Work in the authors' laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, "Ideas" Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.

Ethik-Statement: Maushaltung und Handhabung sind in Übereinstimmung mit dem britischen Home Office Vorschriften und UCL Ethikkommission Leitlinien, die Einhaltung der Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 des Vereinigten Königreichs und der Änderung der Verordnungen 2012. HINWEIS: Alle Lösungen sollten mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) hergestellt werden - behandelte Wasser restliche RNase zu zerstören. Für DEPC Behandlung, fügen DEPC (1 ml pro Liter), kräftig schütteln, bis alle DEPC Globuli verschwunden sind dann im Autoklaven die DEPC abzubauen. 1. RNA-Sondensynthese <ol><li> ACHTUNG: Bei der Formamid Handhabung Persönliche Schutzausrüstung (PSA) und ein Sicherheitsgehäuse. Bereiten Hybridisierungspuffer: DEPC-behandeltem deionisiertes Wasser mit 50% (v / v) entionisiertes Formamid, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH 2 PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml Hefe-tRNA, 1 × Denhardt-solution und 10% w / v Dextran-Sulfat. </li><li> Wählen Sie eine DNA-Klon, der die cDNA-Sequenz des Gens von Interesse in einem Plasmid mit RNA Polymerase-Promotoren enthält. Für dieses Beispiel verwenden , um ein pCMV-SPORT6 Klon, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), mit T7 und SP6 - RNA - Polymerase - Promotoren für Aspa (Supplementary Abbildung 1). </li><li> Bereiten linearisierte Plasmid-DNA als Matrize. <ol><li> Wachsen, um die DNA-Klons, extrahieren, die das Plasmid mit einem Plasmid Purification Kit kleinräumige gemäß dem Protokoll des Herstellers und die Sequenz mit dem T7 und Sp6 universellen Primer. </li><li> Digest 1.020 ug Plasmid-DNA mit einem Restriktionsenzym, das am 5&#39;-Ende des Sense-Strangs der cDNA schneidet. Für dieses Beispiel verwenden 100 Einheiten Sal I das pCMV-SPORT6- Aspa Plasmid zu verdauen. Inkubieren für 1,5 Stunden bei 37 ° C </li><li> Führen Sie einen kleinen aliquoten auf einem Agarose-Gel zu überprüfen, dass das Plasmid vollständig linearisiert. </li></ol></li><li> Reinige dielinearisierten Plasmids mit Phenol-Chloroform verwendet. <ol><li> Hinzufügen 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, ein Volumen von 10 mM Tris HCl (pH 8,0) - äquilibriert Phenol und einem Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (IAA) (24: 1). </li><li> Zentrifuge bei 16.000 × g für 1 min bei RT (20 - 25 ° C, RT) und Extrahieren obere wässrige Phase. </li><li> Hinzufügen einem Volumen Chloroform / IAA, Zentrifuge bei 16.000 × g für 1 min und die obere wässrige Phase zu extrahieren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.4.3. </li><li> Fügen Sie 2 Volumen Ethanol und lassen bei -20 o C für 1 h oder O / N. </li><li> Zentrifuge bei 16.000 × g bei 4 ° C für 10 min. Überstand verwerfen. </li><li> Waschen des Pellets mit 70% kaltem Ethanol und resuspendieren in approximativ 1 ug cDNA pro 2,5 &amp; mgr; l in TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5). </li></ol></li><li> Synthesize die beiden Sonden ein, markiert mit Digoxigenin (DIG) und die andere mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC). <ol><li> Wählen Sie die entsprechende RNA-Polymerase die anti-se zu machennse Sonde (komplementär zu der Ziel-mRNA). In diesem Beispiel verwenden T7 RNA Polymerase Aspa Sonde zu machen. </li><li> Bereiten Sie in vitro Transkriptionsreaktion: add 1 ug linearisierter DNA, 4,0 ul 5 x Transkriptionspuffer, 6,0 ul 100 mM DTT, 2,0 ul 10x DIG oder FITC RNA Markierungsmischung enthält dNTPs, 1 ul RNase - Inhibitor und 20 bis 40 Einheiten der RNA-Polymerase; machen das endgültige Volumen von bis zu 20 &amp; mgr; l mit DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> Inkubieren bei 37 o C für 1,5 Std. </li></ol></li><li> Run1 ul der Transkriptionsreaktion auf einem 1,0% igen Agarose-Gel zu überprüfen, ob