com 5% (v / v) de soro (de uma espécie diferente de anticorpo primário hospedeiro) e 0,1% (v / v) a Hoechst 33258. Para este exemplo , usar um burro anti-coelho Alexa647 anticorpo secundário a 1 / 1.000 (v / v) de diluição. </li><li> Incubar na solução de anticorpo secundário à TA durante 1 h. </li><li> Lavar com PBST, durante 10 minutos, três vezes. </li></ol> 8. montagem <ol><li> Parcialmente secar as lâminas a RT, e montar com um meio de montagem de fluorescência. Deixe os slides para secar e depois imagem em um microscópio confocal sob 10X, 20X e 63X objetivos utilizando 4 canais diferentes com os seguintes comprimentos de onda de excitação: 570 nm para o Red rápido, 488 nm para FITC, 647 nm para Olig2 imunomarcação e 350 nm para a Hoechst . </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para um ARN de dupla hibridização in situ seguindo-se a imunocoloração. Temos utilizado este protocolo para confirmar que Aspa é expresso em oligodendrócitos maduros em várias áreas do cérebro. Este processo multi-passo tem muitas armadilhas potenciais que podem afectar a sensibilidade e deve ser evitado. Em primeiro lugar, todas as soluções e tampões de armazenamento para a reacção de transcrição precisa ...

As células da glia, que são as células mais abundantes no sistema nervoso central (SNC), compreendem oligodendrócitos (células mielinizantes do sistema nervoso central), oligodendrócitos precursores (PO, também conhecidos como &quot;células&quot;) NG2, astrócitos e microglia. Há um interesse crescente nas funções de células gliais e de seus papéis potenciais em doenças neurológicas 1. Por exemplo, a doença de Canavan (CD) é uma doença neurodegenerativa hereditária começando no início da infância com leucodistrofia espongiforme e uma perda progressiva de neurónios, que conduz a morte geralmente antes dos 10 anos de idade 2,3. As mutações no gene Aspartoacyclase (ASPA) que levam à redução da actividade drasticamente ASPA 4 em CD foram identificados. ASPA é uma enzima que catalisa a desacetilação de N-acetilaspartato (NAA), uma molécula altamente concentrada no cérebro, acetato de gerar e aspartato 5-7. Muitos pacientes com DC apresentam níveis mais elevados de NAA devido à falta de ASPA actividade. Alguns estudos especular que o acetato de NAA-derivado pode ser uma importante fonte de ácidos gordos / lípidos no cérebro durante o desenvolvimento e CD podem resultar da diminuição da síntese de mielina durante o desenvolvimento causado pela falha de NAA para ser discriminado 3,5,6. ASPA é predominantemente encontrado no rim, no fígado e da matéria branca do cérebro, e dado o papel importante da ASPA em CD, a expressão celular desta enzima no cérebro tem sido estudado por vários laboratórios. Ao olhar para a actividade enzimática ASPA no cérebro, estudos anteriores descobriu que o aumento da actividade durante o desenvolvimento cerebral ASPA paralelo ao curso de tempo de 8-10 mielinização. Ao nível celular, ensaios para a actividade enzimática, bem como hibridação in situ (ISH) e imuno-histoquímica (IHC) ASPA análises sugerem que é expresso principalmente em oligodendrócitos no cérebro, mas não em neurónios ou de astrócitos 11-16. Alguns estudos descobriram que ASPA pode tambémser expresso em microglia no sistema nervoso central 12,14. dados até agora sobre a expressão ASPA em PO são limitadas. De acordo com um estudo recente em que transcriptomes de diferentes tipos de células no córtex cerebral do rato, incluindo neurónios, astrócitos, PO, oligodendrócitos recém-formados, oligodendrócitos myelinating, microglia, células endoteliais e pericitos foram analisados ​​por ARN de sequenciação 17, ASPA é expresso exclusivamente em oligodendrócitos , em particular em myelinating oligodendrócitos (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Apesar desses estudos sobre padrão de expressão ASPA no cérebro, uma série de incertezas permanecem. técnicas diferentes podem ser usadas para estudar os padrões de expressão de genes. IHC é um método vulgarmente utilizado para detectar o produto funcional (ou seja, proteína) de um gene de expressão em secções de tecido. Apesar de sua grande utilidade, esta técnica tem limitações como a sua aplicação e especificidade estão sujeitas tO a disponibilidade e a especificidade do anticorpo necessário. Por comparação, a ISH tem a vantagem de ser capaz de revelar a expressão de qualquer gene ao nível do ARNm. No entanto, pode ser tecnicamente difícil de usar várias sondas ao mesmo tempo, a fim de localizar um gene de expressão para tipos de células específicos. Neste artigo, descreve-se um protocolo que combina ARN de dupla fluorescência de hibridação in situ com fluorescência de uma imunomarcação de proteínas. Temos utilizado este conjunto de técnicas para analisar o padrão de expressão da Aspa no cérebro do rato. Este método permite o estudo preciso da expressão génica utilizando microscopia confocal.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>for ISH blocking buffer</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt&#039;s solution</td><td>Life Technologies</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Aspa cDNA clone</td><td>Source Bioscience</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Equilibrated phenol</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>Aldrich</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR International</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG NTP mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Fisher scientific</td><td>005479470</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge needle</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Cole-Parmer Instrument Co. Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>No.2 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Coronal Brain Matrix</td><td>World Precision Instruments</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Personna Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Tissue tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/microtome</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>for 65 &amp;deg;C wash buffer</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic pen</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-FITC POD-conjugated antibody</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&amp;trade; Plus Fluorescein System</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1,500</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-DIG AP-conjugated</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Fast red tablets</td><td>Roche</td><td>11496549001</td><td></td></tr><tr><td>.22 &amp;micro;M filter</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Olig2 Rabbit antbody</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 647-conjugated &amp;alpha;-rabbit antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-31573</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 confocal microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combining double fluorescence in situ hybridization with immunolabelling for detection of the expression of three genes in mouse brain sections

