We thank the Tolker-Nielsen lab for their generous donation of reporter constructs used to develop the screen. We also thank members of the Ryan laboratory for their helpful comments and critical reading of the manuscript. The work of the authors has been supported in part by grants awarded by the Wellcome Trust (WT100204AIA senior fellowship grant to R.P.R. and 093714/Z/10/Z PhD scholarship to K.N.R.).

Not: Saflaştırılmış C-di-GMP raportör plasmidinin klonlama ve başkalaştırma için prosedürler başka 12 tartışılmıştır. C-di-GMP Muhabir P. Tagged GFP 1. Nesil aeruginosa&#39;nın <ol><li> P. tek bir koloni ile lizojeni suyu 5 ml (LB) ortamı aşılamakta aeruginosa 200 rpm&#39;de çalkalanarak bir gece boyunca 37 ° C inkübasyon ve. </li><li> Transferi 2 1 L&#39;lik bir şişe içinde, taze LB ortamında 200 ml, gece boyunca kültürün mi, 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 600 nm (OD 600), şişeden 1 ml numune alma ve (daha önce anlatıldığı gibi 12) bir spektrofotometre kullanılarak incelenmesi ile her 30 dakikada optik yoğunluk izleyin. </li><li> OD 600 0.3 arasında ulaştığında - 0.5, 50 ml konik santrifüj tüpüne kültür 40 ml yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 8000 rpm&#39;de santrifüj hücreleri topak süpernatantı ve r atınbuz soğukluğunda steril, 300 mM sukroz çözeltisi 40 ml hücreleri, e askıya. </li><li> Aşama 1.5&#39;te tarif edilen buz gibi soğuk, steril, 300 mM sukroz çözeltisi, 20 ml yeniden askıya olarak santrifüj hücreleri bir kez Pelet. </li><li> Aşama 1.5&#39;te tarif edilen buz gibi soğuk, steril, 300 mM sukroz çözeltisi 400 ul içinde yeniden askıya olarak santrifüj hücreleri son bir kez Pelet. Not: bu noktada hücre yoğunluğu mililitre başına yaklaşık olarak 1 x 10 11 koloni oluşturan birim (CFU / ml) olması gerekir. </li><li> bunlar elektroporasyon hazır sonra, 30 dakika için, buz üzerinde hücreleri soğutun. </li><li> P. 40 ul 0.2 ug / ul pCdrA :: GFP Cı plazmid 12 çözeltisi 1 ul ekle aeruginosa elektro-kompetan hücreler buz üzerinde önceden soğutulmuş olan bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde yukarıda hazırlanan. süspansiyon karıştırın ve önceden soğutulmuş 2 mm bir elektrot aralığı, elektroporasyon küvetine aktarılır. Not: pCdrA :: GFP </em&gt; C: P. Cı-di-GMP hücre içi seviyesinin bir flüoresan değerini gösterir pUCP22Not-P cdrA -RBSII- GFP (Mut3) -T 0 -T 1, Amp Gm r r, aeruginosa suşları, gelişmiş ve Rybtke ve ark., 12 ile doğrulandı. </li><li> kağıt mendil ile küvetin dışına nem kaldırmak ve Elektroporatör örnek odası ve küvet. 2.5 kV, 25 | iF ve kapasitans ve 200 Ω direnç bir gerilim ile nabız. </li><li> küvet çıkarın ve LB ortamı içinde 1 ml. Daha sonra, steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü hücreleri transferi ve 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> 10 ul, 50 ul (100 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyonda) ampisilin ile desteklenmiş steril LB-agar plakaları üzerine kültürün 100 ul alikotları yayılmış ve bir gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> (Excitati GFP ifade onaylamaktek bir koloni, standart bir GFP kanalı ile bir floresan mikroskobu altında plaka incelenmesi ve çekme ile 485 nm, 520 nm emisyon), 5 mi kilodan aşılanması için aşama 1.1 &#39;de tarif edildiği gibi, gece boyunca inkübe edin. -80 ° C üst boru ve mağaza vida 2 ml 0.5 ml% 50 gliserol ile bir gece boyunca kültür 0.5 ml karıştırın. </li></ol> Aşılama için Starter Kültür 2. Hazırlık <ol><li> İki gün ekran önce, P. plaka aeruginosa&#39;nın den (pCdrA :: GFP Cı plasmid ihtiva eden) -80 LB-agar plakası üzerine Cı stokunun ° yavaşça steril bir aşı kullanılarak plaka üzerinde bakteri yayarak (100 ug / ml bir konsantrasyonda ampisilin ile desteklenmiş) döngü. 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> Tarama akşam önce, P. tek bir koloni aşılamak LB ortamında 10 ml plakadan aeruginosa&#39;dan tu (100 ug / ml bir konsantrasyonda ampisilin ile desteklenmiş)olabilir ve 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de ön-kültür bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Ekranın gün, ayrıca bir OD% 5 LB ile seyreltilerek bir OD daha sonra 1.0 600 ve taze LB ortamı ilk seyreltilmesi ile bir gece boyunca ön kültür bir alt kültür hazırlanması 0.04 (01:25 oranında) 600 . Not: aşılanmış ortam toplam hacmi, test edilecek plakaların sayısına bağlıdır. % 5 LB gerekli konsantrasyona fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile% 100 LB seyreltilmesiyle yapılmıştır. Önemlisi, medya (% 5 LB) pCdrA kurucu aktivasyon :: P. GFP C veriyor aeruginosa. </li><li> bunlar 384 gözlü levhalar içine tevzi edilmeden önce bakteri ortam alışmasına izin