die Reaktion gearbeitet hat. Das Gel sollte die lineare Vorlage und eine helle Band der Sonde zeigen. </li><li> Machen Sie das Volumen bis zu 100 &amp; mgr; l mit Hybridisierungspuffer und Speichern von 10 ul Aliquots bei -80 ° C. </li></ol> 2. Perfusions, Fixierung und Gewebeentnahme <ol><li> ACHTUNG: Beim Umgang mit Paraformaldehyd (PFA), sowohl feste als auchwässrige, tragen PPE und ein Sicherheitsgehäuse. Bereiten Formaldehydlösung durch Lösen von 4% (w / v) PFA in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Lösung unter Verwendung von Wärme (55 ° C). Filtern Sie die Formaldehydlösung mit Filterpapier. </li><li> Bereiten Saccharoselösung durch Auflösen von 20% (w / v) Saccharose in destilliertem Wasser und mit 0,1% (v / v) DEPC-Lösung. Lassen Sie O / N bei RT mit einem losen Deckel und dann Autoklaven. </li><li> Unheilbar betäuben eine Maus durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (50 mg / kg). Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch Zehe Prise und das Fehlen von Entzugs Reflex zeigt tiefe Narkose. </li><li> Sobald die Maus unter tiefer Narkose ist, machen einen Schnitt unterhalb des Brustkorbs und durch den Brustkorb auf beiden Seiten abgeschnitten, sie heben das Herz aussetzen. </li><li> Legen Sie eine 25-G-Nadel in den linken Ventrikel des Herzens. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof des Herzens. </li><li> Perfuse das Tier mit 20 ml PBS und dann 40 ml Formaldehydlösung. Für P30 und älterMäuse, verwenden Sie eine Perfusions-Rate von 12 ml / min, aber für jüngere Tiere verwenden, um eine niedrigere Rate (7 bis 10 ml / min). </li><li> Präparieren Sie das Gehirn. <ol><li> Sever mit der Maus den Kopf mit einer chirurgischen Schere durch einen Schnitt posterior von den Ohren zu machen. Machen Sie einen Schwanzmittelschnitt in der Haut und arbeiten rostral die Haut von Schädel zu entfernen. </li><li> Ausgehend von der Schwanzteil, schneiden durch die Oberseite des Schädels entlang der Mittellinie und zwischen den Augen mit Iris Schere. Entfernen Sie die parietalen und frontalen Knochenplatten von einer Seite einer Knochenplatte Kippen jedes Mal, und schnappen sie mit einer Pinzette aus. </li><li> Kippen Sie vorsichtig das Gehirn nach oben von dem vorderen Teil mit einer Pinzette und schneiden Sie die Sehnerven und andere Hirnnerven. Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel. </li></ol></li><li> Legen Sie das Gehirn in eine Maus koronalen Hirn Matrix. Schneiden Sie das Gehirn in 3 etwa 4 mm Stücke mit einer Feder Rasierklinge. </li><li> Übertragen Sie die Scheiben in 4% PFA-Lösung und Inkubation O / N bei 4 ° C. </li><li> Transfer GehirnScheiben bis 20% Saccharoselösung DEPC-behandeltem und O / N bei 4 ° C inkubieren </li><li> Legen Sie jedes Gehirn Scheibe in einem trockenen cryomould, umgeben mit optimale Schnitttemperatur (OAT) Medium und frieren auf Trockeneis. Bei -80 ° C. </li></ol> 3. Kryoschneiden <ol><li> Cut 15 &amp; mgr; m Abschnitte von gefrorenem Gewebe in einem Kryostaten und sammeln die Schnitte auf Objektträger. Bei Bedarf benetzen die Abschnitte mit DEPC-PBS und glätten sie mit einem feinen Pinsel. </li><li> Lassen Sie die Folien für etwa 1 Stunde trocknen, um sicherzustellen, dass das Gewebe auf dem Objektträger anhaftet. </li></ol> 4. Die Hybridisierung <ol><li> Vorbereitung 65 ° C Waschpuffer: 150 mM NaCl, 15 mM Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1x saline Natriumcitrat), 50% (v / v) Formamid und 0,1% (v / v) Tween- 20. </li><li> Bereiten MABT Puffer: 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Tween-20, pH 7,5. </li><li> Verdünnen Sie die beiden Sonden (DIG-markierten und FITC-labelled) 1 / 1.000 in Hybridisierungspuffer vorgewärmt auf 65 ° C und gut mischen. </li><li> Bewerben um 300 ul Hybridisierungsmischung auf jeder Folie, coverslipwith Ofen gebacken (200 ° C) Deck und Inkubation O / N bei 65 ° C in einer befeuchteten Kammer. </li><li> Die