We thank the Tolker-Nielsen lab for their generous donation of reporter constructs used to develop the screen. We also thank members of the Ryan laboratory for their helpful comments and critical reading of the manuscript. The work of the authors has been supported in part by grants awarded by the Wellcome Trust (WT100204AIA senior fellowship grant to R.P.R. and 093714/Z/10/Z PhD scholarship to K.N.R.).

הערה: נהלי שיבוט וטרנספורמציה של פלסמיד הכתב המטוהר ג-di-GMP הם דנו במקום אחר 12. הדור 1. של GFP Tagged ג-di-GMP Reporter פ זני aeruginosa <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מ&quot;ל של מרק lysogeny (LB) בינוני עם מושבה אחת של פ aeruginosa ו דגירה לילה בשעה 37 ° C עם רועד ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 2 מ&quot;ל של תרבות הלילה לתוך 200 מ&quot;ל של מדיום LB טרי בבקבוק 1 ליטר ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) כל 30 דקות על ידי נטילת דגימה 1 מ&quot;ל מהבקבוק ולבחון באמצעות ספקטרופוטומטר (כמתואר 12 בעבר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר OD 600 מגיע בין 0.3 - 0.5, להציב 40 מ&quot;ל של תרבות לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 8000 עבור 10 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant ו rדואר להשעות את התאים ב 40 מ&quot;ל של קר כקרח, סטרילי, 300 מ&quot;מ סוכרוז פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים פעם שנייה על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 1.5 מחדש להשעות ב 20 מ&quot;ל של תמיסת קרים כקרח, סטרילי, 300 מ&quot;מ סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים בפעם אחרונה על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 1.5 מחדש להשעות ב 400 μl של פתרון קר כקרח, סטרילי, 300 מ&quot;מ סוכרוז. הערה: צפיפות התאים בשלב זה צריכה להיות כ 1 x 10 11 מושבה יחידה להרכיב למיליליטר (CFU / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל את התאים על קרח למשך 30 דקות, לאחר מכן הם מוכנים electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של פתרון 12 פלסמיד C 0.2 מיקרוגרם / μl pCdrA :: GFP 40 μl של פ אלקטרו המוסמכת תאים aeruginosa מוכן לעיל בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל כי כבר מראש מקורר על הקרח. מערבבים את ההשעיה ולהעביר לתוך הפער אלקטרודה מראש צונן, 2 מ&quot;מ, קובט electroporation. הערה: pCdrA :: GFP </em&gt; C: pUCP22Not-P cdrA -RBSII- GFP (Mut3) -T 0 -T 1, Amp r Gm r, אשר נותן ההודעה הניאון של רמת תאיים של c-di-GMP ב פ זני aeruginosa, פותחו ומאומתים על ידי Rybtke et al. 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לחות בחלק החיצוני של קובט עם נייר טישו והמקום קובט לתוך תא מדגם של electroporator. דופק עם מתח של 2.5 kV, קיבול של 25 μF והתנגדות של 200 Ω. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קובט ולהוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום LB. ואז, להעביר את התאים צינור סטרילי 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge ו דגירה של שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים 10 μl, 50 μl ו 100 aliquots μl של התרבות לצלחות סטרילי LB-אגר בתוספת אמפיצילין (בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל), דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר את הביטוי GFP (excitatiעל ב 485 ננומטר, פליטה ב 520 ננומטר) על ידי בחינת הצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ערוץ GFP סטנדרטי פיק מושבה אחת לחסן 5 מיליליטר LB. דגירה לילה כפי שמתואר בשלב 1.1. מערבבים 0.5 מ&quot;ל של תרבות לילה עם 0.5 מ&quot;ל 50% גליצרול בתוך 2 מ&quot;ל בורג הצינור העליון ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. הכנת תרבות Starter עבור חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ימים לפני המסך, צלחת פ זן aeruginosa (המכיל את pCdrA :: פלסמיד C GFP) מ -80 מעלות המניות C לצלחת LB-אגר (בתוספת אמפיצילין בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) על ידי הפצת חיידקים בעדינות על הצלחת באמצעות חיסון סטרילי לוּלָאָה. דגירה את צלחת הלילה ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערב לפני ההקרנה, לחסן מושבה אחת של פ aeruginosa מהצלחת לתוך 10 מ&quot;ל של מדיום LB (בתוספת אמפיצילין בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בתוך tuלהיות דגירה לילה-תרבות טרום ב 37 ° C עם רועד ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של המסך, להכין תת מן מראש תרבות הלילה על ידי דילול זה הראשון עם מדיום LB טרי ל OD 600 של 1.0 ולאחר מכן דילול נוסף עם 5% LB כדי OD 600 של 0.04 (01:25 יחס) . הערה: הנפח הכולל של המדיום המחוסן תלוי במספר הצלחות להיבדק. 