oda sıcaklığında 30 dakika için bir manyetik karıştırıcı üzerinde en az bir hızda kültür kabı içine steril bir manyetik karıştırıcı çubuğu ilave edin ve karıştırın. </li></ol> Ihtiva eden 384 çukurlu Plakalar 3. aşılama ve inkübasyonKüçük moleküller Not: Kısırlık ve iyi aseptik teknikler aşağıdaki adımlara büyük önem taşımaktadır. <ol><li> pozitif kontrol (% 100 inhibisyon) hazırlamak için, Aşama 2.3&#39;te elde alt kültürü, 10 ml (en fazla 12 plakaları için yeterli) 20 ul tobramisin sülfat (25 mg / ml) ekleyin ve yavaşça karıştırın. Pipet kuyular A23 içine pozitif kontrol kültürünün 40 ul - P23 (Şekil 2). </li><li> negatif kontrol (% 0 inhibisyon) hazırlamak için, Aşama 2.3&#39;te elde alt kültürü, 10 ml (en fazla 12 plakaları için yeterli) 30 ul dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve yavaşça karıştırın. Pipet kuyu A24, negatif kontrol kültürün 40 ul - P24 (Şekil 2). </li><li> P22 (Şekil 2) - küçük moleküller ile damgalanmış plakalarının her biri için, bir kuyu A1 (Kademe 2.3 anlatılan) ile seyreltildi, gece boyunca kültürün 40 ul hacmi inoküle. Not: Bu, bir sıvı tutucu rob kullanılarak elde edilebilirot. Bakteriyel kültürler heterojen özellikleri, dağıtma sırasında sürekli olarak ortam dağıtılan bakteri tutmak için sürekli ve orta ajitasyon sağlamak için önemlidir. Bunu yapmak için, manyetik dağıtım esnasında adım 2.4 acclimatized kültürü karıştırmaya devam edin. </li><li> bir hava-geçirgen, örtücü bir conta ile plakaları Seal ve 37 ° C de 6 saat inkübe edilir. Not: hava geçirgen mühür 384 kuyuların arasında değişmeyen koşulları sağlamak ve plaka boyunca oksijen geçişlerini potansiyel gelişimini engelleyecek önemlidir. </li></ol> 4. Büyüme (OD 600) ve Hücre içi c-di-GMP Seviye Ölçümü (GFP) <ol><li> Yaklaşık 30 dakika spektrofotometrik ölçümden önce, yoğunlaşmayı önlemek için 37 ° C plaka okuyucu önceden ısıtmak. </li><li> Yavaşça okumadan önce hava geçirgen kapak contası çıkarın. oyuk başına 10 yanıp ayarı ile 600 nm&#39;lik bir dalga boyunda optik yoğunluk ölçme ve0,2 saniyelik bir yerleşme zamanı. </li><li> Floresan ölçüm önce de A24 (negatif kontrol) dayalı bir otomatik kazanç ve odak ayarı yapmak ve% 75 (Şekil 2) kazanç hedef değerini ayarlayın. <ol><li> plaka okuyucu kontrol yazılımından, başlangıç ​​ölçümü tıklayın ve &#39;tıklayın&#39; Odak ve Kazanç Ayarı / Plate kimlikleri &#39;&#39; sekmesine gidin. </li><li> penceresinde sağ tarafta &#39;&#39; Odak Ayarı &#39;&#39; ve &#39;&#39; Kanal A &#39;&#39; seçeneğini seçin. </li><li> &#39;&#39; Kazanç Ayarı &#39;seçip&#39; &#39;iyi seçilmiş&#39; ve &#39;Hedef değeri&#39; &#39;olarak&#39; &#39;75&#39; &#39;yazın. Son olarak, &#39;&#39; Ayarı Başlat &#39;tıklamadan önce plaka düzeni de A24 almak. Ayar yapılır sonra, &#39;&#39; Ölçümü başlatın &#39;üzerine tıklayın. </li><li> kuyu ve bir settli başına 10 yanıp ayarı ile 485/520 nm uyarma / emisyon maxima GFP muhabir floresan ölçmek0.2 saniye ng süresi. </li></ol></li><li> incelenen tüm plakaları verileri toplayın. Not: Veri okumaları otomatik plaka okuyucu kontrol yazılımı tarafından varsayılan olarak kaydedilir. <ol><li> istatistiksel analiz paketini açmak için kontrol yazılımı içinde &quot;Mars&quot; ikonuna tıklayarak gör okumaları. </li><li> analiz için verilere erişmek için ilgi plaka numarasına &quot;çift tıklayarak&quot; verileri almak. </li></ol></li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> yüksek verimli ekranlar için en sık bildirilen kalite ölçütleri olan sağlam z &#39;analizi kullanılarak tahlil tekdüzelik ve tekrarlanabilirlik değerlendirin. Sağlam z &#39;formülü kullanarak hesaplayın: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq1.jpg" /> MAD (Medyan Mutlak Sapma) standart sapmasının tahmini olduğunda, p pozitif kontrol (% 100 inhibisyon) ve n negatif kontrol hem OD 600 ve GFP v (% 0 inhibisyon) &#39;diredilen değerler. Not: ya da daha büyük 0.5&#39;e eşit (her ikisi de OD 600 ve GFP ham veri için hesaplanan) sağlam bir Z &#39;değeri bir yöntemi mükemmel tahlil olarak kabul edilir. </li><li> formül kullanılarak büyüme% &#39;sinin hesaplanması: <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq2.jpg" /> Nerede Xi OD600 Her numunenin tekrarlanan OD 600 değeri iyidir. İnhibisyon% &#39;si OD600&gt; 0, büyüme inhibitörü; % Önleme OD600 &lt;0, büyütme faktörü. </li><li> formül kullanılarak C-di-GMP hücre içi seviyesinin% inhibisyonunu değerlendirmek (keyfi floresan yoğunluğu birimleri değişim hücre yoğunluğundaki değişikliğin düzeltilmesi) <img alt="denklem 3" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq3.jpg" /><img alt="denklem 4" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq4.jpg" /> Nerede Xi GFP Her numunenin tekrarlanan GFP değeri iyidir. İnhibisyon% &#39;si, GFP&gt; 0, c-di-GMP inhibitörü; %# 160; İnhibisyon GFP &lt;0, c-di-GMP destekleyicisi. </li><li> örnekten hesaplanan medyan (ortanca ± 3 MAD), 3 MAD de isabet tespiti için eşik değeri de veri noktaları normal dağılıma varsayarak, her plaka-çıkışları okuyun. Not: Ancak gerekirse ±% 50 inhibisyon kesme daha tekrarlanabilir ve hassas doz tepki deneyleri için seçilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recover+the+lost+art+of+drug+discovery.">Recover the lost art of drug discovery.