Objektträger in eine Coplin-Gefäß vorgewärmten Waschpuffer enthält. Waschen der Objektträger 30 min zweimal bei 65 ° C mit Waschpuffer. </li><li> Waschen Sie die Objektträger für 10 Minuten dreimal mit MABT bei RT. </li></ol> 5. Visualisierung des FITC-Sonde <ol><li> Vorbereitung ISH Blockierungspuffer: MABT mit 2% Blockierungsreagenz und 10% Hitze-inaktiviertes Schafserum. </li><li> Optional: eine hydrophobe Stift Kreise um die Gewebeabschnitte auf der Folie zeichnen das Volumen der Antikörperlösungen zu reduzieren. </li><li> Inkubieren der Objektträger für 1 h bei RT mit ISH-Puffer in einer befeuchteten Kammer blockiert. </li><li> Inkubieren Sie die Dias O / N bei 4 ° C mit einem Meerrettich-Peroxidase (POD) - Konjugatd anti-FITC-Antikörper Blockierungspuffer 1/500 (v / v) in ISH verdünnt. </li><li> Legen Sie die Folien in eine Coplin Gefäß mit PBS mit 0,1% (v / v) Tween-20 (PBST). 3 x waschen für 10 min in PBST und ersetzen mit frischem PBST jedes Mal. </li><li> Unmittelbar vor dem Gebrauch bereiten die fluoreszierende Tyramidesters durch 100-mal in die Amplification Verdünnungsmittel verdünnt wird. Für dieses Beispiel verwenden FITC-Tyramidesters. </li><li> Fügen Sie diese auf den Schlitten und lassen für 10 min bei RT. </li><li> Legen Sie die Folien in eine Glasküvette und waschen 3 Mal in PBST 10 min. </li></ol> 6. Visualisierung der DIG-Sonde <ol><li> Bereiten 0,1 M Tris- HCl pH-Wert 8,2. </li><li> Inkubieren der Objektträger mit ISH Blockierungspuffer für 1 Stunde bei RT. </li><li> Inkubieren der Objektträger O / N bei 4 ° C mit einer alkalischen Phosphatase (AP) -konjugiertem anti-DIG-Antikörper, verdünnt 1 / 1.500 (v / v) in ISH Blockierungspuffer. </li><li> Waschen Sie mit MABT für 10 Minuten dreimal. </li><li> Wasche zweimal mit 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 für 5 min bei RT. </li><li>Unmittelbar vor der Verwendung vorbereitet Fast Red-Lösung, indem die Tabletten in 0,1 M Tris pH 8,2 gelöst wird. Filtern der Lösung durch einen 0,22 um-Filter. </li><li> Inkubieren der Objektträger bei 37 ° C mit Fast Red-Lösung in einer befeuchteten Kammer. Da die Zeit für eine optimale Entwicklung variiert, überprüfen Sie die Dias regelmäßig mit einem Fluoreszenzmikroskop die Bildung von Niederschlag zu überwachen. Für dieses Beispiel Die Reaktion nach 2 - 3 Stunden. </li><li> Waschen mit PBST 10 min dreimal. </li></ol> 7. Immunhistochemie <ol><li> Bereiten IHC Blockierungspuffer: 10% (v / v) Serum (von einer anderen Spezies zu primärem Antikörper Host) in PBST. </li><li> Inkubiere Objektträger mit IHC-Puffer für 1 Stunde bei RT in einer feuchten Kammer blockiert. </li><li> Bereiten primäre Antikörper: den primären Antikörper bei einer geeigneten Verdünnung in PBST mit 5% Serum verdünnt (von einer anderen Spezies zu primärem Antikörper Host). Für dieses Beispiel verwenden, um ein Kaninchen-Anti-Olig2 Antikörper bei 1/400 (v / v) Verdünnung. </li><li>Inkubieren in der primären Antikörperlösung bei 4 ° CO / N. </li><li> Waschen mit PBST 10 min dreimal. </li><li> Bereiten sekundären Antikörper: Verdünnen ein Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper bei einer geeigneten Verdünnung in PBST mit 5% (v / v) Serum (von einer anderen Spezies zu primärem Antikörper host) und 0,1% (v / v) Hoechst 33258. Für dieses Beispiel Gebrauch ein Esel-anti-Kaninchen-Alexa647 sekundären Antikörper bei 1 / 1,000 (v / v) Verdünnung. </li><li> Inkubieren in der sekundären Antikörperlösung bei RT für 1 Std. </li><li> Waschen mit PBST 10 min dreimal. </li></ol> 8. Montage <ol><li> Trocknen teilweise die Folien bei RT und Halterung mit einem Fluoreszenz-Eindeckmedium. Lassen Sie die Folien Bild, um zu trocknen und dann in einem konfokalen Mikroskop unter 10X, 20X und 63X Ziele unter Verwendung von 4 verschiedenen Kanälen mit den folgenden Anregungswellenlängen: 570 nm für Fast Rot, 488 nm für FITC, 647 nm für Olig2 Immunmarkierung und 350 nm für Hoechst . </li></ol>

<ol>
	<li>Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+as+intrinsic+components+of+non-cell-autonomous+neurodegenerative+disease.">Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).</li><li>Baslow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylaspartate+in+the+vertebrate+brain:+metabolism+and+function.">N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.</a> Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).</li><li>Hoshino, H., Kubota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canavan+disease:+clinical+features+and+recent+advances+in+research.">Canavan disease: clinical features and recent advances in research.</a> Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).</li><li>Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+human+aspartoacylase+cDNA+and+a+common+missense+mutation+in+Canavan+disease.">Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease.</a> Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).</li><li>Divry, P., Mathieu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+deficiency+and+N-acetylaspartic+aciduria+in+patients+with+Canavan+disease.">Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease.</a> Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).</li><li>Bartalini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+diagnosis+of+Canavan+disease.">Biochemical diagnosis of Canavan disease.</a> Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).</li><li>Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylaspartate+in+the+CNS:+from+neurodiagnostics+to+neurobiology.">N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology.</a> Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).</li><li>D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence+of+N-acetylaspartate+amidohydrolase+(aminoacylase+II)+in+the+developing+rat.">The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat.</a> J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).</li><li>Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+regional+distribution+of+aspartoacylase+in+rat+brain+tissue.">Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue.</a> J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).</li><li>Sommer, A., Sass, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+aspartoacylase+(ASPA)+and+Canavan.">Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan.</a> Gene. 505 (2), 206-210 (2012).</li><li>Klugmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+distribution+of+aspartoacylase+in+the+postnatal+rat+brain.">Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain.</a> Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).</li><li>Madhavarao, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+aspartoacylase+in+the+rat+central+nervous+system.">Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system.</a> J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).</li><li>Hershfield, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+is+a+regulated+nuclear-cytoplasmic+enzyme.">Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme.</a> Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).</li><li>Moffett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+aspartoacylase+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system.</a> Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).</li><li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+is+restricted+primarily+to+myelin+synthesizing+cells+in+the+CNS:+therapeutic+implications+for+Canavan+disease.">Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease.</a> Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).</li><li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+increase+of+aspartoacylase+in+oligodendrocytes+parallels+CNS+myelination.">Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination.</a> Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Dieses Protokoll stellt eine Schritt- für -Schritt - Verfahren für ein Doppel RNA in situ Hybridisierung von Immunfärbung gefolgt. Wir haben dieses Protokoll verwendet , um zu bestätigen , dass Aspa in reifen Oligodendrozyten in mehreren Bereichen des Gehirns exprimiert wird . Diese mehrstufigen Verfahren hat viele potenzielle Gefahren, die Empfindlichkeit beeinflussen können und sollten vermieden werden. Zuerst werden alle Lösungen und Speicherpuffer für die Transkr...

