Work in the authors' laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, "Ideas" Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.

Declaración de Ética: Ratón cría y manejo están en conformidad con las regulaciones del Ministerio del Interior del Reino Unido y las directrices del comité de ética de la UCL, el cumplimiento de la Ley de 1986 del Reino Unido y su Reglamento Enmienda 2012 Animales (Procedimientos Científicos). NOTA: Todas las soluciones deben realizarse con pirocarbonato de dietilo (DEPC) - tratado con agua para destruir cualquier RNasa residual. Para el tratamiento DEPC, añadir DEPC (1 ml por litro), agitar vigorosamente hasta que todos los glóbulos DEPC han desaparecido continuación en autoclave para degradar la DEPC. 1. ARN sonda Síntesis <ol><li> PRECAUCIÓN: Al manipular formamida, llevar equipo de protección personal (EPP) y el uso de una cabina de seguridad. Preparar tampón de hibridación: tratada con DEPC agua desionizada con 50% (v / v) de formamida desionizada, NaCl 200 mM, EDTA 5 mM, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH 2 PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml tRNA de levadura, 1 x de Denhardt solutien, y 10% w / v de sulfato de dextrano. </li><li> Elija un clon de ADN que contiene la secuencia de ADNc del gen de interés en un plásmido con promotores de ARN polimerasa. Para este ejemplo, utilice un clon pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), con promotores T7 y polimerasa de ARN SP6 para Aspa (Figura 1). </li><li> Preparar ADN de plásmido linealizado como molde. <ol><li> Crecer el clon de ADN, extraer el plásmido con un kit de purificación de plásmido a pequeña escala de acuerdo con el protocolo del fabricante y la secuencia con la T7 y cebadores universales SP6. </li><li> Se digiere el plásmido de ADN 1020 g con una enzima de restricción que corta en el extremo 5 &#39;de la hebra codificante del ADNc. Para este ejemplo, utilice 100 unidad de Sal I para digerir el plásmido pCMV-SPORT6- Aspa. Incubar durante 1,5 horas a 37 ° C. </li><li> Ejecutar una pequeña alícuota en un gel de agarosa para comprobar que el plásmido se linealizó completamente. </li></ol></li><li> Se purifica elplásmido linealizado utilizando fenol-cloroformo. <ol><li> Añadir 1/10 volumen de acetato de sodio 3 M, un volumen de 10 mM Tris HCl (pH 8,0) - fenol equilibrado y un volumen de cloroformo / alcohol isoamílico (IAA) (24: 1). </li><li> Centrifugar a 16.000 xg durante 1 min a TA (20 - 25 ° C, RT) y se extrae la fase acuosa superior. </li><li> Añadir un volumen de cloroformo / IAA, centrifugar a 16.000 xg durante 1 min y se extrae la fase acuosa superior. </li><li> Repita el paso 1.4.3. </li><li> Añadir 2 volúmenes de etanol y dejar a -20 ° C durante 1 hora u O / N. </li><li> Centrifugar a 16.000 xga 4 ° C durante 10 min. Descartar el sobrenadante. </li><li> Lavar el precipitado con etanol al 70% frío y resuspender en aproximativamente 1 g de ADNc por 2,5 l de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5). </li></ol></li><li> Sintetizar las dos sondas, uno marcado con digoxigenina (DIG) y la otra con isotiocianato de fluoresceína (FITC). <ol><li> Seleccione la ARN polimerasa apropiada para hacer que el anti-SEsonda NSE (complementario al ARNm diana). Para este ejemplo, el uso de T7 ARN polimerasa para hacer sonda Aspa. </li><li> Preparar reacción de transcripción in vitro: añadir al menos 1 g de ADN linealizado, 4,0 l 5 tampón de transcripción x, 6,0 l de DTT 100 mM, 2,0 l de dNTPs que contienen 10 veces más DIG o FITC ARN mezcla de marcaje, 1 l inhibidor de RNasa, y 20 - 40 unidades de la ARN polimerasa; hacer que el volumen final hasta 20 l con agua tratada con DEPC. </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 1,5 horas. </li></ol></li><li> l run1 de la reacción de transcripción en un gel de agarosa al 1,0% para comprobar que la reacción ha funcionado. El gel debe mostrar la plantilla lineal y una banda brillante de la sonda. </li><li> Completar el volumen