</a> Nature. 485, 439-440 (2012).</li><li>Caly, D. L., Bellini, D., Walsh, M. A., Dow, J. M., Ryan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Cyclic+di-GMP+Signaling:+A+Strategy+to+Control+Biofilm+Formation?.">Targeting Cyclic di-GMP Signaling: A Strategy to Control Biofilm Formation?.</a> Curr Pharm Design. 21, 12-24 (2015).</li><li>Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+c-di-GMP+signaling+in+bacteria.">Principles of c-di-GMP signaling in bacteria.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 263-273 (2009).</li><li>Ryan, R. P., Tolker-Nielsen, T., Dow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+the+PilZ+don't+work:+effectors+for+cyclic+di-GMP+action+in+bacteria.">When the PilZ don't work: effectors for cyclic di-GMP action in bacteria.</a> Trend Microbiol. 20, 235-242 (2012).</li><li>Romling, U., Galperin, M. Y., Gomelsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP:+the+First+25+Years+of+a+Universal+Bacterial+Second+Messenger.">Cyclic di-GMP: the First 25 Years of a Universal Bacterial Second Messenger.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 77, 1-52 (2013).</li><li> Boyd, C. D., GA, O. '. T. o. o. l. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+Messenger+Regulation+of+Biofilm+Formation:+Breakthroughs+in+Understanding+c-di-GMP+Effector+Systems.">Second Messenger Regulation of Biofilm Formation: Breakthroughs in Understanding c-di-GMP Effector Systems.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 28, 439-462 (2012).</li><li>Ryan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HD-GYP+domain+proteins+regulate+biofilm+formation+and+virulence+in+Pseudomonas+aeruginosa.">HD-GYP domain proteins regulate biofilm formation and virulence in Pseudomonas aeruginosa.</a> Environ Microbiol. 11, 1126-1136 (2009).</li><li>Christensen, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Foreign-Body+Biofilm+Infections+through+Reduction+of+the+Cyclic+Di-GMP+Level+in+the+Bacteria.">Clearance of Pseudomonas aeruginosa Foreign-Body Biofilm Infections through Reduction of the Cyclic Di-GMP Level in the Bacteria.</a> Infection and Immunity. 81, 2705-2713 (2013).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Comm. 5, (2014).</li><li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small+Molecules+That+Antagonize+Diguanylate+Cyclase+Enzymes+To+Inhibit+Biofilm+Formation.">Identification of Small Molecules That Antagonize Diguanylate Cyclase Enzymes To Inhibit Biofilm Formation.</a> Antimicrob Agents Chemother. 56, 5202-5211 (2012).</li><li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecules+inhibiting+diguanylate+cyclases+to+control+bacterial+biofilm+development.">Identification of small molecules inhibiting diguanylate cyclases to control bacterial biofilm development.</a> Biofouling. 30, 17-28 (2014).</li><li>Rybtke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-Based+Reporter+for+Gauging+Cyclic+Di-GMP+Levels+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Fluorescence-Based Reporter for Gauging Cyclic Di-GMP Levels in Pseudomonas aeruginosa.</a> App Environ Microbiol. 78, 5060-5069 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bakteriyel enfeksiyonların tedavisini geliştirmek amacıyla, moleküler bir düzenleyici seviyede bakteriyel davranışını daha iyi anlaşılması için açıktır. Burada açıklanan prosedür manipüle veya bakteriler c-di-GMP hücresel konsantrasyonları ile müdahale potansiyeline sahip küçük moleküller ortaya çıkarmak istiyorsanız mikrobiyolog, biyokimyacı ve klinisyenler için yararlı olacaktır. Yöntem P. c-di-GMP hücresel seviyelerini izlemek için yeni geliştirilen GFP bioreporter kullanır aeruginosa 12. Bu bioreporter önemlisi kültürlendiğinde% 5 LB PBS kullanılan suşunun büyümesini etkileyen için geçerli ve gösterilmiştir. In vivo olarak, c-di-GMP seviyesini değiştiren küçük molekülleri tanımlamak için bir bütün hücre ekranın kullanılması, özellikle Gram-negatif bakterilere yoluyla bakteriyel zarlardan molekülü penetrasyonu hedef bazlı ilaç keşfi büyük zorluklar üstesinden . Önemli bir şekilde, To tahlil 