Gliazellen, die die am häufigsten vorkommenden Zellen im zentralen Nervensystem (ZNS) sind, umfassen Oligodendrozyten (die myelinisierenden Zellen von ZNS), Oligodendrozyten Vorläufern (OPs, die auch als &quot;NG2 cells&quot; bekannt), Astrozyten und Mikroglia. Es gibt in den Funktionen von Gliazellen und ihre mögliche Rolle bei neurologischen Krankheiten 1 wachsendes Interesse. Zum Beispiel Canavan - Krankheit (CD) ist eine erbliche früh in der Kindheit beginnen neurodegenerative Erkrankung mit spongiformen Leukodystrophie und einem fortschreitenden Verlust von Nervenzellen, die zum Tode führen in der Regel vor 10 Jahren 2,3. Mutationen im Aspartoacyclase (ASPA) Gen , das drastisch führen zu einer verminderten Aktivität ASPA 4 in CD identifiziert worden. ASPA ist ein Enzym , das Deacetylierung von N-Acetylaspartat (NAA) Katalysieren, ein Molekül stark in Gehirn konzentriert, Erzeugen Acetat und Aspartat 5-7. Viele CD-Patienten zeigen eine höhere NAA wegen des Mangels an ASPA acvität. Einige Studien spekulieren , dass NAA abgeleitete Acetat eine wichtige Quelle von Fettsäuren / Lipiden im Gehirn während der Entwicklung sein könnte und CD können sich aus Myelinsynthese vermindert während durch den Ausfall von NAA verursacht Entwicklung 3,5,6 abgebaut werden. ASPA wird vorwiegend in der Niere, der Leber und der weißen Substanz des Gehirns und die wichtige Rolle der ASPA in CD gegeben, die zelluläre Expression dieses Enzyms im Gehirn wurde von mehreren Labors untersucht worden. Mit Blick auf ASPA enzymatische Aktivität im Gehirn gefunden früheren Studien , dass die Zunahme in ASPA Aktivität während der Entwicklung des Gehirns verläuft parallel den zeitlichen Verlauf der Myelinisierung 8-10. Auf zellulärer Ebene, Assays für enzymatische Aktivität sowie in situ - Hybridisierung (ISH) und Immunhistochemie (IHC) Analysen legen nahe , dass ASPA hauptsächlich in Oligodendrozyten im Gehirn exprimiert wird , aber nicht in Neuronen oder Astrozyten 11-16. Einige Studien fanden heraus, dass ASPA könnte auchwerden in Mikroglia im ZNS 12,14 ausgedrückt. Bisher Daten über ASPA Ausdruck in OPs sind begrenzt. Nach einer aktuellen Studie , in Transkriptomen verschiedener Zelltypen in der Maus Hirnrinde einschließlich Neuronen, Astrozyten, OPs, neugebildeten Oligodendrozyten, myelinisierenden Oligodendrozyten, Mikroglia, Endothelzellen und Perizyten durch RNA - Sequenzierung analysiert wurden 17 wird ASPA ausschließlich in Oligodendrozyten exprimierten insbesondere Oligodendrozyten in myelinisierende (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Trotz dieser Studien über ASPA Expressionsmuster im Gehirn, noch eine Reihe von Unsicherheiten. Verschiedene Techniken können zum Studium von Genexpressionsmustern verwendet werden. IHC ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Bestimmung der Funktionsprodukt Erfassen (dh Protein) einer Genexpression in Gewebeschnitten. Trotz seiner großen Nutzen, diese Technik hat seine Grenzen, deren Anwendung und Spezifität Thema t sindo der Verfügbarkeit und Spezifität des Antikörpers erforderlich. Im Vergleich dazu hat ISH den Vorteil, dass sie die Expression eines beliebigen Gens auf mRNA-Ebene zu offenbaren. mehrere Sonden kann es jedoch technisch schwierig zu verwenden, die gleichzeitig um eine Gen-Expression zu speziellen Zelltypen zu lokalisieren. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll RNA Doppel Fluoreszenz in situ - Hybridisierung mit Fluoreszenzimmunmarkierung eines Proteins verbinden. Wir haben diese Reihe von Techniken verwendet , um die Expressionsmuster von Aspa in Maushirn zu untersuchen. Dieses Verfahren ermöglicht die genaue Untersuchung der Genexpression unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="460">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">QIAprep&#174; Miniprep</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:111px;">27104</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F9037</td>
			<td style="width:131px;">for ISH blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S3014</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T1503</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:111px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">20252.290</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:111px;">Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S8282</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:111px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">30435</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Yeast tRNA</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">10109495001</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">50x Denhardt&#39;s solution</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">750018</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Dextran sulfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D8906</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Aspa cDNA clone</td>
			<td style="width:111px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:111px;">IRAVp968C0654D</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">SalI</td>
			<td style="width:111px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:111px;">R0138</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S2889</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Equilibrated phenol</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P4557</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Chloroform</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2432</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:111px;">Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">496200</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Ethanol</td>
			<td style="width:111px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">20821.321</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">P4074</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Transcription buffer</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">P118B</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">100mM DTT</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">P117B</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">UTP-DIG NTP mix</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11277073910</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Rnasin</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">N251B</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6148</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Filter paper</td>
			<td style="width:111px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">005479470</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Sucrose</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">59378</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D5758</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Pentobarbitone</td>
			<td style="width:111px;">Animalcare Ltd</td>
			<td style="width:111px;">BN43054</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">15922</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">25 gauge needle</td>
			<td style="width:111px;">Terumo</td>
			<td style="width:111px;">300600</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:111px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:111px;">Cole-Parmer Instrument Co. Ltd</td>
			<td style="width:111px;">WZ-07522-30</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Iris scissors</td>
			<td style="width:111px;">Weiss</td>
			<td style="width:111px;">103227</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">No.2 tweezers</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">500230</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Coronal Brain Matrix</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">RBMS-200C</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Razor blade</td>
			<td style="width:111px;">Personna Medical</td>
			<td style="width:111px;">PERS60-0138</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">OCT medium</td>
			<td style="width:111px;">Tissue tek</td>
			<td style="width:111px;">4583</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Cryostat/microtome</td>
			<td style="width:111px;">Bright</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Superfrost plus slides</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">J1800AMNZ</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S4641</td>
			<td style="width:131px;">for 65&#176;C wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Formamide</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">F7503</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Tween-20</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1379</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Coverslips</td>
			<td style="width:111px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">631-0146</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Coplin Jar</td>
			<td style="width:111px;">Smith Scientific Ltd</td>
			<td style="width:111px;">2959</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11096176001</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:111px;">Heat-inactivated sheep serum</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S2263</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Hydrophobic pen</td>
			<td style="width:111px;">Cosmo Bio</td>
			<td style="width:111px;">DAI-PAP-S</td>
			<td style="width:131px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:111px;">&#945;-FITC POD-conjugated antibody</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11426346910</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:111px;">TSA&#8482; Plus Fluorescein System</td>
			<td style="width:111px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:111px;">NEL741001KT</td>
			<td style="width:131px;">1:1500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">&#945;-DIG AP-conjugated</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11093274910</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Fast red tablets</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11496549001</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">.22&#181;M filter</td>
			<td style="width:111px;">Millex</td>
			<td style="width:111px;">SLGP033RS</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">&#945;-Olig2 Rabbit antbody</td>
			<td style="width:111px;">Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AB9610</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:111px;">Alexa Fluor&#174; 647-conjugated &#945;-rabbit antibody</td>
			<td style="width:111px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">A-31573</td>
			<td style="width:131px;">1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">bisBenzimide H 33258</td>
			<td style="width:111px;">sigma</td>
			<td style="width:111px;">B2883</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:111px;">Dako</td>
			<td style="width:111px;">S3023</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:111px;">Leica SP2 confocal microscope</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining double fluorescence in situ hybridization with immunolabelling for detection of the expression of three genes in mouse brain sections

Nachweis der Genexpression in verschiedenen Arten von Gehirnzellen , beispielsweise Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia - Vorläufern kann durch das Fehlen von spezifischen primären oder sekundären Antikörper für Immunfärbungs behindert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll , die Expression von drei verschiedenen Genen im gleichen Hirnschnitt mit doppelseitigem Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit zwei genspezifischen Sonden durch Immunfärbung mit einem Antikörper , der eine hohe Spezifität gegenüber dem durch ein drittes Gen kodierte Protein gerichtet ist, gefolgt zu detektieren. Die Aspartoacyclase (ASPA) Gen, Mutationen , von denen einer seltenen menschlichen Erkrankung der weißen Substanz führen kann - Canavan Krankheit - Es wird angenommen , in Oligodendrozyten und Mikroglia exprimiert werden , aber nicht in Astrozyten und Neuronen. Allerdings hat die genaue Expressionsmuster von ASPA im Gehirn noch etabliert werden. Dieses Protokoll hat uns erlaubt, zu bestimmen, dass ASPA in einer Untergruppe von reifen Oligodendrozyten a ausgedrückt wirdnd sie kann allgemein auf einen weiten Bereich von Genexpressionsmuster Studien angewendet werden.

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren für eine ISH Doppelfluoreszenz gefolgt von Immunmarkierung in Mausgehirnschnitte. Eine kurze Beschreibung dieses Protokolls ist in Abbildung 1. Der erste Schritt gezeigt Sonden synthetisieren war spezifisch für Aspa und MBP (myelin basic protein). Um zu überprüfen, dass die Sonden synthetisiert worden war, ein kleines Aliquot jeder Reaktion wurde auf einem Agarosegel laufen gelassen. Das schwache lineare Templ...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections at JoVE.com

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

13.0K Aufrufe.  University College London. Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Serie: Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Forschung

Neurowissenschaften

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Komplette Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protokoll für spätere Wholemount<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisierung in Larven Seeneunauge

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Schnelle<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidsonden auf Paraformaldehyd-Präfix Gehirn von Ratten mit Serotonin-Syndrom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory Receptor Neurons (ORNs) housed in hair-like structures, called chemosensilla, of the antennae. On the ORNs&#39; membranes, Odorant Receptors (ORs) are believed to be involved in odor coding. Thus, being able to identify genes localized to the ORNs is necessary to recognize OR genes, and provides a fundamental basis for further functional in situ studies. The RNA expression levels of specific ORs in insect antennae are very low, and preserving insect tissue for histology is challenging. Thus, it is difficult to localize an OR to a specific type of sensilla using RNA in situ hybridization. In this paper, a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for lowly expressed OR genes of insects, is introduced. In addition, a specific OR gene was identified by conducting double-color fluorescent in situ hybridization experiments using a co-expressing receptor gene, Orco, as a marker.

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

This paper describes a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for low-level expressed Odorant Receptor (OR) genes, as well as other genes, in insect antennae using digoxigenin (DIG)-labeled or biotin-labeled probes.

Lokalisierung von Odorant-Rezeptor-Genen in Locust-Antennen durch RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Nachweis der G-Protein-gekoppelten Rezeptorexpression in vagalen afferenten Neuronen der Maus mittels Multiplex-In-situ-Hybridisierung

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...