5% LB נעשית על ידי דילול 100% LB עם בופר פוספט (PBS) לריכוז הנדרש. חשוב לציין, התקשורת (5% LB) מאפשרת הפעלה מכוננת של pCdrA :: C GFP ב פ aeruginosa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת בר בוחש מגנטי סטרילית לתוך המיכל ומערבבים התרבות במהירות מינימלית על בוחש מגנטי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, המאפשר לחיידקים להתאקלם התקשורת לפני שהם לוותר לתוך 384 גם הצלחות. </li></ol> 3. הרכבת חיסון דגירה של צלחות 384-היטב המכילותמולקולות קטנות הערה: עקרות וטכניקות ספטית טובות הן ערכים חשובים מאוד השלבים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את השליטה חיובי (100% עיכוב), להוסיף 20 סולפט tobramycin μl (25 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עד ​​10 מ&quot;ל (מתאימה עד 12 צלחות) של תת מוכן בשלב 2.3 ומערבבים בעדינות. פיפטה 40 μl של תרבות הבקרה החיובית לתוך בארות A23 - P23 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את הביקורת השלילית (0% עיכוב), להוסיף 30 sulfoxide דימתיל μl (DMSO) עד 10 מ&quot;ל (מתאימה עד 12 צלחות) של תת מוכן בשלב 2.3 ומערבבים בעדינות. פיפטה 40 μl של תרבות הביקורת השלילית לתוך בארות A24 - p24 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל אחת הצלחות חותמת עם מולקולות קטנות, לחסן בהיקף של 40 μl של תרבויות לילה מדולל (המתואר בשלב 2.3) לתוך A1 בארות - P22 (איור 2). הערה: זו יכולה להיות מושגת באמצעות מטפל נוזלי לשדודot. בשל המאפיינים הטרוגנית של תרבויות חיידקים, חשוב לשמור על תסיסה מתמדת ומתונה לשמור חיידקים מופצים באופן עקבי בתקשורת תוך מחלק. כדי לעשות זאת, לשמור על ערבוב התרבות התאקלמה משלב 2.4 מגנטי במהלך מהחלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחות עם חותם חיפוי אווירי חדיר דגירה במשך 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: החותם חדיר-האוויר הוא קריטי כדי לשמור על תנאים משתנים בכל 384 בארות וכדי לעקוף את פיתוח הפוטנציאל של הדרגתיים חמצן על פני הצלחת. </li></ol> מדידת 4. של צמיחה (OD 600) ו תאי ג-di-GMP רמה (GFP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ -30 דקות לפני מדידת spectrophotometric, מראש לחמם את קורא הצלחת ל -37 ° C כדי למנוע התעבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות את חותם כיסוי חדיר-האוויר לפני הקריאה. מדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 600 ננומטר עם הגדרה של 10 הבזקים לכל היטבזמן שיקוע של 0.2 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מדידת קרינה, לעשות רווח אוטומטי וכוונון מוקדי המבוסס על טוב A24 (שליטה שלילית) ולהגדיר את ערך יעד הרווח ב 75% (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתוך תוכנות שליטה קוראת צלחת, לחץ על מדידת התחלה ולחץ על &#39;&#39; פוקוס התאמת הרווח / פלייט מזהה &#39;&#39; כרטיסייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבחירה &#39;&#39; התאמת מוקד &#39;&#39; ו &#39;&#39; &#39;ערוץ&#39; &#39;בצד ימין על החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה &#39;&#39; התאמת רווח &#39;&#39; ו &#39;&#39; נבחר גם &#39;&#39;, ו סוג ב &#39;&#39; 75 &#39;&#39; כ &#39;&#39; ערך יעד &#39;&#39;. לבסוף, לאסוף גם A24 בפריסת הצלחת לפני הלחיצה על &#39;&#39; התחל כוונון &#39;&#39;. לאחר ההתאמה מתבצעת, לחץ על &#39;&#39; התחל מדידה &#39;&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הקרינה מן הכתב GFP תמורת מקסימום עירור / פליטה של ​​485/520 ננומטר עם הגדרה של 10 הבזקים לכל היטב settling זמן של 0.2 שניות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נתונים מכל הלוחות שנבדקו. הערה: קריאות נתונים נשמרות אוטומטית כברירת מחדל על ידי תוכנות שליטה קוראת צלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריאות צפו על ידי לחיצה על סמל &quot;מאדים&quot; בתוך תוכנות שליטה כדי לפתוח את חבילת הניתוח הסטטיסטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר נתונים על ידי &quot;לחיצה כפולה&quot; על מספר לוחית עניין לגשת לנתונים לניתוח. </li></ol></li></ol> ניתוח 5. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את אחידות השחזור של assay באמצעות הניתוח &quot;Z החזק, המהווה את מדדי איכות הנפוצות ביותר שדווחו עבור מסכי תפוקה גבוהה. חישוב z החזק &#39;באמצעות הנוסחא: <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq1.jpg" /> איפה MAD (סטיית מוחלט חציון) היא אומדן של סטיית התקן, p היא הבקרה החיובית (100% עיכוב) ו- n היא השליטה השלילית (עיכוב 0%) הוא 600 OD ו נ GFPalues. הערה: assay עם ערך z &#39;חסון (שחושב הן 600 OD נתונים גולמיים GFP) גדול או שווה ל -0.5 נחשבת כסוג של assay מצוין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב% עיכוב הצמיחה באמצעות הנוסחה: <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq2.jpg" /> איפה Xi OD600 הוא הערך איטרטיבית OD 600 של כל דגימה היטב. % עיכוב OD600&gt; 0, מעכב צמיחה; עיכוב% OD600 &lt;0, מעודד צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את עיכוב% מרמת תאיים של c-di-GMP באמצעות הנוסחא (השינוי ביחידות עוצמת קרינה שרירותית מתוקנים לשינוי צפיפות תאים): <img alt="משוואה 3" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq3.jpg" /><img alt="משוואה 4" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq4.jpg" /> איפה Xi GFP הוא הערך GFP איטרטיבית של כל דגימה היטב. % עיכוב GFP&gt; 0, c-di-GMP מעכב; % &amp;# 160; עיכוב GFP &lt;0, האמרגן ג-di-GMP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר סף לגילוי להיט 3 MAD מן החציון (חציון ± 3 MAD), מחושב מן המדגם גם לקריאה קטנה של כל צלחת, בהנחה של התפלגות נורמלית של נקודות נתונים. הערה: עם זאת, עיכוב ± 50% חתוך ניתן לבחור עבור מבחני מנה תגובה יותר לשחזור מדויק במידת הצורך. </li></ol>