0.5 bugüne kadar tüm ekranlarda gözlendi sürekli yukarıda sağlam z &#39;değeri olarak çok sağlam görünüyor. Inhibe eden ve / veya P. hücre içi c-di-GMP seviyesini geliştirmek küçük moleküllerin sayısı ortaya çıkaracaktır, bu protokol kullanılarak tarama aeruginosa. Ayrıca, bu deney de bakteri öldürücü ya da OD 600 okuması bir azalma ile sonuçlanan bakteriyostatik bileşiklerin belirlenmesi için bir potansiyele sahiptir. protokol bölümünde ele olmasa da, deney hazırlanması için birkaç önemli hususlar vardır. GFP bioreporter bir plazmid dayanmaktadır akılda tutmak hayati önem taşımaktadır. Reporter plazmid P. çok kararlı olduğu bilinmektedir, ancak aeruginosa, bu nedenle, sürekli yeniden sonra kaplama Cı gliserol stokundan ° &#39;den -80 taze kaplama suşlar kullanma ihtiyacı kaybetti ve floresans ekspresyonunu kontrol kritik olabilir. Ekranın boyunca üniform büyüme koşullarını sağlamak için de çok değerlidirBu koşullarda herhangi bir dalgalanma ekranda knock-etkileri olabilir çünkü. Bu medya ve antibiyotikler toplu premade ve ekranın boyunca kullanılmaktadır emin hale içerir. Bakteri kültürleri düzgün bir şekilde (OD 600 okumaları göre) büyüyen değil, bu doğanın en yüksek verimli ekranlar için ortak bir sorundur. Bu etkileri veya tabak içine homojen olmayan bir bakteri kültürü dağıtım kenar bağlı olabilir. Eski için, inkübasyon sırasında kullanılan bir gaz geçirgen conta hayatidir emin. ikincisi, bir kültür hacmi ile sıvı işleyici boru priming birlikte en az üç kez, borunun kendisi ölü hacmi tavsiye edilmektedir. Dağıtım sırasında en az bir hızda manyetik karıştırıcı tutmak için çok önemlidir. izleme ve deney boyunca tutarlı bir büyüme 384 oyuklu plakaların saklanma çok önemlidir birlikte, önlemek için bir durum un neden olabilir inkübasyon sırasında levhalar istiflenmesinibüyüme modelinde bir çarpıklık giden oksijen gradyanlar istedi. Bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır DMSO aracı negatif ilgi suşunun büyümesini etkileyen olmadığından emin olmak için önemlidir. büyüme ile ilişkili bu sorunların çoğu tarama öncesinde ilgi bakteri suşu ile sahte bir ekran yaparak önlenebilir. Cı-di-GMP inhibisyon sonuçları, hücre yoğunluğundaki değişikliğin düzeltilmesi gerekir rasgele floresan yoğunluğu birimleri değişikliği hesaplanır verilen aynı zamanda veri yorumlama yararları göz. Bu akılda farklı matematiksel formüller Bu deneylerde elde edilen veriler çıkışı da dikkate alınmalıdır değerlendirmek. Örneğin, bir bileşik, bir C-di-GMP inhibitörü olarak görünebilir, ancak gerçekte belirlenen isabet ihtiyatlı yorumunu gerektiren büyüme önleyicisi ya da tam tersi olabilir. Bu gelişim ve performansı sırasında dikkat edilmesi gereken birkaç sakıncaları ve sınırlamalar vardıryüksek yayılmalı hücre bazlı bir elek. Örneğin, algılama özellikleri ve potansiyel olarak ekranda kullanılan küçük moleküller etkilenebilir florasan bir sonda kullanarak, hücresel Cı-di-GMP seviyeleri dolaylı ölçüm biyo-muhabir işlevleriyle. Teğetsel konusu hücre bazlı deney, hücre içi c-di-GMP seviyelerindeki değişikliklerin arkasındaki mekanizma ile ilgili herhangi bir bilgi veren bir gerçektir. Bu nedenle, deneylerden elde edilen önemli gözlemler bakterilerde hücre içi c-di-GMP dalgalanmaları ölçmek için &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilmektedir yüksek performanslı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi yaklaşımı kullanarak teyit edilmelidir. Bakteri hücreleri (in vivo) ana bağlamında yetiştirilen Bunun yanı sıra, prosedür, sadece, in vitro büyümüş bakteriler davranışı ile ilgili bilgi sağlar hızla nedeniyle bu ortama faaliyetlerini değiştirin. Ayrıca, GFP bioreporter kullanarak işlem ekranı almaz anlamına gelirbakteri hücrelerinin dikkate fizyolojik durum. Bununla birlikte, iletişim kuralı ekran boyunca ayrı ayrı kuyuların mikroskopik izlenmesi için adapte edilebilir. Hatta bu hususlar ve kısıtlamalarla, bu yüksek verimli bir deney de hücre içi c-di-GMP seviyeleri müdahale edebilen küçük moleküller için sağlam bir ekrandır. pek çok bakteriyel patojenler de dahil olmak üzere bir çok mikrobik tür hücre içi c-di-GMP seviyeleri modülasyonunu karakterize edilmesi için incelenmiştir için, protokol, çeşitli bakteri türlerinin uygulanır ve daha karmaşık olabilir çoklu bakteri modellerinin çalışma genişletilebilir. Deney kolay büyüme koşulları kullanılabilir veya farklı bioreporters kullanarak diğer çıkış almak için adapte edilebilir değiştirerek, diğer bakteri türleri için optimize edilebilir. Farklı inkübasyon süreleri ilgi büyüme aşamasına bağlı olarak uygulanabilir. ölçeklendirme veya through-put artan Ancak, bu importan olduğunu<html> t bakteriler hala