hasta 100 l con tampón de hibridación y almacenar 10 ml de alícuotas a -80 ° C. </li></ol> 2. Perfusión, Fijación y Recogida de tejido <ol><li> PRECAUCIÓN: Al manipular paraformaldehído (PFA), tanto sólidos comoacuosa, usar el PPE y el uso de una cabina de seguridad. Preparar la solución de formaldehído por disolución de 4% de solución de PFA en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (v w /) usando calor (55 ° C). Se filtra la solución de formaldehído con papel de filtro. </li><li> Preparar la solución de sacarosa disolviendo 20% (w / v) de sacarosa en agua destilada y añadir 0,1% (v / v) de solución de DEPC. Deja O / N a temperatura ambiente con una tapa suelta y luego autoclave. </li><li> Terminal anestesiar un ratón mediante inyección intra-peritoneal de pentobarbital (50 mg / kg). Evaluar la profundidad de la anestesia por pellizco del dedo del pie y la ausencia de reflejo de retirada indica anestesia profunda. </li><li> Una vez que el ratón está bajo anestesia profunda, hacer una incisión debajo de la caja torácica y cortar a través de la caja torácica en ambos lados, levántela para exponer el corazón. </li><li> Inserte una aguja 25-G en el ventrículo izquierdo del corazón. Hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón. </li><li> Perfundir el animal con 20 ml de PBS y luego una solución de formaldehído 40 ml. Para P30 y mayoresratones, utilice una velocidad de perfusión de 12 ml / min, pero para los animales más jóvenes utilizan una tasa más baja (7-10 ml / min). </li><li> Diseccionar el cerebro. <ol><li> Cortar la cabeza del ratón con tijeras quirúrgicas, haciendo un corte posterior de las orejas. Hacer una incisión en la línea media en la piel caudal y rostral trabajar para eliminar la piel de cráneo. </li><li> A partir de la parte caudal, cortar a través de la parte superior del cráneo a lo largo de la línea media y entre los ojos con unas tijeras iris. Retire el parietal y placas óseas frontales por la inclinación de un lado de una placa de hueso cada vez y encajándola con pinzas. </li><li> inclinar suavemente el cerebro hacia arriba desde la parte anterior con pinzas y cortar los nervios ópticos y otros nervios craneales. Levante con cuidado el cerebro fuera del cráneo. </li></ol></li><li> Coloque el cerebro en una matriz coronal del cerebro del ratón. Cortar el cerebro en aproximadamente 4 piezas 3 mm con una cuchilla de afeitar de plumas. </li><li> Transferir las rebanadas en solución PFA 4% e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> transferencia cerebrorebanadas de tratada con DEPC 20% de solución de sacarosa y se incuban O / N a 4 ° C </li><li> Coloque cada corte de cerebro en un cryomould seca, rodear con la temperatura óptima de corte (OCT) medio y la congelación en hielo seco. Almacenar a -80 ° C. </li></ol> 3. cryosectioning <ol><li> Cortar 15 micras secciones de tejido congelado en un criostato y recoger las secciones en portaobjetos de microscopio. Si es necesario, humedecer las secciones con PBS tratada con DEPC y se aplanan con un pincel fino. </li><li> Deja las diapositivas secar durante aproximadamente 1 hr para asegurar que el tejido se adhiere a la diapositiva. </li></ol> 4. La hibridación <ol><li> Preparar 65 ° C tampón de lavado: NaCl 150 mM, 15 mM Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1x solución salina de citrato de sodio), 50% (v / v) de formamida y 0,1% (v / v) de Tween- 20. </li><li> Preparar tampón MABT: mM ácido maleico 100, NaCl 150 mM, 0,1% (v / v) de Tween-20, pH 7,5. </li><li> Diluir las dos sondas (DIG-etiquetados y FITC-Labelled) 1 / 1.000 en tampón de hibridación precalentado a 65 ° C y mezclar bien. </li><li> Aplicar alrededor de 300 l de mezcla de hibridación en cada diapositiva, coverslipwith (C 200 o) cubreobjetos al horno y se incuba O / N a 65 ° C en una cámara húmeda. </li><li> Transferir los portaobjetos en una jarra Coplin que contiene tampón de lavado pre-calentado. Se lavan los portas durante 30 minutos dos veces a 65 ° C con