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recover+the+lost+art+of+drug+discovery.">Recover the lost art of drug discovery.</a> Nature. 485, 439-440 (2012).</li><li>Caly, D. L., Bellini, D., Walsh, M. A., Dow, J. M., Ryan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Cyclic+di-GMP+Signaling:+A+Strategy+to+Control+Biofilm+Formation?.">Targeting Cyclic di-GMP Signaling: A Strategy to Control Biofilm Formation?.</a> Curr Pharm Design. 21, 12-24 (2015).</li><li>Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+c-di-GMP+signaling+in+bacteria.">Principles of c-di-GMP signaling in bacteria.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 263-273 (2009).</li><li>Ryan, R. P., Tolker-Nielsen, T., Dow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+the+PilZ+don't+work:+effectors+for+cyclic+di-GMP+action+in+bacteria.">When the PilZ don't work: effectors for cyclic di-GMP action in bacteria.</a> Trend Microbiol. 20, 235-242 (2012).</li><li>Romling, U., Galperin, M. Y., Gomelsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP:+the+First+25+Years+of+a+Universal+Bacterial+Second+Messenger.">Cyclic di-GMP: the First 25 Years of a Universal Bacterial Second Messenger.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 77, 1-52 (2013).</li><li> Boyd, C. D., GA, O. '. T. o. o. l. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+Messenger+Regulation+of+Biofilm+Formation:+Breakthroughs+in+Understanding+c-di-GMP+Effector+Systems.">Second Messenger Regulation of Biofilm Formation: Breakthroughs in Understanding c-di-GMP Effector Systems.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 28, 439-462 (2012).</li><li>Ryan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HD-GYP+domain+proteins+regulate+biofilm+formation+and+virulence+in+Pseudomonas+aeruginosa.">HD-GYP domain proteins regulate biofilm formation and virulence in Pseudomonas aeruginosa.</a> Environ Microbiol. 11, 1126-1136 (2009).</li><li>Christensen, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Foreign-Body+Biofilm+Infections+through+Reduction+of+the+Cyclic+Di-GMP+Level+in+the+Bacteria.">Clearance of Pseudomonas aeruginosa Foreign-Body Biofilm Infections through Reduction of the Cyclic Di-GMP Level in the Bacteria.</a> Infection and Immunity. 81, 2705-2713 (2013).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Comm. 5, (2014).</li><li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small+Molecules+That+Antagonize+Diguanylate+Cyclase+Enzymes+To+Inhibit+Biofilm+Formation.">Identification of Small Molecules That Antagonize Diguanylate Cyclase Enzymes To Inhibit Biofilm Formation.</a> Antimicrob Agents Chemother. 56, 5202-5211 (2012).</li><li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecules+inhibiting+diguanylate+cyclases+to+control+bacterial+biofilm+development.">Identification of small molecules inhibiting diguanylate cyclases to control bacterial biofilm development.</a> Biofouling. 30, 17-28 (2014).</li><li>Rybtke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-Based+Reporter+for+Gauging+Cyclic+Di-GMP+Levels+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Fluorescence-Based Reporter for Gauging Cyclic Di-GMP Levels in Pseudomonas aeruginosa.</a> App Environ Microbiol. 78, 5060-5069 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

על מנת לשפר את הטיפול של זיהומים חיידקיים, ברור כי הבנה טובה יותר של התנהגות חיידקים ברמה הרגולטורית המולקולרית נדרשה. ההליך המתואר כאן יהיה מועיל עבור מיקרוביולוגים, ביוכימאים וקלינאים שרוצים לחשוף מולקולות קטנות כי יש פוטנציאל להשפיע או להפריע ריכוזי הסלולר של c-di-GMP בחיידקים. השיטה משתמשת bioreporter GFP שפותח לאחרונה לעקוב אחר רמות סלולריות של c-di-GMP ב פ aeruginosa 12. bioreporter זה יאומת והראה חשוב לא להשפיע על הצמיחה של הזן משמש כאשר בתרבית 5% LB ב PBS. שימוש מסך כל תא לזהות מולקולות קטנות שמשנה רמות ג-di-GMP in vivo מתגבר על הקשיים הגדולים של גילוי תרופות מבוסס יעד מבחינת חדירת מולקולות דרך הממברנות חיידקי, במיוחד באמצעות אלה של חיידקים גראם שליליים . חשוב לציין, לאהוא assay מופיע מאוד חזק כערך z &#39;חזק באופן עקבי מעל 0.5 נצפה בכל המסכים עד כה. הקרנת שימוש בפרוטוקול זה יגלה מספר מולקולות קטנות המעכבות ו / או לקדם רמות ג-di-GMP תאיים P. aeruginosa. יתר על כן, assay זה גם יש פוטנציאל לזהות bactericidal או תרכובות בקטריו וכתוצאה מכך לירידה-אאוט לקרוא OD 600. למרות שלא נדונו בסעיף הפרוטוקול, ישנם מספר שיקולים חשובים לעריכת הניסוי. זה חיוני לזכור כי bioreporter GFP מבוסס על פלסמיד. למרות פלסמיד הכתב ידוע להיות יציב מאוד פ aeruginosa, זה יכול ללכת לאיבוד אחרי מחדש ציפוי רציף, ומכאן הצורך להשתמש זנים מצופים טרי מתוך -80 ° מניות גליצרול C, ובדיקת ביטוי קרינה היא קריטית. זה גם מאוד יקר כדי לשמור על תנאי צמיחה אחידים על פני המסךשכן תנודות כל בתנאים האמורים עלולה להיות תוצאות-לוואי על המסך. זה יכלול ביצוע מסוים כי תקשורת ואנטיביוטיקה הן תערובת של עוגיות נצווה בשימוש לאורך הקורס של המסך. תרביות חיידקים לא גדל (מבוסס על OD 600 לקריאת פסקים) באופן אחיד הוא בעיה נפוצה עבור מסכי תפוקה הגבוהה ביותר מסוג זה. זה יכול להיות בגלל קצה אפקטים או מחלק תרבות חיידקים הלא הומוגנית לתוך הצלחות. לקבלת לשעבר, מוודא חותם גז חדיר משמש במהלך הדגירה הוא חיוני. בעוד באפשרות השנייה, תחול צינורות מטפל הנוזליים עם נפח של התרבות לפחות שלוש פעמים את הנפח המת של הצינור עצמו מומלץ. זה חיוני כדי לשמור על בוחש מגנטי במהירות מינימלית במהלך מחלק. תוך מעקב ואחסון של 384 גם הצלחות לצמיחה עקבית במהלך הניסויים הוא בעל חשיבות עליונה, מצב שיש להימנע ממנו הוא הערמה של צלחות במהלך הדגירה כפי שהוא יכול לגרום unרציתי הדרגתי חמצן מוביל להטות את דפוס הצמיחה. כמו כן, חשוב להבטיח כי רכב DMSO משמש כביקורת שלילית אינו משפיע צמיחה שלילית של הזן של עניין. רבים של בעיות אלה הקשורים צמיחה יכולים להימנע על ידי ביצוע מסך מדומה עם זן החיידקים של העניין לפני ההקרנה. פרשנות נתונים גם שיקול לגופו בהתחשב בעובדה תוצאות עיכוב c-di-GMP מחושבים על ידי השינוי ביחידות עוצמת הקרינה שרירותית כי יש לתקן לשינוי צפיפות התאים. עם זאת לזכור נוסחאות מתמטיות שונות על מנת להעריך את התפוקה נתונים מניסויים אלה צריך להיות גם נחשב. לדוגמא, תרכובת יכולה להופיע כמעכב ג-di-GMP אבל בעצם להיות מעכב צמיחה או להיפך, שמצריכה פרשנות זהירה של נפילות. ישנם מספר חסרונות ומגבלות כי יש לקחת בחשבון במהלך הפיתוח והביצוע של זהתפוקה גבוהה מבוסס תאי מסך. לדוגמה, פונקציות-הכתב ביו על אמצעי עקיף של הסלולר רמות ג-di-GMP באמצעות בדיקה ניאון שתכונותיו זיהוי עלול להיות מושפע מולקולות קטנות ששימשו מסך. סוגיה משיקה היא העובדה כי assay מבוסס התאים נותן שום מידע לגבי המנגנון עומד מאחורי שינויים ברמות-di-GMP ג התאי. לכן, תצפיות חשובות מניסויים יש לאשר באמצעות גישת ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית בעל ביצועים גבוהים, אשר נחשבת השיטה &quot;-תקן זהב&quot; למדידת תנודות תאיות ג-di-GMP בחיידקים. יתר על כן, ההליך שלנו יכול לספק מידע רק לגבי ההתנהגות של חיידקים הגדלים במבחנה, כמו תאי חיידקיים גדלו בהקשר של המארח (in vivo) מהר לשנות את פעילותם בשל בסביבה זו. יתר על כן, התהליך של שימוש GFP bioreporter אומר המסך אינו לוקחבחשבון את המצב הפיזיולוגי של תאים חיידקיים. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות מותאם ניטור מיקרוסקופי של בארות בודדות במהלך המסך. אפילו עם שיקולים אלה ומגבלות, assay תפוקה גבוהה זה עדיין מסך חזק מולקולות קטנות של מסוגלות להפריע רמות ג-di-GMP תאיים. מאז מינים של חיידקים רבים, כוללים חיידקים פתוגנים רבים נחקרו על מנת לאפיין את האפנון של רמות ג-di-GMP התאיים, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם על מיני חיידקי מגוונת התרחב המחקר של מודלי חיידקי multispecies מורכבים יותר. Assay יכול להיות מותאם בקלות עבור מיני חיידקים אחרים על ידי שינוי תנאי הגידול בשימוש, או יכולים להיות מותאמים לקרוא פלטים אחרים באמצעות bioreporters השונה. פעמי דגירה שונות ניתן ליישם תלוי שלב הצמיחה של עניין. עם זאת, כאשר בגמלון או באמצעות הגדלה-פשוט, היא importan<html> t לזכור כי החיידק עדיין יהיה גדל במהלך הכנות צלחת ומדידות לקריאה החוצה. לכן מומלץ להקרין לכל היותר 15 צלחות בכל פעם, באמצעות פרוטוקול זה. יתר על כן, באמצעות צלחות עם יותר מ 384 בארות לא יכול לאפשר צמיחה אחידה, מחייב אופטימיזציה נוספת. כאשר קנה המידה את מספר צלחות, זה עשוי להיות מתאים יותר כדי לחסן באופן ידני באמצעות פיפטה אלקטרונית במקום רובוט טיפול נוזלי. ברור כי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור מולקולות קטנות לפזר biofilms, בהתחשב בכך תרכובות אנטי biofilm להפריע איתות ג-di-GMP. הפרוטוקול יכול גם להיות ושפץ להבין היבטים שונים של פיזיולוגיה חיידקי. בהתחשב האיתות כי ג-di-GMP נפוצה ברוב החיידקים, על ידי לימוד physiologies של אורגניזמים אלה באמצעות פרוטוקול זה אנו יכולים לזהות גירויים כימיים שונים כדי לקבוע אם או לא מנגנוני המפעילים שלהם דורשים איתות ג-di-GMP. _content &quot;&gt; לסיכום, את האיתנות צדדיות של הגישה המוצגת בפרוטוקול זה יסייע בזיהוי מאפננים כימיים של c-di-GMP איתות במערכות ביולוגיות רבות.

ההתפתחות המהירה של עמידות חיידקים לאנטיביוטיקה נגד חשיבות קלינית היא אחת הדאגות הגדולות כיום בפני אנשי מקצוע בתחום בריאות ברחבי העולם. כשל זה של אנטיביוטיקה מסורתית העלה חיפושים חדשים לצורך עניין כימי שיכול להפריע לתהליכי חיידקים מעורבי התקדמות הארסית ומחלות 1. אחת מערכה רגולציה כך מנצלת את השליח שני תאיים מחזורי di-GMP (c-di-GMP) הפכה לאחרונה יעד עם תוקף הבטיח 2-4. זה כבר נקבע כי מולקולת איתות השליח השנייה הגלובלית הזה מסדיר פונקציות רבות כולל עמידות לאנטיביוטיקה, הדבקה, היווצרות ביופילם ומחלות 2-4. הוא הבין עכשיו ברמה התאית של c-di-GMP של תא החיידק נשלטת בסינתזה והשפלה לפיה שתי מולקולות של GTP משמשים לסנתז ג-di-GMP ידי cyclases diguanylate תחום המכיל GGDEF (DGCs) ש&quot;שereas השפלה c-di-GMP מזורזת על ידי phosphodiesterases (PDEs) שיש בין כאדם EAL או תחום HD-גיפ (הנסקרת ב (3, 5)). חלבונים המכילים תחומים אלה בדרך כלל מכילים תחומי איתות אחרים, דבר המצביעים על כך פעילותם מחזור ג-di-GMP מוסדרת במישרין או בעקיפין על ידי רמזים סביבתיים או הסלולר 3,5. כתוצאה מכך, ג-di-GMP איתות פונקציות לקשר את החישה של רמזים סביבתיים מגוונים שינויי פנוטיפ חיידקים. ג-di-GMP מפעילה השפעה הרגולציה שלה בחיידקים ברמה של שעתוק, שלאחר שעתוק-תרגום פוסט ידי מנגנונים שונים 4. השפעה גדולה של c-di-GMP בתאי חיידקים רבים היא בקביעת חיידקים &#39;אורח חיים&#39;, ובמיוחד, בבקרה של מעברים בין תאי planktonic ניע ותאיים נייחים המחוברים משטחים או מאורגנים במבנים הרבים-תאיים של biofilms 3,5. באופן כללי, הסלולר גבוההרמות של C-di-GMP המשויכים היווצרות ביופילם ו sessility, בעוד שרמות הסלולר נמוכות לעודד תנועתיות וסינתזת גורם ארסי חיידקים פתוגנים רב 3,5. לפיכך, ידע מפורט יותר של אופן הפעולה של איתות ג-di-GMP יכל להרשות לעצמם אסטרטגיות עבור עיכוב של היווצרות ביופילם ו ארסי חיידקים פתוגנים. זוהי משימה מרתיעה בהתחשב בכך שרוב הגנום החיידקים לקודד חלבונים רבים עם GGDEF, EAL ו / או תחומי HD-גיפ (למשל פ aeruginosa למעלה מ -40 חלבונים) ומפעילים מרובים 6,7. עם זאת, גם עם המורכבות הזו, הראיות האחרונות עולה כי אסטרטגיות מניפולציה ג-di-GMP איתות ניתן פותחה כדי גם למנוע זיהומים עמידים לאנטיביוטיקה פיתוח או להפוך אותם רגישים במערכת החיסונית או טיפול יעיל על ידי שיתוף מתן אנטיביוטיקה קלאסי 2. בקנה אחד עם זה, זה כבר בניסוי הראו כי ירידה מלאכותיתc-di-GMP תאיים במבחנה -grown פ aeruginosa מוביל ירד היווצרות ביופילם והגדילה את הרגישות antimicrobials, תוך פ biofilms -developed aeruginosa על שתלי סיליקון, ממוקם חלל הצפק של עכברים, ניתן לפזר באופן דומה 8-11. כאן אנו מתארים assay כתב תפוקה גבוהה, קרינה המבוססת להקרין מולקולות קטנות פוטנציאליים שיכול לווסת את רמות הסלולר ג-di-GMP ב פ aeruginosa (איור 1). Assay הוא מבוסס על מדידת ג-di-GMP רמות הסלולר באמצעות כתב ה- GFP שפותח בעבר שביטויים קשור תעתיק האמרגן ג-di-GMP-תגובת cdrA 12. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה ביטוי לבנות כתב ב פ זן של עניין aeruginosa, הכנת צלחת מתחם, חיסון התרבות לתוך 384 גם צלחות, תנאי גידול, כפי שאנוLL כפי לפרטים בדבר איסוף נתונים, ניהול וניתוח (איור 1). בסך הכל, פרוטוקול זה יסייע לחוקרים פוטנציאל לזהות תרכובות חדשות מיקוד ג-di-GMP איתות חיידקים, לשימוש במחקר מכוון להבנת הביולוגיה של פ aeruginosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="622">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Lysogeny Broth (Lennox)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">L3022-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Sucrose</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">S0389-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Lysogeny Broth with Agar (Lennox)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">L2897-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">A0166-25G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">G5516-1L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:208px;">Life technologies</td>
			<td style="width:167px;">10010-056</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Tobramycin sulfate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">T1783-100MG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">276855-250ML</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:208px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:167px;">840-208100</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">2 mm gap electroporator cuvette</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:167px;">1652092</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">BioRad GenePulser XCell electroporator</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:167px;">1652662</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Leica Fluorescent Stereomicroscope</td>
			<td style="width:208px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:167px;">MZ16FA</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilise by autoclaving before use)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">Z328952-10EA</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">384-well, white-walled, clear-bottom plates</td>
			<td style="width:208px;">Greiner</td>
			<td style="width:167px;">781098</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Multidrop Combi reagent dispenser</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">5840300</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Multidrop Combi tubing</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">24073290</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">VIAFLO II 16-channel electronic pipette</td>
			<td style="width:208px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">4642</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">100 mL sterile disposable reagent reservoirs</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">12399175</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">AeraSeal air-permeable membranes</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">MKBQ1886</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13)</td>
			<td style="width:208px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:167px;">Pherastar FS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of a high-throughput setup for screening small molecules that modulate c-di-gmp signaling in pseudomonas aeruginosa

עמיד חיידקים לאנטיביוטיקה מסורתית העלה ניסיונות מחקר לזהות מטרות תרופה חדשות במסלולים רגולטוריים שהתגלו לאחרונה. מערכות רגולטוריות לנצל di-GMP המחזורית התאית (c-di-GMP) כשליח שני הן משורה אחד כזה של היעד. ג-di-GMP הוא מולקולת איתות למצוא כמעט כל החיידקים שפועל להסדיר פעילות ענפה של תהליכים כולל עמידות לאנטיביוטיקה, היווצרות ביופילם ו ארסיות. ההבנה כיצד c-di-GMP איתות היבטים שולטים של פיתוח biofilm עמיד לאנטיביוטיקה הציעה גישות לפיה שינוי הריכוזים הסלולר של נוקלאוטיד או שיבוש של מסלולי איתות אלו עשויים להוביל להיווצרות ביופילם מופחתת או רגישות מוגברת של biofilms לאנטיביוטיקה. אנו מתארים פרוטוקול bioreporter תפוקה גבוהה פשוט, המבוסס על חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), שביטויים הוא תחת השליטה של אמרגן תגובת c-di-GMP cdrA, להקרין במהירות עבור מולקולות קטנות עם פוטנציאל לווסת רמות הסלולר ג-di-GMP ב Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). פרוטוקול זה פשוט יכול להקרין כלפי מעלה של 3,500 תרכובות תוך 48 שעות ויש לו את היכולת להיות מותאם מיקרואורגניזמים רבים.

הגישה המתוארת כאן מאפשרת לחוקר יחיד ביעילות ובהצלחה מסך ממוצע של 3,500 תרכובות בתוך תקופה של 48 שעות. סקירה כללית של פרוטוקול הקרנת התפוקה הגבוהה מודגמת כמו תרשים זרימה באיור 1. לכתבה הנוכחית, אנו הוקרננו כלל-של-חמש ספרייה מורכבת תואמת עבור תרכובות ויסות ג-di-GMP פוטנציאל בריכוז סופי של 600 מיקרומטר . עם זאת, יש הרבה זמינים מסחריים דמויי סמים ו לא תרופתי כמו סטים מתחמים שיכול לשמש ב assay. ערכות אלה יכולות להיות תרכובות ממוקדות חיידקים או תרכובות נקווים אקראיות אבל כל ספרייה הייתה מושתת תכונות ומאפייני physicochemical מוקצה כגון הערכה הוקרנה כאן, אשר היו קבוצות פונקציונליות קוטב ומרכזי stereogenic מרובה. בפרוטוקול זה, חיידקים הם מחוסנים לתוך הצלחת יחד עם תרכובות, פקד חיובי אנטיביוטיקת רכב DMSOמלא, בהתאם לפריסה שמוצגת באיור 2. איור 3 מתארים את התוצאות של ההקרנה הראשית שהודגמה צלחת ספרייה יחידה. נציג OD 600 ונתוני גלם GFP מוצגים באיור 3A ו 3B, בהתאמה. מפת חום צבע הדרגתית, עם חם (אדום) כדי לקרר (ירוק) צבעי מציין נמוכים לערכים הגבוה OD 600 / GFP, יושמו לערכים היטב. המפות החומות נוצרו בתוך תוכנת גיליון אלקטרונית על ידי החלת עיצוב מותנה בהיקף 3-צבע פורש מן OD הנמוך ביותר 600 / GFP לקריאה החוצה עד OD הגבוהה ביותר 600 / GFP לקריאה החוצה. OD 600 ו- GFP הנמוכים ערכים ביחס הביקורת השלילית DMSO מתאימות עיכוב בגדילת רמות ג-di-GMP בהתאמה, בעוד ערכים גבוהים ביחס הביקורת השלילית DMSO מתאימות קידום בצמיחה ורמות C-di-GMP בהתאמה . הערכים &#39;z החזק 600 OD ו- GFP arדואר מחושב על פי נוסחה שנקבעה בפרוטוקול (5.1). כפי שהם שניהם מעל 0.5 (0.694 ו 0.761 בהתאמה), איכות assay נחשבת חזקה והנתונים נותחו נוסף. עיכוב% של צמיחה (OD 600) ורמת ג-di-GMP התאי (GFP) מחושב על ידי הנוסחות כנקבעות בפרוטוקול (5.2, 5.3). נציג נתונים מוצגים באיור 4 א ו -4 בהתאמה. מפת חום צבע הדרגתית, עם חם (אדום) כדי לקרר (ירוק) צבעי מציין נמוך עיכוב% גבוה, יושמו לערכים היטב. עלילת פיזור של עיכוב% (OD600 / GFP) מבארות פרטניות המבוססות על המסך הראשי היא להתוות איור 5 א ו 5 ב עבור 600 OD ונתוני GFP בהתאמה. ± 50% חתוכים (מסומן עם קווים מקווקווים) נבחר לגילוי להיט. להיטים פוטנציאליים על הסמך חתוך זה מסומן עם נקודות אדומות. שני סוגים של תרכובות של עניין ניתן דiscerned מן assay. נפילות באיור 5A הן תרכובות מעכבות התפתחות חיידקים, בעוד נפילות איור 5 ב הן תרכובות כי פוטנציאל להחזיק את היכולת לווסת את הרמות תאיות של c-di-GMP. שני מתחמים זוהו נפילות נציג עבור assay זה. אלה הם מתחם, B מעכב מתחם צמיחה פוטנציאלי, מעכב פוטנציאל c-di-GMP. תרכובת תואמת F8 גם איורים 3 ו -4 והיו לו עיכוב 72.5% בצמיחה. היה עיכוב מקביל צפוי ברמות מחזוריות di-GMP. מתחם B מתאים K3 גם איורים 3 ו -4 והיה לו עיכוב 61% ברמות מחזוריות di-GMP ללא שינוי בצמיחה. תרכובות להיט בחרו נבדקים נוספים על ידי assay 10 נקודות מנה-תגובה עם ריכוז עליון של 2 מ&quot;מ וסדרות דילול כפול. ערכי 50 IC מחושבים על מנת התגובהעקומות (איור 6 א &#39;וב&#39;). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig1.jpg" /> סקירה כללית באיור 1.: הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה קטנה מולקולות עבור הפוטנציאל שלהם לווסת רמות ניידות של c-di-GMP ב פ aeruginosa. סקירה זו מציגה צעד-אחר-צעד ייצוג של הפרוטוקול המשמש assay זה. מושבת חיידקים של פ aeruginosa הוא גדל לילה תרבות המתנע LB. באמצעות מתקן מגיב, התאים מחוסנים לתוך 384 גם צלחות המכילות תרכובות שנבחרו. הצלחות מודגרת במשך 6 שעות, שלאחריו ערכי OD 600 ו- GFP נמדדים. באמצעות לקריאת פסקים אלה, תרכובות המשפיעות על הרמות הסלולריות של c-di-GMP ניתן לזהות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig2.jpg" /> . איור 2. מפת פלייט 384 גם משמש מולקולה קטנה הקרנת Assay התרכובות מהספרייה (תכלת) הם aliquoted לתוך בארות A1 - P22. &quot;שליטה חיובית&quot; (אדום) המורכב לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / סולפט tobramycin מ&quot;ל מתווסף בארות A23 - P23 ואת &quot;שליטה שלילית&quot; (ירוק) המכיל ריכוז סופי של 1% DMSO מתווסף A24 בארות - p24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig3.jpg" /> איור 3. נציג תוצאות עבור אחת 384 גם הקרנת פלייט. Rהנתונים הגולמיים epresentative מיועד OD 600 (א) ו- GFP (B). מפת חום צבע הדרגתי, עם חם (האדום: OD 600 = 0.65 או GFP = 250,000) כדי לקרר (גרין: OD 600 = 0.10 או GFP = 40,000) צבעים המציין נמוך לערכים גבוהים, יושם לערכים היטב. וולס כי יש יחסית קריאות OD 600 / GFP תחתונה הביקורת השלילית DMSO ייטו להיות באדום בעוד בארות שיש קריאות GFP OD 600 / גבוהות ביחס לשליטת DMSO ייטו להיות בירוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig4.jpg" /> איור 4. נציגי תוצאות עבור עיכוב אחוז מחושב עבור צלחת 384 גם. נתוני עיכוב% נתחו מיוצגים הן של OD 600 (א) ו- GFP (B) לקריאה outs. מפת חום צבע הדרגתית, עם חם (אדום: OD 600 = -150% או GFP = -20%) כדי לקרר (גרין: OD 600 = 100% או GFP = 100%) צבעי מציין נמוכים לערכי עיכוב גבוהים, כבר להחיל את הערכים היטב. מולקולות קטנות, אשר באופן פוטנציאלי לעכב צמיחה תאית ג-di-GMP ייטו להיות בירוק ואילו מולקולות קטנות אשר באופן פוטנציאלי לקדם צמיחה ורמות C-di-GMP התאיים ייטו להיות באדום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig5.jpg" /> איור 5. מגרשי פיזור נציג עבור עיכוב% (OD600 / GFP) מתקבל נבדקת כל מולקולה הקטנה. כל מולקולה קטנה מיוצגים על ידי נקודה ואת חלוקת עיכוב%עבור כל אחד OD 600 (א) ו- GFP (B) לקריאה פסקי מוצג. ± 50% חתוכים נבחר לזיהוי להיט. להיטים פוטנציאליים מודגשים באדום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig6.jpg" /> איור 6. נציגי תוצאות ממינון -. Assay תגובת שתי תרכובות (מעכב צמיחה פוטנציאלי B מעכב ג-di-GMP פוטנציאל) זיהו מן המסכים קודם נבדקות נוספות ב assay 10 נקודות מנה-תגובה עם ריכוז עליון של 2 מ&quot;מ וסדרות דילול כפול. התאמת פונקציה לוגיסטית ארבעה פרמטר לנתונים הניבו ערכי 50 IC של 158 מיקרומטר ו 193 מיקרומטר בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig6large.jpg" target="_blank">Ple</a>ASE לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

מאמר זה מתאר את assay התפוקה גבוהה כי כבר נקבע בהצלחה למסך ספריות גדולות של מולקולות קטנות עבור היכולת הפוטנציאלית שלהם לתפעל רמות סלולריות של di-GMP המחזורי Pseudomonas aeruginosa, מתן כלי רב עצמה חדש לגילוי סמים אנטיבקטריאלי ובדיקה מתחמת.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

establishment-high-throughput-setup-for-screening-small-molecules

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

8.3K Views.  University of Dundee.  מאמר זה מתאר את assay התפוקה גבוהה כי כבר נקבע בהצלחה למסך ספריות גדולות של מולקולות קטנות עבור היכולת הפוטנציאלית שלהם לתפעל רמות סלולריות של di-GMP המחזורי Pseudomonas aeruginosa, מתן כלי רב עצמה חדש לגילוי סמים אנטיבקטריאלי ובדיקה מתחמת. 

Video: Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

תרבות של וריאציה של המושבה הקטנה של הפסאודומונס וככמת של האלגיאט

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

מדבקת החיסון נגד הידבקות כרונית בנגיף הדלקת בפצע

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות כדי להבהיר את השפעתם על התמדה חיידקית

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...