plaka hazırlıkları ve okuma-out ölçümler sırasında büyümeye devam edecektir akılda tutulması gereken. Bu nedenle, bu protokol kullanılarak bir seferde 15 plakaların en fazla taranması tavsiye edilmektedir. Ayrıca, birden fazla 384 kuyuları ile plakaları kullanılarak daha fazla optimizasyon gerektiren, düzgün büyümeyi izin vermeyebilir. plakaların sayısını aşağı ölçekleme zaman, el elektronik pipet yerine sıvı taşıma robotu kullanarak aşılamak için daha uygun olabilir. Protokol, anti-biyofilm bileşikler, c-di-GMP sinyalizasyon müdahale göz önüne alındığında, biyofilm dağıtmak küçük moleküller araştırmak için kullanılan olabilir açıktır. protokol aynı zamanda bakteri fizyolojisi çeşitli yönlerini anlamak için redeveloped olabilir. Verilen c-di-GMP sinyal biz onların çalışma mekanizmaları, c-di-GMP sinyalini ihtiyaç olup olmadığını belirlemek için farklı kimyasal uyaranlara belirleyebilir bu protokolü kullanarak bu organizmaların fizyolojileri inceleyerek, çoğu bakteri yaygındır. _content &quot;&gt; Özetle, bu protokol sunulan yaklaşımın sağlamlığı ve çok yönlülük c-di-GMP birçok biyolojik sistemlerde sinyalizasyon kimyasal modülatörlerinin tanımlanmasına yardımcı olacaktır.

klinik olarak önemli antibiyotiklere karşı bakteriyel direnç hızla gelişmesi şu anda dünya çapında sağlık çalışanlarının karşılaştığı temel sorunlardan biridir. Geleneksel antibiyotikler Bu başarısızlık virülans ve hastalığın ilerlemesi 1 katılan bakteriyel süreçler engelleyebilir kimyasal madde için yeni arayışları sürdü. Kullanan böyle bir düzenleyici sistemin hücre içi di-GMP (c-di-GMP) son zamanlarda umut verici geçerlilik 2-4 ile bir hedef haline gelmiştir halkalı ikinci haberci. Küresel ikinci haberci sinyal molekülü antibiyotik direnci, yapışma, biyofilm oluşumu ve hastalık 2-4 gibi birçok fonksiyonlarını düzenler tespit edilmiştir. Artık, bakteriyel hücrede Cı-di-GMP hücresel düzeyde GTP iki molekül GGDEF etki alanı içeren diguanylate siklazlar (KEGM) wh C-di-GMP sentezlenmesi için kullanılmaktadır, böylece sentez ve indirgenme ile kontrol edilir anlaşılmalıdırereas Cı-di-GMP bozulması EAL veya HD-GYP alan ya sahip fosfodiesterazlar (PDE&#39;ler) tarafından katalize edilir ((3 gözden, 5)). Bu alan ihtiva eden proteinler, sıklıkla Cı-di-GMP devir etkinliklerini çevresel veya hücre ipuçları 3,5 ya doğrudan ya da dolaylı olarak düzenlendiğini düşündürmektedir diğer sinyal alanları içerir. Sonuç olarak, c-di-GMP bakteriyel fenotipe değişikliklere farklı çevresel ipuçlarını algılama bağlamak için fonksiyonları sinyal. Cı-di-GMP çeşitli mekanizmalarla 4 transkripsiyon, post-transkripsiyon ve translasyon sonrası seviyesinde bakterilerde düzenleyici etki gösterir. Birçok bakteriyel hücrelerde c-di-GMP önemli bir etkisi biyofilm hücreli yapılar yüzeylerine bağlanmış veya organize hareketli planktonik hücreler ve sesil hücreler arasındaki geçişlerin kontrolünde, özellikle de bakteriyel &#39;yaşam tarzı&#39; ve belirlenmesinde olan 3,5. Genel olarak, yüksek bir gözenekdüşük hücresel düzeyleri pek çok bakteriyel patojenler 3,5 hareketlilikten ve hastalık oluşturma faktörü sentezi teşvik ederken Cı-di-GMP seviyeleri, biyofilm ve sessility ile ilişkilidir. Böylece, c-di-GMP sinyalizasyon çalışmalarının daha ayrıntılı bilgi bakteriyel patojenler biyofilm oluşumu ve virulans engellenmesi için stratejiler göze olabilir. Bu birçok bakteriyel genomları GGDEF, EAL ve / veya HD-GYP etki (örneğin P. aeruginosa 40 proteinleri vardır) ve çoklu etkileyiciler 6,7 ile çok sayıda proteinleri kodlayan verilen yıldırıcı bir iştir. Ancak, bu bile karmaşıklığı ile, son kanıtlar c-di-GMP sinyalini manipüle stratejiler antibiyotiğe dirençli enfeksiyonlar gelişmekte önlemek veya klasik antibiyotik 2 birlikte uygulanması ile bağışıklık sistemi ya da etkin tedaviye onları duyarlı hale birine geliştirilmiş olabileceğini düşündürmektedir. Buna paralel olarak, bu deneysel yapay bir azalma ortaya konmuşturin vitro -grown P. hücre içi c-di-GMP aeruginosa P. ise, biyofilm oluşumunu azalmış ve antimikrobik yatkınlığın artmasına yol açar farelerin peritonal boşluğuna bulunan silikon implantları aeruginosa yedirilerek biyofilm, benzer bir şekilde 8-11 dağıtılabilir. Burada, potansiyel olarak P. hücresel Cı-di-GMP seviyesini modüle küçük moleküller taranması için yüksek verimli, flüoresan bazlı raportör analizini tarif aeruginosa (Şekil 1). Deneme Bulunan: C-di-GMP sentezleme transkripsiyonel Cı-di-GMP-duyarlı cdrA promoteri 12 bağlı olan, daha önce geliştirilmiş GFP raportör kullanılarak, hücresel seviyelerinin ölçülmesi esasına dayanır. Bu protokol, P. raportör yapısının ekspresyonu için bir metodoloji tarif eder Çevrede aeruginosa