This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).

Bütün deneyler Hayvan Bakımı ve NIEHS Kullanımı Komitesi tarafından incelendikten sonra Hayvan Refahı Yasası ve İnsani Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımına İlişkin ABD Kamu Sağlığı Hizmetleri Politikası&#39;na uygun olarak yapıldı. K. 1. Hazırlık pneumoniae Kültür Dikkat: Bir biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL2) başlık veya başka bir BSL2 belirlenmiş alandaki tüm adımları uygulayın ve enstitü BSL2 kurallarına göre atık atmak. <ol><li> K. süspansiyon büyümesi için pneumoniae, bakteri, bir gliserol stokundan çözülmesi ve K. 1 ml aktarılarak bir çalışma kültürünün aşılanması 500 ml&#39;lik bir ya da daha büyük bir şişe içinde triptik soya suyu (TSB) içinde, 50 ml pneumoniae stok. </li><li> Kültürlü log-faz K. 900 ul ekleyerek gliserol stokları yapmak pneumoniae steril gliserol, 100 ul -20 ° C veya -80 ° C donma. Uzun süreli depolama için, -80 ° C tavsiye edilir. </li><li> s &#39;den bir bakterigece boyunca balon çalkalanarak 1.1 TEP -, 200-225 rpm.In log fazı büyümesini teşvik etmek için 37 ° C&#39;de (14 ila 18 saat) sabah 50 ml TSB içeren bir şişeye, bu gece boyunca kültürün 1-5 ml seyreltik ~ 2.5 saat boyunca çalkalanarak 37 ° C&#39;de geri koyun. </li><li> K. 1 ml aktarın 2 dakika süreyle 7500 xg&#39;de 1.5 ml tüp ve spin içine son adımından pneumoniae kültürü. Beyaz pelet görünür olmalıdır. yavaşça steril tuzlu su, 1 ml pipet ile bakteri tekrar süspansiyon, pelet bozmadan süpernatantı ve 2 dakika boyunca 7500 x g hızında tekrar döndürür. <ol><li> Bu yıkama adımı 2x gerçekleştirmek steril tuzlu su, 1 ml nihai, yıkanır ve yetiştirme. </li></ol></li><li> Bu temiz inokulum log-bilge seri dilüsyonları gerçekleştirin. Örneğin, seri 10 -1 -10 -9 seyreltme dizi yapmak için steril serum fizyolojik 3.6 ml inokulum 400 ul ekleyin. </li><li> Yıkanmış K. OD 600 belirleyin pneumoniae 1 ml koyarak1:10 ve 1: steril tuzlu su ile ilk kesme tek kullanımlık küvetler ve OD 600 ölçmek içine 100 dilüsyonları. doğruluğunu sağlamak için çiftleri ölçün. 1.0 bir OD 600 4-7 x 10 8 CFU / ml eşdeğerdir. OD CFU ilişkisi / ml doğrusal unutmayın. <ol><li> K. konsantrasyonunu hesaplamak için dilüsyonları gelen OD 600 kullanın pneumoniae, OD uygulayarak: CFU / ml üzerinde dönüşüm ve faktoring seyreltme. </li></ol></li><li> K. kullanın pneumoniae konsantrasyonu (aşağıya bakınız) farelere dağıtımı için bir &lt;100 ul hacim içinde, istenen aşı CFU doz hazırlanması için. </li><li> Ayrıca 10 -6 -10 -9 seyreltileri, 100 ul ve oda sıcaklığında tek tek triptik soya ağarı (TSA) plakaları üzerine steril tuzlu su, 100 ul plaka. 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edildi ve deneyde kullanıldı ve kirlenme kontrol etmek için tam konsantrasyonu hesaplamak için bakteri kolonileri numaralandırmak. NOT: Son inokulum Gerçek bakteri konsantrasyonu 500 CFU / absorbans tahmin ml ± olabilir. Kendi kişisel deneyime dayalı CFU / ml dönüşüm: ampirik OD 600 tekrar ayarlanmasına, farelerde in vivo kullanımdan önce pilot çalışmalarda CFU / ml ilişki: deneyci ideal OD 600 teyit etmelidir. </li></ol> K. 2. Fare intratrakeal (it) Aspirasyon orofarenksten pneumoniae <ol><li> Bu fareler sağlamak benzersiz kuyruk işareti, dövme veya onaylanmış diğer tanımlayıcı ile tanımlanır. </li><li> prosedürünü hızlandırmak için izofluran fareleri çıkarmadan önce P200 pipet kullanarak bakteri inokulum dozaj hazırlayın. o aspirasyon ile en iyi sonuçları elde etmek için, taşmasını önlemek için &lt;100 ul bir hacme kullanın. Burada K. 2000 CFU / 50 ul kullanın pneumoniae. </li><li> Izofluran gaz (1 L / dakika akış hızında, örneğin,% 2 izofluran) açık bir oda içinde veya enstitüsü göre fareler anesteziutional kurallar. Birlikte anestezi farelerin sayısı deneyci konfor düzeyi, aynı anda tipik olarak 1-2 ile tespit edilir. nefes gözlemleyin ve derin nefes görülebilir ve 2-3 sn nefesler arasında sayılabilir kez anestezi seviyesini onaylamak. NOT: Uçucu (inhalasyon) anestezik olası karıştırıcı etkileri hakkında endişe varsa, anestezi ketamin / xylazine intraperitoneal enjeksiyonu ile yerine elde edilebilir. Yukarıda tarif edilen yöntemle, Derin anestezi sadece birkaç dakika sürer. daha uzun süreli anestezinin ise, göz merhemi okular kuruma önlemek için kullanılmalıdır. </li><li> Fare uyuşturulduktan sonra, bir eğimli pleksiglas gemide mandal (Şekil 1) arasında gerilmiş bir lastik bant gelen maksiller kesici tarafından askıya bir semirecumbent yatar pozisyonda, içinde konumlandırmak. </li><li> Yavaşça