tampón de lavado. </li><li> Se lavan los portas durante 10 minutos tres veces con MABT a TA. </li></ol> 5. La visualización de la sonda FITC <ol><li> Preparar tampón de bloqueo ISH: MABT con 2% de reactivo de bloqueo y suero de oveja inactivado por calor 10%. </li><li> Opcional: utilizar una pluma hidrófobo para dibujar círculos alrededor de las secciones de tejido en la diapositiva para reducir el volumen de soluciones de anticuerpos requeridos. </li><li> Incubar los portaobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente con ISH tampón de bloqueo en una cámara húmeda. </li><li> Incubar el portaobjetos O / N a 4 ° C con una peroxidasa de rábano picante (POD) - conjugadod anticuerpo anti-FITC diluido 1/500 (v / v) de tampón en ISH de bloqueo. </li><li> Colocar los portaobjetos en un tarro Coplin que contenía PBS con 0,1% (v / v) de Tween-20 (PBST). Lavar 3 veces durante 10 minutos en PBST y reemplazar con PBST fresco cada vez. </li><li> Inmediatamente antes de su uso, preparar la tiramida fluorescente mediante la dilución de 100 veces en el diluyente de amplificación. Para este ejemplo, utilizar FITC-tiramida. </li><li> Agregue esto a los portaobjetos y dejar actuar durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Colocar los portaobjetos en una jarra Coplin y lavar 3 veces en PBST durante 10 minutos. </li></ol> 6. La visualización de la sonda DIG <ol><li> Preparar 0,1 M Tris-HCl pH 8,2. </li><li> Incubar los portaobjetos con tampón de bloqueo ISH durante 1 hora a RT. </li><li> Incubar el portaobjetos O / N a 4 ° C con una fosfatasa alcalina (AP) conjugado con anticuerpo anti-DIG diluido 1 / 1.500 (v / v) de tampón en ISH de bloqueo. </li><li> Lavar con MABT durante 10 minutos tres veces. </li><li> Lavar dos veces con 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 durante 5 min a RT. </li><li>Inmediatamente antes de su uso, preparar la solución Fast Red por disolución de las tabletas en Tris 0,1 M pH 8,2. Se filtra la solución a través de un filtro de 0,22 M. </li><li> Incubar los portaobjetos a 37 ° C con una solución de Fast Red en una cámara húmeda. A medida que el tiempo para el desarrollo óptimo varía, compruebe las diapositivas regularmente con un microscopio de fluorescencia para monitorizar la formación de precipitado. Para este ejemplo, detener la reacción después de 2 - 3 hr. </li><li> Lavar con PBST durante 10 minutos tres veces. </li></ol> 7. La inmunohistoquímica <ol><li> Preparar el tampón de bloqueo IHC: 10% (v / v) de suero (de una especie diferente a anfitrión anticuerpo primario) en PBST. </li><li> Incubar los portaobjetos con IHC tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara humidificada. </li><li> Preparar el anticuerpo primario: diluir el anticuerpo primario a una dilución apropiada en PBST con 5% de suero (de una especie diferente a anfitrión anticuerpo primario). Para este ejemplo, utilizar un anticuerpo de conejo anti-Olig2 a 1/400 (v / v) de dilución. </li><li>Incubar en la solución de anticuerpo primario a 4 ° CO / N. </li><li> Lavar con PBST durante 10 minutos tres veces. </li><li> Preparar el anticuerpo secundario: diluir un anticuerpo secundario fluoróforo conjugado a una dilución apropiada en PBST con 5% (v / v) de suero (de una especie diferente a anfitrión anticuerpo primario) y 0,1% (v / v) de Hoechst 33258. Para este ejemplo , utilizar un burro anti-conejo Alexa647 anticuerpo secundario a 1 / 1.000 (v / v) de dilución. </li><li> Incubar en la solución de anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Lavar con PBST durante 10 minutos tres veces. </li></ol> 8. montaje <ol><li> Parcialmente secar los portaobjetos a TA, y montar con un medio de montaje de fluorescencia. Deja las diapositivas secar y luego la imagen en un microscopio confocal bajo 10X, 20X y 63X objetivos utilizando 4 canales diferentes con las siguientes longitudes de onda de excitación: 570 nm para Fast Red, 488 nm para FITC, 647 nm para Olig2 immunolabelling y 350 nm para Hoechst . </li></ol>

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	<li>Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+as+intrinsic+components+of+non-cell-autonomous+neurodegenerative+disease.">Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).</li><li>Baslow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylaspartate+in+the+vertebrate+brain:+metabolism+and+function.">N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.</a> Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).</li><li>Hoshino, H., Kubota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canavan+disease:+clinical+features+and+recent+advances+in+research.">Canavan disease: clinical features and recent advances in research.</a> Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).</li><li>Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+human+aspartoacylase+cDNA+and+a+common+missense+mutation+in+Canavan+disease.">Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease.</a> Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).</li><li>Divry, P., Mathieu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+deficiency+and+N-acetylaspartic+aciduria+in+patients+with+Canavan+disease.">Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease.</a> Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).</li><li>Bartalini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+diagnosis+of+Canavan+disease.">Biochemical diagnosis of Canavan disease.</a> Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).</li><li>Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylaspartate+in+the+CNS:+from+neurodiagnostics+to+neurobiology.">N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology.</a> Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).</li><li>D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence+of+N-acetylaspartate+amidohydrolase+(aminoacylase+II)+in+the+developing+rat.">The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat.</a> J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).</li><li>Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+regional+distribution+of+aspartoacylase+in+rat+brain+tissue.">Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue.</a> J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).</li><li>Sommer, A., Sass, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+aspartoacylase+(ASPA)+and+Canavan.">Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan.</a> Gene. 505 (2), 206-210 (2012).</li><li>Klugmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+distribution+of+aspartoacylase+in+the+postnatal+rat+brain.">Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain.</a> Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).</li><li>Madhavarao, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+aspartoacylase+in+the+rat+central+nervous+system.">Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system.</a> J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).</li><li>Hershfield, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+is+a+regulated+nuclear-cytoplasmic+enzyme.">Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme.</a> Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).</li><li>Moffett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+aspartoacylase+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system.</a> Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).</li><li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+is+restricted+primarily+to+myelin+synthesizing+cells+in+the+CNS:+therapeutic+implications+for+Canavan+disease.">Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease.</a> Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).</li><li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+increase+of+aspartoacylase+in+oligodendrocytes+parallels+CNS+myelination.">Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination.</a> Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para un ARN de doble hibridación in situ seguido de inmunotinción. Hemos utilizado este protocolo para confirmar que Aspa se expresa en oligodendrocitos maduros en varias áreas del cerebro. Este procedimiento de múltiples etapas tiene muchos peligros potenciales que pueden afectar a la sensibilidad y debe ser evitado. En primer lugar, todas las soluciones y tampones de almacenamiento para la reacción de transcripc...

Las células gliales, que son las células más abundantes en el sistema nervioso central (CNS), comprenden los oligodendrocitos (las células mielinizantes de CNS), oligodendrocitos precursores (PO, también conocidos como &quot;células NG2&quot;), astrocitos y microglia. Existe un creciente interés en las funciones de las células gliales y sus posibles funciones en enfermedades neurológicas 1. Por ejemplo, la enfermedad de Canavan (CD) es una enfermedad neurodegenerativa hereditaria a partir de principios en la infancia con leucodistrofia espongiforme y una pérdida progresiva de las neuronas, lo que lleva a la muerte por lo general antes de los 10 años de edad 2,3. Las mutaciones en el gen Aspartoacyclase (ASPA), que conducen a reducir drásticamente la actividad ASPA 4 en CD han sido identificados. ASPA es una enzima que cataliza la desacetilación de la N-acetil aspartato (NAA), una molécula altamente concentrado en el cerebro, acetato de generar y aspartato 5-7. Muchos pacientes con EC presentan mayores niveles de NAA, debido a la falta de ASPA actividad. Algunos estudios especulan que el acetato derivado de NAA podría ser una fuente importante de ácidos grasos / lípidos en el cerebro durante el desarrollo y CD puede resultar de la disminución de la síntesis de mielina durante el desarrollo causada por el fracaso de NAA ser desglosado 3,5,6. ASPA se encuentra predominantemente en el riñón, el hígado y la materia blanca del cerebro, y dado el importante papel de ASPA en CD, la expresión celular de esta enzima en el cerebro ha sido estudiada por varios laboratorios. Al mirar a la actividad enzimática ASPA en el cerebro, los estudios anteriores encontraron que el aumento de la actividad ASPA durante el desarrollo del cerebro es paralela a la evolución temporal de la mielinización 8-10. A nivel celular, los ensayos para la actividad enzimática, así como hibridación in situ (ISH) y la inmunohistoquímica (IHC) análisis sugieren que ASPA se expresa principalmente en oligodendrocitos en el cerebro pero no en las neuronas o astrocitos 11-16. Algunos estudios encontraron que éstos también ASPAexpresarse en microglia en el SNC 12,14. Hasta ahora los datos sobre la expresión de ASPA en OPs son limitadas. Según un estudio reciente en el que transcriptomes de diferentes tipos de células en la corteza cerebral de ratón incluyendo neuronas, astrocitos, PO, oligodendrocitos recién formados, los oligodendrocitos mielinizantes, microglia, células endoteliales, y los pericitos se analizaron mediante secuenciación de RNA 17, ASPA se expresa exclusivamente en oligodendrocitos , en particular en myelinating oligodendrocitos (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). A pesar de estos estudios sobre el patrón de expresión de ASPA en el cerebro, una serie de incertidumbres permanecen. Las diferentes técnicas se pueden utilizar para estudiar los patrones de expresión de genes. IHC es un método comúnmente utilizado para detectar el producto funcional (es decir, proteína) de un gen de expresión en secciones de tejido. A pesar de su gran utilidad, esta técnica tiene limitaciones en cuanto a su aplicación y especificidad están sujetas to la disponibilidad y la especificidad del anticuerpo sea necesario. En comparación, la ISH tiene la ventaja de ser capaz de revelar la expresión de cualquier gen en el nivel de mRNA. Sin embargo, puede ser técnicamente difícil de utilizar varias sondas al mismo tiempo con el fin de localizar una expresión de genes a determinados tipos de células. En este artículo, se describe un protocolo que combina ARN de doble fluorescencia de hibridación in situ con fluorescencia immunolabelling de una proteína. Hemos utilizado este conjunto de técnicas para examinar el patrón de expresión de Aspa en cerebro de ratón. Este método permite el estudio preciso de la expresión génica utilizando microscopía confocal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="460">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">QIAprep&#174; Miniprep</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:111px;">27104</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F9037</td>
			<td style="width:131px;">for ISH blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S3014</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T1503</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:111px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">20252.290</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:111px;">Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S8282</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:111px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">30435</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Yeast tRNA</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">10109495001</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">50x Denhardt&#39;s solution</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">750018</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Dextran sulfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D8906</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Aspa cDNA clone</td>
			<td style="width:111px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:111px;">IRAVp968C0654D</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">SalI</td>
			<td style="width:111px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:111px;">R0138</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S2889</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Equilibrated phenol</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P4557</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Chloroform</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2432</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:111px;">Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">496200</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Ethanol</td>
			<td style="width:111px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">20821.321</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">P4074</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Transcription buffer</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">P118B</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">100mM DTT</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">P117B</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">UTP-DIG NTP mix</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11277073910</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Rnasin</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">N251B</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6148</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Filter paper</td>
			<td style="width:111px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">005479470</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Sucrose</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">59378</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D5758</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Pentobarbitone</td>
			<td style="width:111px;">Animalcare Ltd</td>
			<td style="width:111px;">BN43054</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">15922</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">25 gauge needle</td>
			<td style="width:111px;">Terumo</td>
			<td style="width:111px;">300600</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:111px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:111px;">Cole-Parmer Instrument Co. Ltd</td>
			<td style="width:111px;">WZ-07522-30</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Iris scissors</td>
			<td style="width:111px;">Weiss</td>
			<td style="width:111px;">103227</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">No.2 tweezers</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">500230</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Coronal Brain Matrix</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">RBMS-200C</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Razor blade</td>
			<td style="width:111px;">Personna Medical</td>
			<td style="width:111px;">PERS60-0138</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">OCT medium</td>
			<td style="width:111px;">Tissue tek</td>
			<td style="width:111px;">4583</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Cryostat/microtome</td>
			<td style="width:111px;">Bright</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Superfrost plus slides</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">J1800AMNZ</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S4641</td>
			<td style="width:131px;">for 65&#176;C wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Formamide</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">F7503</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Tween-20</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1379</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Coverslips</td>
			<td style="width:111px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">631-0146</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Coplin Jar</td>
			<td style="width:111px;">Smith Scientific Ltd</td>
			<td style="width:111px;">2959</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11096176001</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:111px;">Heat-inactivated sheep serum</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S2263</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Hydrophobic pen</td>
			<td style="width:111px;">Cosmo Bio</td>
			<td style="width:111px;">DAI-PAP-S</td>
			<td style="width:131px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:111px;">&#945;-FITC POD-conjugated antibody</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11426346910</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:111px;">TSA&#8482; Plus Fluorescein System</td>
			<td style="width:111px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:111px;">NEL741001KT</td>
			<td style="width:131px;">1:1500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">&#945;-DIG AP-conjugated</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11093274910</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Fast red tablets</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11496549001</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">.22&#181;M filter</td>
			<td style="width:111px;">Millex</td>
			<td style="width:111px;">SLGP033RS</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">&#945;-Olig2 Rabbit antbody</td>
			<td style="width:111px;">Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AB9610</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:111px;">Alexa Fluor&#174; 647-conjugated &#945;-rabbit antibody</td>
			<td style="width:111px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">A-31573</td>
			<td style="width:131px;">1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">bisBenzimide H 33258</td>
			<td style="width:111px;">sigma</td>
			<td style="width:111px;">B2883</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:111px;">Dako</td>
			<td style="width:111px;">S3023</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:111px;">Leica SP2 confocal microscope</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining double fluorescence in situ hybridization with immunolabelling for detection of the expression of three genes in mouse brain sections

La detección de la expresión de genes en diferentes tipos de células cerebrales, por ejemplo, neuronas, astrocitos, oligodendrocitos, precursores de oligodendrocitos y microglia, puede verse obstaculizada por la falta de anticuerpos primarios o secundarios específicos para la inmunotinción. Aquí se describe un protocolo para detectar la expresión de tres genes diferentes en la misma sección cerebral mediante doble fluorescencia de hibridación in situ con dos sondas de genes específicos, seguido de inmunotinción con un anticuerpo de alta especificidad dirigido contra la proteína codificada por un tercer gen. El gen Aspartoacyclase (ASPA), las mutaciones de que puede conducir a una enfermedad de la materia blanca humana rara - enfermedad de Canavan - se cree que está expresado en oligodendrocitos y microglia, pero no en astrocitos y neuronas. Sin embargo, aún no se ha establecido el patrón de expresión precisa de ASPA en el cerebro. Este protocolo nos ha permitido determinar que ASPA se expresa en un subconjunto de los oligodendrocitos maduros unand en general se puede aplicar a una amplia gama de estudios de patrones de expresión génica.

Este artículo describe un método para un ISH doble fluorescencia seguido de inmunomarcaje en las secciones de cerebro de ratón. Una breve descripción de este protocolo se muestra en la Figura 1. El primer paso fue sintetizar sondas específicas para Aspa y MBP (proteína básica de mielina). Para comprobar que las sondas se han sintetizado, una pequeña alícuota de cada reacción se realizó en un gel de agarosa. La plantilla lineal débil y una gr...

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Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

13.0K vistas.  University College London. Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Video: Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Investigación

Neurociencias

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

La combinación de colorantes lipofílicos, In situ</emHibridación>, inmunohistoquímica y la histología

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en larvas lamprea de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación usando sondas de oligonucleótidos en Cerebro paraformaldehído-prefijo de ratas con síndrome de serotonina

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory Receptor Neurons (ORNs) housed in hair-like structures, called chemosensilla, of the antennae. On the ORNs&#39; membranes, Odorant Receptors (ORs) are believed to be involved in odor coding. Thus, being able to identify genes localized to the ORNs is necessary to recognize OR genes, and provides a fundamental basis for further functional in situ studies. The RNA expression levels of specific ORs in insect antennae are very low, and preserving insect tissue for histology is challenging. Thus, it is difficult to localize an OR to a specific type of sensilla using RNA in situ hybridization. In this paper, a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for lowly expressed OR genes of insects, is introduced. In addition, a specific OR gene was identified by conducting double-color fluorescent in situ hybridization experiments using a co-expressing receptor gene, Orco, as a marker.

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

This paper describes a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for low-level expressed Odorant Receptor (OR) genes, as well as other genes, in insect antennae using digoxigenin (DIG)-labeled or biotin-labeled probes.

Localización de Genes Receptor Odorante en Antenas Locustinas por RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...