ırk, levha bileşik hazırlama, biz olarak 384 oyuklu plakalar, büyüme koşulları içine kültür aşılamaVeri toplama, yönetim ve analiz (Şekil 1) ile ilgili ayrıntılar olarak ll. Genel olarak, bu protokol bakterilerde sinyal c-di-GMP hedefleyen yeni bileşikler tespit potansiyel araştırmacıları yardım ve araştırma kullanılmak üzere P. biyolojisini anlamaya yönelik olacak aeruginosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="622">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Lysogeny Broth (Lennox)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">L3022-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Sucrose</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">S0389-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Lysogeny Broth with Agar (Lennox)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">L2897-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">A0166-25G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">G5516-1L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:208px;">Life technologies</td>
			<td style="width:167px;">10010-056</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Tobramycin sulfate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">T1783-100MG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">276855-250ML</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:208px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:167px;">840-208100</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">2 mm gap electroporator cuvette</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:167px;">1652092</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">BioRad GenePulser XCell electroporator</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:167px;">1652662</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Leica Fluorescent Stereomicroscope</td>
			<td style="width:208px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:167px;">MZ16FA</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilise by autoclaving before use)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">Z328952-10EA</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">384-well, white-walled, clear-bottom plates</td>
			<td style="width:208px;">Greiner</td>
			<td style="width:167px;">781098</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Multidrop Combi reagent dispenser</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">5840300</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Multidrop Combi tubing</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">24073290</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">VIAFLO II 16-channel electronic pipette</td>
			<td style="width:208px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">4642</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">100 mL sterile disposable reagent reservoirs</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">12399175</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">AeraSeal air-permeable membranes</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">MKBQ1886</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13)</td>
			<td style="width:208px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:167px;">Pherastar FS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of a high-throughput setup for screening small molecules that modulate c-di-gmp signaling in pseudomonas aeruginosa

Geleneksel bakterilerin antibiyotik direncidir yeni keşfedilen düzenleyici yollardaki yeni ilaç hedeflerini tanımlamak için araştırma girişimleri tahrik etmiştir. İkinci haberci olarak hücre içi siklik di-GMP (c-di-GMP) kullanan düzenleyici sistemlerin hedef böyle bir sınıf vardır. c-di-GMP antibiyotik direnci, biyofilm oluşumu ve virulans dahil süreçleri geniş bir yelpazede düzenleyen davranır hemen hemen tüm bakterileri bulunan bir sinyal molekülüdür. c-di-GMP antibiyotiklere dirençli biyofilm gelişimi kontrol yönlerini sinyalizasyon nasıl anlayış nükleotid veya bu sinyal yollarının bozulması hücresel konsantrasyonlarının değişiklik azaltılmış biyofilm oluşumu veya antibiyotiklere biyofilm artan duyarlılık yol açabilir sayede yaklaşımlar önerilmiştir. Yeşil floresan proteini ekspresyonu Cı-di-GMP tepkimeli yükseltici cdrA kontrolü altındadır (GFP), göre, basit bir yüksek verimli bioreporter protokol açıklarPseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) c-di-GMP hücresel seviyelerinin modüle edilmesi için potansiyele sahip küçük moleküller için hızlı bir şekilde taramak için. Bu basit protokol 48 saat içinde yukarı 3.500 bileşiklerin taranması ve çoklu mikroorganizmalar adapte edilmesi yeteneğine sahiptir.