P200 pipett ile ağız boşluğuna künt bir olmayan çıkıntılı forseps çifti ve mevduat dozu ile yan fare dilini çekine. dil ya da orofarenks ya travmayı uyaran önlemek için büyük özen. </li><li> geri dil tutarken fare nefes kadar hafifçe eldivenli parmak ile burun tıkamak. Fare iki veya daha fazla inhalasyonları almıştır ve hiçbir sıvı ağız boşluğunda görünür oluncaya kadar burun kapsayacak şekilde devam ediyor. burun kapsayan fareler zorunlu burun solunumu bağımlısı olarak fare, akciğerlere bakterileri nefes sağlamaya yardımcı olur. </li><li> aşılama kurulu fareyi çıkarın ve fare anestezi sonrası iyileşme ise burun deliğine engelleme yatak veya enkaz önlemek için sırtında fare koyarak, kendi kafesine geri dönün. </li><li> Bir kez tüm fareler dozda edilmiş ve anestezi uyandı, K. ile dozlanmış olan tek fareler içeren bir hücre / odasında ev fareleri 48 saat sonrası enfeksiyon ötesinde eğer pneumoniae. vücut ağırlıkları da dahil olmak üzere, günlük fareler izleyin. </li><li> fareler 48 ötesine gitmek için izin eğer günlük püre ve / veya tamamlayıcı ısı kullanınhr. </li></ol> 3. Bronkoalveolar Lavaj Sıvısı (BALS) Toplama ve Analizi <ol><li> kurumsal kurallarına göre fareler Euthanize. Bu CO2 inhalasyonu ve servikal dislokasyon ile ilişkili akciğer mümkün komplikasyonları önler olarak burada, 150 mg / kg sodyum pentobarbital ya kansız bırakılarak ardından ticari bir ötanazi çözeltisinin eşdeğer doz öldürücü bir enjeksiyon kullanımı. </li><li> sırtında pozisyon fare ve özellikle göğüs ve boyun bölgesinde üzerinde% 70 etanol ile kürk püskürtülerek fare sterilize edin. </li><li> daha sonra forseps ile sternum tutarak, sadece sternum altında uzunlamasına kesim olun, nick akciğer sağlayan diyafram, göğüs boşluğuna geri düşmek. trakea açığa damarsal her iki tarafındaki göğüs boşluğu yoluyla kesilmekte ve sonra boynundan yukarı. </li><li> trakea iki tarafında boyuna kasların tarafından çevrelenmiş olarak, dikkatle, ortasından kesilmiş ve yanlara doku itmekBu trakea içine kan getirebilir çevreleyen damarsal, kesme önler. damar nicked ise, önce trakea lümeni erişim için gazlı bez ile çevredeki temizleyin. </li><li> nick trakea baş aşağı yolda yaklaşık ¼ cerrahi makas veya bir iğne kullanın ve kaudal trakea içine 1x fosfat tamponlu salin (PBS) 1 ml önceden yüklenmiş bir 1 ml şırınga bağlı bir kanül yerleştirin. kullanarak fareler ya da kadınların 8 hafta &lt;Eğer 600-800 ul lavaging hacmini azaltmak. </li><li> tüm loblar şişirmek ve sonra 3x tekrarlayarak, şırınga ile geri dışarı hacmi çekmeye izin yavaşça akciğer içine hacmi itin. PBS burun deliklerinin çıkan ise kanül trakea içine yeterince itti edilmemiştir ya da enflasyon çok hızlı gerçekleşiyor. akciğerleri iyi şişirme değil Alternatif olarak, kanül çok itti olmuştur, bu yüzden biraz geri çekin. </li><li> Buz üzerinde 15 ml bir tüp içinde havuzlanmış yıkama toplayın. </li><li> Çevirmek5 dakika boyunca 1200 x g&#39;de hava boşluğu lavaj sıvısı, 1.5 ml tüp içine süpernatan toplamak ve -80 ° C&#39;de dondurun. Daha sonra, protein, sitokinler ve çeşitli diğer biyokimyasal tahlillerde ölçülmesi için supernatant (yani, BALF) kullanın. Pelet bronkoalveoler boşluktan hücreleri temsil eder. </li><li> Kırmızı kan hücreleri (RBC) rengine göre hücre peleti belirgin ise, 1 x PBS, 5 ml ilave edilir, 1 dakika boyunca ACK lisiz tamponu 1 ml lize parçalama reaksiyonu durdurun ve tampon sulandırmak için. ACK lisiz tamponu ile muamele edilmiş olsun veya olmasın, aynı Tüm örnekler ele alın. </li><li> Sıkma hücreler 5 dakika süreyle 1.200 xg, süpernatant süzün ve 1 x PBS, 1 ml hücre getir. </li><li> Toplam hava sahası hücrelerinin sayımı için bir hemasitometre Vortex ve sayım hücreleri. </li><li> hücrelerin yoğunluğuna dayalı (80 virüslü bir fare için ul ve naif bir fare için ~ 150 ~) bir sitospin santrifüj slayt odasına yaklaşık 80-150 ul ekleyin. Spin hücremikroskop üzerine s hücre ayırıcı nüfusu belirlemek sonraki boyama kayar. </li><li> Hücreler gecede slaytlar üzerinde kurumaya bırakın. Leke leke 2 slaytlar sabitleştirici 7 kez, leke 1 9 kez, ve 7 kez batırarak tri-leke (örneğin, Hema 3 [tabloya bakınız]) ile hücreleri (lekeleri arasında durulama), ve kurumasını bekleyin. leke kuruduktan sonra, elle lamel slaytlar ve mikroskopta farklılıkları saymak. Genel olarak, nötrofiller ve monosit / makrofajlar kolayca boyutu ve çekirdek morfolojisine ile ayırt edilir. </li></ol> 4. Akciğer ve periferik dokularda Bakteriyel Yük belirlenmesi <ol><li> Başlamadan önce: akciğer ve dalak için 1x PBS 900 ul ve kan 1x PBS 90 ul seyreltme tüpler hazırlamak. bakteri kültürü için ve oda sıcaklığında ayarlanmış etiket plakaları; Bu yüzden, doku toplandığında zaman bakteri büyümesi için homojenizasyon ve kaplama arasındaki en aza indirilmiş olacaktır. Not: nedeniyle heterojen deposi içinaspirasyon ile oluşabilir akciğerlerde bakterilerin tion, bireysel fareler toplam havayolu selülaritede veya toplam (iki taraflı) akciğer bakteriyel yükü ya analizinde kullanılması tavsiye edilir. </li><li> Adım 3.1 göre fare Euthanize ve daha sonra pıhtılaşmayı önlemek için bir heparinli tüpe koyarak, sol karıncıktan kan toplamak. 1x PBS 2 ml dalak ve yerleştirme uzaklaştırılarak elde edilmiş 1 x 5 ml PBS içeren 15 ml&#39;lik bir tüp içinde akciğer lobları yer çıkarın. buz üzerinde tüpler yerleştirin. Her doku / fare arasında etanol ile aletleri temizlemek için özen gösterin. </li><li> tercihen her bir numune arasında değiştirilebilir tek homojenizatör ile buz üzerinde doku homojenize edilir. Tek kullanımlık homojenleştirici ipuçları deneyler arasında yeniden kullanım için otoklava sokulabilir. </li><li> dokusu homojenize edildikten sonra, seri dilüsyonları ve plakayı gerçekleştirin. plastik üzerine bir ayrım çizgi çizerek, tek bir TSA plaka üzerinde nüsha olarak verilen bir doku / seyreltme plaka örnekleri. Kaplama ve didökülmesinden önerileri aşağıda gösterilmiştir (her durumda, örneğin 10 ul plaka üzerine yayılır) ve 24 saat sonra, enfeksiyon otopsi dayanmaktadır. 48-72 saat örnekleri analiz için, dilüsyonları daha çok sayıda daha sonraki zaman noktalarında artan bakteri yükü nedeniyle kaplama gerekebilir. <ol><li> Kan - steril 1x PBS 90 ul içine kan 10 ul ekleyerek 1:10 sulandırmak. Plaka temiz ve iki nüsha halinde 01:10 seyreltilmiş numuneler. Kan kaplama sonra 10 dakika sitokinler ve kemokinlerin ölçümü için plazma elde etmek için, 9,300 xg, artık kan dönerler. </li><li> seri steril 1x PBS 900 ul içine homojenize akciğer 100 ul ekleyerek 100: Akciğer İçin - 1 - 1:10 sulandırmak. Plaka düzgün homojenat ve iki nüsha halinde tüm dilüsyonlar. </li><li> Dalak için 1 - sulandırmak: 10-1: 100 seri steril 1x PBS 900 ul içine homojenize dalak 100 ul ekleyerek. Plaka düzgün homojenat ve iki nüsha halinde, her iki dilüsyonlar. </li></ol></li><li> yayılmış örnekler kısaca kurumaya bırakın. </li&gt; <li> Gecede bir statik 37 ° C inkübatör TSA plakaları ve yeri ters çevirin. </li><li> levhasının her iki tarafından ve her çözücüden bakteri kolonileri ortalayarak kolonize bakteri sayısını belirler. akciğer için 5 ml ve dalak için 2 ml başlangıç ​​dilüsyonları faktör toplam doku CFU belirlemek için. </li></ol>

<ol>
	<li>Mizgerd, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+lower+respiratory+tract+infection.">Acute lower respiratory tract infection.</a> N Engl J Med. 358 (7), 716-727 (2008).</li><li>Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+community-acquired+pneumonia+in+adults.">Management of community-acquired pneumonia in adults.</a> Am J Respir Crit Care Med. 183 (2), 157-164 (2011).</li><li>Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+pneumonia.">Animal models of human pneumonia.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).</li><li>Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+intratracheal+inoculation+method+for+the+study+of+pulmonary+melioidosis.">A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, 164 (2012).</li><li>Morales-Nebreda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratracheal+administration+of+influenza+virus+is+superior+to+intranasal+administration+as+a+model+of+acute+lung+injury.">Intratracheal administration of influenza virus is superior to intranasal administration as a model of acute lung injury.</a> J Virol Methods. 209, 116-120 (2014).</li><li>Aujla, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-22+mediates+mucosal+host+defense+against+Gram-negative+bacterial+pneumonia.">IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia.</a> Nat Med. 14 (3), 275-281 (2008).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells+mediate+clade-specific,+serotype-independent+mucosal+immunity.">Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity.</a> Immunity. 35 (6), 997-1009 (2011).</li><li>Draper, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-binding+cassette+transporter+G1+deficiency+dysregulates+host+defense+in+the+lung.">ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung.</a> Am J Respir Crit Care Med. 182 (3), 404-412 (2010).</li><li>Robinson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+exacerbates+Staphylococcus+aureus+pneumonia+by+attenuating+IL-1beta+production+in+mice.">Influenza A exacerbates Staphylococcus aureus pneumonia by attenuating IL-1beta production in mice.</a> J Immunol. 191 (10), 5153-5159 (2013).</li><li>Mizgerd, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+elicited+by+bacteria+in+the+lungs.">Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs.</a> Semin Immunol. 14 (2), 123-132 (2002).</li><li>Balamayooran, G., Batra, S., Fessler, M. B., Happel, K. I., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neutrophil+accumulation+in+the+lungs+against+bacteria.">Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs against bacteria.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (1), 5-16 (2010).</li><li>Quinton, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-specific+mutation+of+both+NF-kappaB+RelA+and+STAT3+abrogates+the+acute+phase+response+in+mice.">Hepatocyte-specific mutation of both NF-kappaB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice.</a> J Clin Invest. 122 (5), 1758-1763 (2012).</li><li>Gowdy, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+for+scavenger+receptor+B-I+in+the+integrative+physiology+of+host+defense+during+bacterial+pneumonia.">Key role for scavenger receptor B-I in the integrative physiology of host defense during bacterial pneumonia.</a> Mucosal Immunol. 8 (3), 559-571 (2015).</li><li>Madenspacher, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Integrates+host+defense+and+cell+fate+during+bacterial+pneumonia.">p53 Integrates host defense and cell fate during bacterial pneumonia.</a> J Exp Med. 210 (5), 891-904 (2013).</li><li>Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+distribution+of+particles+given+by+intratracheal+instillation+or+by+aerosol+inhalation.">Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation.</a> Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).</li><li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation.">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> J Immunol. 177 (1), 621-630 (2006).</li><li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria.">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139 (3), 485-498 (2009).</li><li>Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+microbiota+and+the+immune+system.">Interactions between the microbiota and the immune system.</a> Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bakteriyel pnömoni Murin modelleri, pulmoner konak savunma tepkisi içine kritik anlayışlar sağladı, gen hedefleme ve in vivo biyolojik ve farmakolojik girişimlerin ortak oldular. Büyük gelişmeler enfekte hava sahasında 10,11 nötrofillerin işe yöneten kemokinler ve adezyon moleküllerinin anlayışımızda özellikle yapılmıştır. Pnömoni in vivo modelleri, hücre bazlı veya alternatif yaklaşımlar aksine, aynı zamanda endokrin içine anahtar anlayışlar sağladı enfekte akciğer ve karaciğer (akut faz yanıtı) gibi diğer organlarda, arasında gerçekleşen iletişimi 12 ve böbreküstü bezleri (stres glukokortikoidler) 13. Son olarak, in vivo pnömoni modelleri ile ortaya kritik ve klinik son derece alakalı nokta başarılı patojen temizleme konağın başarısı için eşit olmamasıdır. Bir çok durumda, bir overexuberant bağışıklık tepkisi ana ölümüne yol açabilirnedeniyle bile başarılı patojen temizlenmesi 8,14 karşısında aşırı seyirci akciğer hasarı, için. Bu göz önüne alındığında, patojen açıklık ve immün yanıtın paralel ölçümleri genellikle en bilgilendirici ve hayatta kalma çalışmaları sonunda konağın entegre dayanıklılığını ortaya çıkarmak için gerekli olabilir. Burada, aspirasyonla murin akciğer, bakterilerin verilmesi için basit ve invazif olmayan bir yöntem tanımlanmıştır. aerosol ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, çalışma personeli solunum maruz düşük potansiyel riski taşıyan akciğerin derinliklerine daha yüksek konsantre edilmiş aşı teslim sağlar ve göz ve üst hava yolu immün tepkileri potansiyel karıştırıcı önler. İntranazal aşı, aynı zamanda merkezi sinir sistemi 4 lokal invaziv enfeksiyon olasılığını da dahil olmak üzere, üst solunum yolu enfeksiyonu, potansiyel olarak karıştırıcı bir endişe taşımaktadır ve aynı zamanda akciğer yüksek oranda değişken aşı ile sonuçlandığı bildirilmiştir5. Peroral veya transkutan rota ya vasıtasıyla entübasyon ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, en az eğitim gerektirir (~ 1 fare başına dakika) en azından ikinci yönteme göre ve, alt morbiditesi daha hızlıdır. Diğer yöntemlerle tarafından paylaşılan bunlardan bazıları - - orofaringeal aspirasyon yönteminin potansiyel dezavantajları doğrudan genel anestezi gereksinimini, (yani, asimetrik ve heterojen) patojen teslim yamalı olasılığını, alt loblarda 15 baskın enfeksiyon ve yetersizlik dahil tek bir akciğere tek taraflı olarak patojen. Nedeniyle aspirasyon (veriler gösterilmemiştir) sonra akciğerlerde yamalı dağılımı - aerosolleştirme 15 dışındaki tüm akciğer enfeksiyonu yöntemleri ile karşılaşıldığında bir sonuç - genellikle enfekte olmuş fareler üzerinde tek taraflı akciğer deneyleri yapmazlar. Her iki akciğer ya immün yanıtı değerlendirmek için bir araya lavaj veya toplanmış bakteri kant birlikte nekropsi uygulanırvb.&#39;yi kapsar ve / veya moleküler analizi (örn, gen ifadesi, miyeloperoksidaz deney, sitokin ELISA). Protokol özellikle kritik adımlar adım 1.8 OD 600 -confirming şunlardır: in vivo enfeksiyon öncesinde CFU / ml ilişki ve aynı zamanda her deneyde kaplama sayesinde aşı konsantrasyonu teyit; yanı adım 3.6 olarak - şırıngaya iyi hacim getirileri ile hava yolu olmayan bir travmatik lavaj sağlanması. Oral bitki (yani, polimikrobiyal pnömoni) ile ko-enfeksiyon teorik sorun olmasına rağmen, K ile enfekte edilen farelerin akciğer homojenatlarında polimorfik bakteri kolonileri rastlamadık pneumoniae veya S. pneumoniae. İstenirse bu olasılığı hakkında endişe araştırmacılar için ise, kontrol fareleri, aspire aracın (yani, tampon) maruz kalabilir. (Kalan unaspirated bakterilerin yutma yoluyla) ve mide duvarı bazı kirlenme mümkündür wit olmasına rağmenh biz tarif yöntemi, gastrointestinal klinik belirti veya brüt patoloji üzerinde değişiklik hiç karşılaşmadım. Üstelik bu olasılık aerosol ve burun yöntemleri yaygındır ve hatta intratrakeal aşılama yönteminde öksürük aşağıdaki oluşabilir. Bazı metodolojik endişeler tüm pnömoni modelleri evrenseldir. Kontrol ve deney fare grupları yaş olarak eşleştirilmiş birbirinden 2-3 hafta içinde ideal olmalıdır. Biz K. patojen temizlenmesi veya hava yolu inflamasyonu olarak açık cinsiyet farklılıkları bulamadı rağmen doğuştan gelen bağışıklık yanıtının cinsiyetler arasında önemli farklar 16 rapor edilmiştir olarak pneumoniae modeli, fareler, cinsiyet uyumlu olmalıdır. kontrol farelerinin kökeni dikkatli göz önüne alınmalı. Yavru kontroller tam olmayan geri-melezleme, immün hücre popülasyonlarında mikrobiyomları ilgili farklılıklar ve diğer epigenet ticari olarak satın alınan kontroller üzerinde, genel olarak tercih ediliric farklılıklar bağışıklık yanıtını 17,18 etkileyebilecek tüm olası etmenler vardır. Dikkatli dikkat özgü serotipi verilmelidir ve virülans önemli farklılıklar gibi enfekte bakterinin kültüre öyküsü görülebilir. K. ile deneyimimize dayanarak pneumoniae, biz inokulum bulaşmasını bir dizi kullanarak ilk pilot çalışmalar yapmanızı öneririz (örn yani 500-2.000 CFU) literatürde bildirilen belirli bakteri dozlarda morbidite / mortalite - hatta aynı bakteri serotip ve fare suşu ile - iyi tercüme olmayabilir kişinin kendi laboratuvarında, olası nedeniyle teknik tutarsızlıkların çeşitli. enflamatuar ve konakçı savunma sonuçları kontrol ve deney fareler arasında gruplar arası farklılıkları inokulum bağımlı olabilir. Nedeniyle hayvancılık ve personel lojistik gerçeklerine, sık sık deney grubu başına 5-6 fare ile deneyler. Bu arada CF için yeterli istatistiksel güce sağlamasına rağmenU ve hücre sayımı sonuçları, biz genellikle yeterli güç elde etmek için bu büyüklükte bir veya birkaç kez bir çalışma tekrarlamanız gerekebilir bulabilirsiniz. Belirli bir deneyde bazı farelerde, kan ve dalak saptanabilir bakteri üremesi 24 saat sonrası enfeksiyon (Şekil 5) karşılaşılabilir. Biz 24 saat saptanabilir ekstrapulmoner yayılması için kinetik eşik yakın olabileceğini göstermek için bu yorumlamak. Kan / dalakta düşük / saptanamaz büyüme görülürse, aynı fare akciğer CFU her zaman teknik hata olasılığını ele muayene edilmelidir (yani, muhtemelen fare doz bir hata gösteren çok düşük / saptanamaz akciğer enfeksiyonu). Son olarak, farelerde bakteriyel pnömoni orofaringeal aspirasyon dağıtım yöntemi maliyet, eğitim ve ekipman açısından elde etmek nispeten kolaydır sağlam bir tekniktir ve hatta geniş uzmanlık olmadan laboratuarlar için gerçekçidirPulmoner prosedürlerde. Yöntem kolayca konak savunma cevabı alt baş mikrobiyolojik ve immünolojik tahlillere bağlanır ve ayrıca olmayan kostik maruz geniş bir aralığı için, bir akciğer dağıtım yöntemi olarak kullanılabilir.

Toplum kökenli pnömoni aşılama iyileştirmeler ve antibiyotik stratejileri 1,2 rağmen son 40 yılda ölüm oranlarında küçük genel değişiklikle, ABD&#39;de enfeksiyon ölümlerin başta gelen nedenidir. halk sağlığı düzeyinde algılanabilir ilerleme olmamasına rağmen, son yıllarda dramatik gelişmeler öne akciğer enfeksiyonu fare modellerinin kullanımı ile mümkün bu adımların çoğu ile, pnömoni moleküler ve hücresel patogenezinin yapılmıştır. farenin genetik izlenebilir, murin ve insan bağışıklık sistemi ve ticari olarak temin edilebilir hale gelmiştir murin hedefli immünolojik reaktifler geniş bir dizi benzerliği bir araya alan hızlı bir ilerleme kolaylaştırmıştır. literatürde tarif bakteriyel pnömoni Fare modelleri genellikle patojen aşılama için dört teknik yolları üzerine dayanıyordu: i) aerozolizasyonuna; ii) geçişsizanasal dağıtım; iii) oral doğum; ve iv) cerrahi intratrakeal enjeksiyon (yani, trakeotomi) 3. Enfeksiyonun tüm yolları avantajları ve dezavantajları 3 var. oronazal florası, genel anestezi için gereksinimleri karışım özellikle, göreceli üst solunum yolunun maruz kalma potansiyeli distal akciğer teslim inokulum teslim patojenlerin lober dağılımı, teknik uzmanlık gereksinimleri ve prosedürel morbidite değişkenliği bu çapında büyük ölçüde değişiklik yaklaşımlar. Yaygın kullanılan oral enfeksiyon teknikleri veya doğrudan laringeal görselleştirme 3-5 altında bir &#39;kör&#39; (non-görüntülenmiştir) yaklaşımı ya vasıtasıyla endotrakeal (translaryngeal) kanül içerir. Her iki yöntem de, sağlam iken, önemli eğitim gerektiren ve aynı zamanda üst solunum travma riski taşımaktadır. Mevcut raporda, w, oral enfeksiyon teknik, yoğun olmayan non-invaziv, ucuz ve hızlı bir yöntem tarifburada bakteriler (verilen örnekte Klebsiella pneumoniae) aspirasyon (yani, inhalasyon) yoluyla akciğerlere iletilir bir anestezi fare orofarenks pipetlenir. Biz ve diğerleri başarıyla 6-9 aspirasyon pnömonisi tekniği kullandık. Bu çok yönlü ve kolayca öğrenilebilir akciğer dağıtım yöntemi, sitokinlere ve başka proteinlere, patojenle ilişkili moleküller (örneğin lipopolisakkarid), hücrelerin (örneğin, adoptif transfer) da dahil olmak üzere akciğer, pek çok ek olmayan kostik maddelerin iletimi için uzatılabilir ve toksinler (örneğin, bleomisin). Önemli bir teknik konuları ele ek olarak, aynı zamanda alt-bakteriyel açıklık ölçümünde (yani, koloni oluşturan birim [CFU] akciğer ve periferik organlarda miktar tayini), lökosit gibi pnömoni sonraki ana cevabın değerlendirilmesi için entegre, kantitatif bir yaklaşım tarif hava sahasında birikimi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Klebsiella pneumoniae, serotype 2</td>
			<td style="width:169px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">43816</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tryptic soy broth</td>
			<td style="width:169px;">Becton Dickenson</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4&#34;</td>
			<td>Claflin Medical Equipment</td>
			<td style="width:119px;">MEDC-031122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hema 3 Solution 1</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23-122-937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hema 3 Solution 2</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23-122-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hema 3 Fixative</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23-122-929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">27&#189; gauge tuberculin syringes</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-826-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Lithium heparin plasma collectors</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">2675187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">L-shaped disposable spreaders</td>
			<td style="width:169px;">Lab Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:243px;">1x PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:169px;">prepared in-house</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:243px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:169px;">prepared in-house</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-invasive and technically non-intensive method for induction and phenotyping of experimental bacterial pneumonia in mice

Toplum kökenli pnömoni, önemli bir halk sağlığı sorunu olmaya devam etmekle beraber, bakteriyel pnömoni fare modelleri son zamanlarda yatan hücresel ve moleküler patogenezi anlayışımızda önemli preklinik gelişmeler kolaylaştırmıştır. In vivo fare modelleri konak savunma tepkisi entegre fizyolojisini ve dayanıklılığını yakalamak bir şekilde alternatif basitleştirilmiş ex vivo yaklaşımlar ortaya değildir. Çeşitli yöntemler intrapulmoner aerosol içeren farelerde bakterilerin aşılanmasından, Burun içinden tatbikat, &quot;kör&quot; ve görsel koşullar altında oral endotrakeal kanülasyon ve deri endotrakeal kanülasyon için literatürde tarif edilmiştir. Tüm yöntemler göreceli yararları ve sınırlamaları vardır. Bu yazıda, detaylı fare ile aspirasyon (yani, inhalasyon) içeren bakterilerin intratrakeal teslimat için, non-invaziv teknik olarak yoğun olmayan, ucuz ve hızlı bir yöntem tarifise genel anestezi altında orofarenks pipetle bir bulaşıcı inokulum. Bu yöntem olmayan yakıcı biyolojik ve kimyasal maddeler, çok çeşitli akciğer verilmesi için kullanılan, ve hatta solunum prosedürlere az deneyimi olan Laboratuvar öğrenmek nispeten kolay olabilir. Aspirasyon pnömonisi yöntemi açıklayan ek olarak, aynı zamanda, özellikle, in vivo fare akciğer doğal immün yanıtının daha sonra analiz edilmesi için adım adım prosedürleri sağlayan bakteriyel açıklık ve enfekte solunum hücresel bağışıklık tepkisi ölçülmesi için yöntemler. pnömoni değerlendirmesine Bu entegre ve basit bir yaklaşım pulmoner doğuştan gelen bağışıklık üzerine genetik ve çevresel manipülasyon etkisi hızlı ve sağlam değerlendirme için izin verir.

C57BL / 6 fareleri K. 2000 CFU ile enfekte edilmiştir akciğerlere orofaringeal aspirasyon yoluyla pneumoniae 43816 (serotip 2). Bu dozda, fareler genelde klinik belirtiler uyuşukluk, karıştırdı kürk ve% 5-10 (Şekil 2A) kilo kaybı da dahil olmak üzere 12-24 saat sonrası enfeksiyon göstermeye başlar. 48-72 saat sonrası enfeksiyon içinde, farelerin birçok tipik azalmış aktivite ile hunched duruşlar% 20 kilo kaybı ve sonuçların ortalama öncesinde ve uyarılmaya yanıt azalır hastalık ve morbidite belirtileri göstermektedir. Daha uzun süreli çalışmaları K. daha düşük bir doz gerektirebilir pneumoniae. K. 500 CFU enfeksiyonu pneumoniae kurtarma ve kilo alımı günde 5-6 (Şekil 2B) tarafından başlayan ile% 10-15 bir ağırlık kaybı ile karakterize edilir 3-5 d-sonrası enfeksiyon pik hafif hastalık ile sonuçlanır. Vücut ağırlığı az% 20 bir ağırlık kaybı ile, hayatta kalma genellikle prediktif olanly kurtarma ile ilgili. konak yanıtının nihai başarı iyi fareler gibi dokunsal uyarılması ve / veya kilo kaybı minimal yanıt olarak can çekişme belirtileri, 10-14 gün süreyle izlenir ve (kurumsal olarak onaylanmış kurallarına göre) ötenazi burada hayatta kalma çalışmaları ile belirtilebilir &gt;% 20. Bir kontrol grubu (Şekil 2C)% 50 ölümcül (yani, LD50 dozu) yaklaşan bir enfekte inokulum hedefliyorsa Survival çalışmalar genellikle en etkili olanlardır. LD50 dozu göreli olarak yüksek tespiti sağlar ve deney grubunda sağkalımı azalmıştır. Diferansiyel hayatta bu kadar çok sayıda enfeksiyon dozları bazen değişmiş bir konak savunma fenotip tespit etmek için gerekli olabilir, aşı-bağımlı olabilir. K. ile alt solunum yolu enfeksiyonu pneumoniae Leuk sağlam bir akışı ile karakterize edilirsolunum yoluna ocytes. BAL hücre pelletinin boyama ile bağışıklık hücresi sayımı ve farklılaşma 6H enfeksiyondan (Şekil 3A) içindeki hava yolu bağışıklık hücrelerinde bir artış göstermektedir. Nötrofiller hava yolunun (Şekil 3A-B) ağırlıklı immün hücre olmak üzere 24 saat ile sellüler pik. C57BL / 6 farelerinin her iki cinsiyet K. yanıt olarak eşdeğer bir hava yolu lökositoz göstermektedir 24 saat ve 48 saat sonrası enfeksiyon (Şekil 3C-D) pneumoniae. Bakteriyel pnömoni yerel (intrapulmoner) ve sitokinler ve kemokinlerin dahil sistemik pro-enflamatuar sitokinlerin neden olur. Yerel sitokin / kemokin düzeyleri geleneksel bir ELISA BAL&#39;da veya çok katlı bir sitokin sistemi kullanılarak tespit edilebilir. IL-6, RANTES, TNFa, G-CSF, ve diğerleri de dahil olmak üzere sitokinler K. hem 24 saat ve 48 saat sonrası enfeksiyon görülebildiği pneumoniae ve lun&#39;a fikir verirg mikroçevresinin ve bağışıklık hücrelerinin işe alma (Şekil 4). akciğer, kan ve dalak gibi periferal doku (lar) toplanması iki mikrop lokal pulmoner temizliği hem de bakteri ekstrapulmoner yayılması fikir veren doku bakteri yükünün kantitatif sağlar. Seri Seyreltme ve akciğer kültür 24 saat ve 48 saat sonrası enfeksiyon (Şekil 5A) arasındaki mikrobiyal yükün artmasına göstermektedir. Benzer bulgular, kan ve dalak (- C Şekil 5B) belirtilmiştir. Dikkat çekici bir bimodal bakteriyel yük hayır göstererek, hatta akciğerde yüksek dereceli bakteriyel yükü karşısında, bazı yüksek dereceli bakteriyel yayılmasını olan fareler, ve diğerleri ile, 24 saat sonrası enfeksiyon, kan ve dalak yazabilir kan ya da dalak saptanabilir bakteriler. K. C57BL / 6 farelerinde pneumoniae bakteri yükü Gend değildirer-özel erkek ve dişileri çeşitli dokular sonrası aşılama (Şekil 5D-F) eşdeğer yükünü gösterdiği gibi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54508/54508fig1.jpg" /> Şekil 1:. Fare aspirasyon pnömonisi için prosedür Kurulu fareler Eğitim iki mandal bir pleksiglas veya benzeri kuruluna monte arasında bir lastik bant gergin dan kesici tarafından askıya, baş yukarı ve geri yönetim kurulu (yani, semirecumbent) için konumlandırılmış. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54508/54508fig2.jpg" /> Şekil 2: Kilo kaybı ve değerlendirilmesi Morbidite K. pulmoner aspirasyon ardından pneumoniae. C57BL / 6 fareleri (n = durumda 10-20) K. aspirasyon ile enfekte edildi pneumoniae 43.816 (serotip 2). (A) 2000 CFU ile enfekte farelerden alınan günlük ağırlıklar, endeksli öncesi enfeksiyon ağırlığı. Bu çalışmada, hiçbir fareler, 500 CFU 150 gün 5. (C) Yaşam eğrileri başlayan kilo doğru geçiş ile günde 4 sonrası enfeksiyon yoluyla günlük kilo kaybı 500 CFU sonuçları ile geçmiş gün 6. (B) Enfeksiyon hayatta CFU, 2000 koloni oluşturan birim (CFU) enfeksiyonları, 500 CFU LD50 yakın olduğunu göstermektedir. Paneller A ve B Veriler ortalama ± SEM vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54508/54508fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54508/54508fig3.jpg" /> Şekil 3: K ile enfeksiyon pneumoniae Zaman bağımlı Havayolu Lökositoz içinde bulundu. C57BL / 6 fareler K. 2000 CFU ile intrapulmoner enfeksiyonu verildi zatürreeÇeşitli zamanda hava sahası sıvısında toplam lökositlerin (WBC), nötrofil (PMN), ve makrofajlar (Mφ) e. (A) Sayım sonrası enfeksiyon işaret ediyor. Boyama, PMN ve makrofajlar üzerine (B) kolayca Cytospin alanlarda nükleer morfoloji ve büyüklüğü ile tanımlanır ve sayılabilir. (C - D) erkek ve kadınlarda enfeksiyon 24 saat ve 48 saat sonrası enfeksiyon işe inflamatuar hücrelerin benzer sayıda sonuçlanır. Veriler ortalama ± SEM durum başına 6-25 / farelerin türeyen ve vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54508/54508fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54508/54508fig4.jpg" /> Şekil 4:., Sitokinlerin ve kemokinlerin bakteriyel enfeksiyona yanıt olarak Havasahasında indüklenir C57BL / 6 fareleri intrapulmon verildiK. 2000 CFU ile ary enfeksiyon pneumoniae. BALS sitokin ve kemokin 24 saat ve 48 saat sonrası enfeksiyon multipleks tahlili ile ölçüldü. Veriler 5-15 fare / durum türetmek ve ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54508/54508fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54508/54508fig5.jpg" /> Şekil 5:. Pnömoni C57BL sırasında Akciğer ve periferik dokularda Bakteriyel Yükü zamana bağlı Genişleme / 6 fareleri K. 2000 CFU ile intrapulmoner enfeksiyonu verildi pneumoniae. (A) Akciğer parankimal bakteriyel yük TSA 24 saat ve 48 saat sonrası enfeksiyon akciğer Homojenat seri dilüsyonları kaplama ile ölçüldü. (B), kan dolaşımı ve (C) dalak bakteriyel yükü Benzer ölçüldü. ( <strong&gt; D - F) çeşitli dokularda bakteriyel yük pnömoni indüksiyonu sonrası erkek ve dişi farelerde eşdeğerdir. Veriler 10 fare / durum türetmek ve SEM ± ortalamasıdır. Paneller B, C, E, ve F sıfır değerleri bir günlük ölçekte grafiklerini izin 0.1 değerini ayrıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54508/54508fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice at JoVE.com

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Çeşitli yöntemler, farelerde bakteriyel pnömoni modelleme için literatürde tarif edilmiştir. Bu yazıda, orofarinksin pipetle bakteriyel inokulum aspirasyonu (yani, inhalasyon) yoluyla zatürree uyarılması için bir non-invaziv, ucuz, hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. akciğer doğal bağışıklık yanıtının değerlendirilmesi için aşağı akış yöntemleri de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Farelerde Deneysel Bakteriyel Pnömoni İndüksiyonunun ve fenotipleme bir Non-invaziv ve Teknik Olmayan yoğun Yöntem

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

a-non-invasive-technically-non-intensive-method-for-induction

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K Görüntüleme.  National Institutes of Health.  Çeşitli yöntemler, farelerde bakteriyel pnömoni modelleme için literatürde tarif edilmiştir. Bu yazıda, orofarinksin pipetle bakteriyel inokulum aspirasyonu (yani, inhalasyon) yoluyla zatürree uyarılması için bir non-invaziv, ucuz, hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. akciğer doğal bağışıklık yanıtının değerlendirilmesi için aşağı akış yöntemleri de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. 

Video: A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon Fare Hipofiz İmmunogen hazırlanması

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJL Farelerde Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...