Detecção de expressão de genes em diferentes tipos de células do cérebro, por exemplo, neurónios, astrócitos, oligodendrócitos, microglia e oligodendrócitos precursores, pode ser dificultada pela falta de anticorpos primários ou secundários específicos para a imunocoloração. Descrevemos aqui um protocolo para detectar a expressão de três genes diferentes na mesma secção utilizando cérebro de fluorescência dupla de hibridação in situ com duas sondas específicas para o gene seguido de imunocoloração com um anticorpo de alta especificidade dirigida contra a proteína codificada por um terceiro gene. O gene Aspartoacyclase (ASPA), de mutações que podem conduzir a uma doença da matéria branca humana rara - doença de Canavan - é pensado para ser expresso em oligodendrócitos e a microglia, mas não em neurónios e astrócitos. No entanto, o padrão de expressão precisa de ASPA no cérebro tem ainda de ser estabelecidos. Este protocolo nos permitiu determinar que ASPA é expressa em um subconjunto de oligodendrócitos maduros umND pode ser geralmente aplicado a uma ampla gama de estudos padrão de expressão do gene.

Este artigo descreve um método para a ISH dupla fluorescência seguido por imunomarcação em seções do cérebro do rato. Uma breve descrição deste protocolo é demonstrado na Figura 1. O primeiro passo foi sintetizar sondas específicas para Aspa e MBP (proteína básica da mielina). Para verificar que as sondas foram sintetizadas, uma pequena aliquota de cada reacção foi efectuada num gel de agarose. O modelo linear fraco e uma grande quantidad...

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Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

14.0K visualizações.  University College London. Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Vídeo: Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Neurociência

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Combinando corante lipofílico, In situ Hibridação, imunohistoquímica e histologia

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Biologia do Desenvolvimento

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Genética

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Combinando Hibridização In Situ por Fluorescência Multiplex com Imunohistoquímica Fluorescente em Seções Cerebrais de Camundongos Frescos Congelados ou Fixos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections

<a href='https://app.jove.com/v/53976/combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling'>Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (2016).</a>This video demonstrates the use of double fluorescence in situ hybridization to visualize the expression of two RNA targets in mouse brain sections. The protocol involves sequential detection of RNA using probes labeled with fluorescein isothiocyanate and digoxigenin, followed by enzymatic signal amplification to enhance sensitivity. The resulting fluorescence enables co-localization analysis of the target RNAs within the tissue.

Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse ...

Combinando Duplo Fluorescência

Resumo

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