Burada anlatılan yaklaşım verimli ve başarılı bir 48 saatlik süre içinde 3.500 bileşiklerin ortalama ekrana tek bir araştırmacı sağlar. Yüksek verimli bir tarama protokolü bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de, bir akış şeması tasvir edilmiştir. Mevcut madde sağlamak için, 600 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde potansiyel Cı-di-GMP modüle bileşikler için üstünlüğü beş uyumlu bir bileşik kütüphanesi taranmıştır . Bununla birlikte, deneyde kullanılacak olan, bileşik setleri gibi pek çok ticari olarak temin edilebilir, ilaç benzeri ve ilaçsız vardır. Bu takımlar bakteri odaklı bileşikler ya da rastgele havuza bileşikleri olabilir ama her kütüphane polar fonksiyonel gruplar ve birden fazla stereojenik merkezler sahip Burada filtrelenmiş grubu olarak, atanan fizikokimyasal özellikleri ve karakteristikleri esas olur. Bu protokol, bakteri boyunca bileşikler ile levha, bir antibiyotik pozitif kontrol ve bir DMSO araç içine aşılanırKontrol, Şekil 2&#39;de gösterilen düzenine göre yöntem. 3, tek bir kütüphane plaka ile örneklenen ana tarama sonuçlarını tasvir etmektedir. Örnek OD 600 ve GFP ham veriler, sırasıyla Şekil 3A ve 3B&#39;de gösterilmiştir. Yüksek OD 600 / GFP değerlerine düşük gösteren sıcak (kırmızı) ile renk degrade ısı haritası, soğutmak için (yeşil) renk, iyi değerlerine uygulanmıştır. Isı haritaları düşük OD uzanan bir 3-Renk skalası koşullu biçimlendirme uygulayarak bir tablo yazılımında oluşturulan 600 / GFP Okuması en yüksek OD 600 / GFP okuması kadar. DMSO negatif kontrole göre yüksek değerler, büyüme ve Cı-di-GMP seviyeleri bir promosyon uygun ise DMSO negatif kontrole göre düşük OD 600 ve GFP değerleri, büyüme ve Cı-di-GMP seviyeleri inhibisyonuna karşılık . OD 600 ve GFP ar için sağlam z &#39;değerlerie protokolü (5.1) sağlanan formüle göre hesaplanır. onlar 0.5 (sırasıyla 0.694 ve 0.761) hem de yukarıda olduğu için, deney kalitesi sağlam görüldü ve veriler ayrıca analiz edildi. Büyüme (OD 600) ve hücre içi c-di-GMP seviyesinin (GFP)% İnhibisyon Protokolü (5.2, 5.3) temin formüllerle hesaplanır. Temsili veriler sırasıyla Şekil 4A ve 4B gösterilmiştir. yüksek% inhibisyonuna düşük gösteren sıcak (kırmızı) ile renk degrade ısı haritası, soğutmak için (yeşil) renk, iyi değerlerine uygulanmıştır. Birinci eleme göre ayrı ayrı oyuklanndan% inhibisyon (OD600 / GFP) saçılma grafiğidir Şekil 5A&#39;da çizilen sırasıyla OD 600 ve GFP veri 5B. ±% 50 kesme (noktalı çizgiler ile gösterilmiştir) isabet tespiti için seçilir. Bu cut-off dayalı potansiyel hit kırmızı noktalar ile gösterilir. ilgi çekici bir bileşik iki tür d edilebilirtahlilinden iscerned. Şekil 5B&#39;de belirtilen isabetler potansiyel Cı-di-GMP hücre içi düzeylerini düzenleme yeteneğine sahip olan bileşikler, ise Şekil 5A&#39;da tanımlanan isabetler, bakteriyel büyümeyi inhibe eden bileşiklerdir. İki bileşikler bu deney için Örnek isabetler olarak tespit edilmiştir. Bu bileşik A, potansiyel bir büyüme önleyicisi ve bileşik B, potansiyel bir Cı-di-GMP inhibitörü. Bileşik A, Şekil 3&#39;te de F8 tekabül ve 4 büyümesinde% 72.5 inhibisyon vardı. siklik di- GMP seviyeleri beklenen karşılık gelen önlendi. Bileşik B, Şekil 3 de K3 tekabül 4 ve büyüme herhangi bir değişiklik siklik di- GMP seviyeleri% 61 önlemesine sahiptir. Seçin isabet bileşikleri bundan başka, 2 mM ve iki katlı bir seyreltme serisi üstten konsantrasyonu ile 10 noktalı doz-yanıt yöntemi ile test edildi. IC50 değerleri doz-yanıt dayalı hesaplanıreğrileri (Şekil 6A ve B). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig1.jpg" /> Şekil 1. Genel: P. c-di-GMP Hücresel Seviyeleri modüle Onların Potansiyeli Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur aeruginosa. Bu genel bakış Bu testte kullanılan protokolün adım adım bir temsilini göstermektedir. P. bir bakteri kolonisi aeruginosa LB başlatıcı kültür içinde bir gece boyunca yetiştirilir. Reaktif dağıtıcı kullanılarak, hücreler, seçilen bileşikleri ihtiva eden, 384-gözlü plakalara aşılanır. Plakalar OD 600 ve GFP değerleri ölçülmüştür sonra 6 saat daha kuluçkalanmıştır. Bu okuma-çıkışları, tespit edilebilir c-di-GMP hücresel düzeylerini etkileyen bileşikler kullanılarak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig1large.jpg" target="_blank">Bir görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonu. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig2.jpg" /> . Şekil 2. Testi Tarama Küçük Molekül için kullanılır bir 384-Plate Harita kitaplığı (açık mavi) gelen bileşikler kuyular A1 bölünür - P22. DMSO kuyu A24 eklenir% 1 bir son konsantrasyon ihtiva eden P23 ve &quot;Negatif kontrol&quot; (yeşil) - &quot;Pozitif kontrol&quot; (kırmızı) 50 ug / ml tobramisin sülfat kuyu A23 eklenir ug bir son konsantrasyonda oluşan - P24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54115/54115fig3.jpg" /> Bir 384-iyi Eleme Plate için Şekil 3. Temsilcisi Sonuçlar. Representative ham veri OD 600 (A) ve GFP (B) içindir. Sıcak olan bir renk degrade ısı haritası, (Kırmızı: OD 600 = 0.65 veya GFP = 250.000) soğutmak için (Yeşil: 600 = 0.10 veya GFP = 40,000 OD) yüksek değerlere düşük gösteren renkler, iyi değerlerine uygulanmıştır. DMSO kontrolü göre daha yüksek OD 600 / GFP okumalar var kuyular yeşil olma eğiliminde ise DMSO negatif kontrol alt OD 600 / GFP okumaları akrabası olması kuyular kırmızı olma eğiliminde olacaktır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig3large.jpg" target="_blank">Bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54115/54115fig4.jpg" /> 384 plaka için hesaplanan engelleme yüzdesi Şekil 4. Örnek Sonuçlar. Analiz% Önleme verileri, OD 60 her ikisi de temsil edilir0 (A) ve GFP (B) okumaları. Sıcak olan bir renk degrade ısı haritası, (Kırmızı: OD 600 = -150% veya GFP = -20%) (Yeşil: OD 600 =% 100 veya GFP =% 100) soğutmak için renkler, yüksek inhibisyon değerleri düşük gösteren olmuştur kuyu değerlerine başvurdu. Potansiyel büyüme ve hücre içi engelleyen küçük moleküller, c-di-GMP potansiyel büyüme ve hücre içi c-di-GMP düzeylerini desteklemek, küçük moleküller kırmızı olma eğiliminde ise yeşil olma eğiliminde olacaktır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig4large.jpg" target="_blank">Tıklayınız daha büyük bir versiyonunu görmek için bu rakamın.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54115/54115fig5.jpg" /> Her test Küçük Molekül. Her küçük molekülün Elde Edilen% inhibisyonu (OD600 / GFP) Şekil 5. Temsilcisi Dağılım Arsalar bir nokta ve% inhibisyon dağılımı ile temsil edilirOD 600 (A) ve GFP (B) her biri için okumaları gösterilmiştir. A ±% 50 cut-off isabet belirlenmesi için seçilir. Potansiyel hit kırmızı vurgulanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54115/54115fig6.jpg" /> Bir doz, Şekil 6. Örnek Sonuçları -., Önceki ekranlarından tanımlanan yanıt Deney iki bileşik (potansiyel büyüme inhibitörü A ve potansiyel Cı-di-GMP inhibitörü B) ayrıca 2 üstten bir konsantrasyon ile 10 noktalı doz-yanıt deneyinde test edilir mM ve iki-kat seyreltme serisi. 158 uM ve 193 uM arasında IC50 değerleri, sırasıyla veri dört parametreli bir lojistik fonksiyonun verim ile elde edildi takılması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig6large.jpg" target="_blank">Ple</a>ase bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bu makalede, başarılı antibakteriyel ilaç keşfi ve bileşik testi için yeni bir güçlü bir araç sağlayarak, Pseudomonas aeruginosa siklik di-GMP hücresel seviyelerini işlemek için potansiyel yeteneği küçük moleküllerin büyük kütüphanelerinin taranması amacıyla kurulmuştur yüksek verimli deneyi anlatır.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

establishment-high-throughput-setup-for-screening-small-molecules

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

8.4K Görüntüleme.  University of Dundee.  Bu makalede, başarılı antibakteriyel ilaç keşfi ve bileşik testi için yeni bir güçlü bir araç sağlayarak, Pseudomonas aeruginosa siklik di-GMP hücresel seviyelerini işlemek için potansiyel yeteneği küçük moleküllerin büyük kütüphanelerinin taranması amacıyla kurulmuştur yüksek verimli deneyi anlatır. 

Video: Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Pseudomonas aeruginosa Küçük Koloni Varyant Kültürü ve Aljinat Quantitation

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkilerini Aydınlatacak Kimyasal Bileşiklerin Yüksek Verimli Taranmasını

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler