Bu protokol, sağlam, akut akciğer hasarı oluşturan tekrarlanabilir bir pnömoni modeli sağlar. Bu modelin diğer avantajları, farelerde enfeksiyöz ARDS veya akut solunum sıkıntısı sendromunu çoğaltmak için kullanılabilir. Daha önce de belirttiğim gibi, bu model, akut akciğer hasarının erken ve geç aşamalarını ve çözünürlüğünü değerlendirmek için mortalite ve yaralanma seviyesinin kolayca titre edilebildiği ve terapötik stratejileri değerlendirmek için bir platform görevi gördüğü durumlarda oldukça tekrarlanabilir.
Bu protokol akciğer hasarının tanı veya tedavisi için yeni bir yaklaşım sağlamasa da, özellikle immünoloji, akciğer hastalıkları ve enfeksiyon hastalıkları ile ilgili alanlar için yararlı olan yeni tedavilerin test edilebileceği güvenilir bir modeldir. Bu tekniğin avantajlarından biri tekrarlanabilirliğidir. Bununla birlikte, bu tekniği ilk kez uygulayan kişiler, kateteri intratrakeal olarak yerleştirmede zorluklar yaşayabilir.
Bu nedenle ideal olarak, bu tekniği öğrenen insanlar ötenazi uygulanmış hayvanlarda uygulamaya başlamalıdır. Başlamak için, ısıtılmış bir çalkalayıcı veya inkübatörde bir kanlı agar plakasını 37 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Dondurucudan yeni bir bakteri stoğu şişesi alın ve şişe tamamen çözülene kadar 37 derecelik bir su banyosunda hafifçe çalkalayarak çözdürün.
O-ringe veya kapağa ılık suyla dokunmaktan kaçının. Bakteri kolonilerini bir plaka üzerinde manuel olarak saymak için, 1 kez 10 ila altıda bir seyreltme gerçekleştirin ve son seyreltmeden 200 mikrolitreyi önceden ısıtılmış bir kan agar plakası üzerine plakalayın. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, verilen formülü uygulayarak yeni bakteri konsantrasyonunu belirleyin. Anestezi uygulanmış fareyi temiz ve sterilize edilmiş bir yüzeye yerleştirin. Fareyi kesici dişlerden asın ve ön ayakları nazikçe bantlayın.
Boyun bölgesini tıraş edin ve bölgeyi klorheksidin ve% 70 alkol ile dezenfekte edin. Daha sonra cerrahi makas kullanarak, trakeayı görselleştirmek için bir santimetrelik, yüzeysel-orta hat boyun kesisi yapın. Bol miktarda yağ dokusu görülürse, trakeayı görselleştirmek için yağ dokusunu dikey olarak dikkatlice inceleyin.
Dili yavaşça dışarı doğru çekin ve kateteri trakeaya doğru ilerleterek ağızdan 20 gauge anjiyo-kateter sokun. Entübasyonu kolaylaştırmak için trakea üzerine hafif bir baskı uygulayın. Entübasyondan sonra, entübasyonu onaylamak için fareyi bir solunum cihazına bağlayın.
Ventilatör parametrelerini 200 mikrolitre tidal hacim ve dakikada 200 vuruş olarak ayarlayın. Entübasyonu onayladıktan sonra, fareyi solunum cihazından ayırın ve 200 mikrolitrelik bir pipet, jel yükleme ucu kullanarak anjiyo kateterden 50 mikrolitre bakteri ajanını dikkatlice damlatın. Kurulumdan sonra, solunumun yeniden başlatılmasına yardımcı olmak için fareyi tekrar solunum cihazına bağlayın.
Solunumu izlemek için fareyi 30 ila 60 saniye solunum cihazının üzerinde bırakın. Yavaş nefes alma paterni gözlenirse, fareyi tekrar solunum cihazına bağlayın. Cilde bir damla yapıştırıcı ekleyerek kesiği kapatın.
Cilt kıvrımlarını bir araya getirin ve tutkal kuruyana kadar hafif bir baskı uygulayın. Ötenazi yapılmış fareyi temiz bir cerrahi tahtaya sırtüstü yatırın ve kesici dişlerden asın. Fare derisine %70 etanol püskürttükten sonra, makas kullanarak, trakeayı görselleştirmek için küçük, yüzeysel, orta hat boyun eksizyonu yapın.
Trakeayı 20 gauge kateter ile kanüle edin ve bir mililitrelik bir şırınga kullanarak intratrakeal olarak dikkatlice bir mililitre kalsiyum içermeyen PBS ekleyin. Tam akciğer genişlemesine izin verin, ardından aynı şırıngayı kullanarak sıvıyı aspire edin. İşlemi toplam iki mililitre için iki kez tekrarlayın.
Bronkoalveoler lavajı veya BAL'ı iki mililitrelik bir alikot içine aktarın. Makas kullanarak akciğeri, kalbi ve trakeayı ortaya çıkarmak için göğüs boşluğunu açın. Diyaframı dikkatlice inceleyin ve akciğer dokusunu sıkıştırmamaya dikkat ederek göğüs kafesini çıkarın.
Kan kaybına izin vermek için abdominal aortu transekt edin. Makas kullanarak sağ ventrikülde yaklaşık bir ila iki milimetrelik küçük bir kesi yaparak ve 20 gauge kateter kullanarak beş mililitre soğuk PBS enjekte ederek akciğer dokusunu perfüze edin. Başarılı bir perfüzyondan sonra, akciğer dokusu beyaz ve soluklaşır ve PBS, intravasküler bölmeyi abdominal aorttan terk eder.
Sonra akciğeri dikkatlice çıkarın ve trakeadan çıkarın. Alternatif olarak, akciğer histoloji için kullanılıyorsa, akciğerleri formalin çözeltisi ile 25 santimetreye kadar şişirmek için 20 gauge kateteri dikkatlice yerleştirin. Akciğerler şişirildikten sonra, trakeanın altından yaklaşık beş santimetre uzunluğunda bir 3/O dikiş ipi geçirin ve formalinin akciğer dokusunda kalmasını sağlamak için iki kez sıkıca bağlayın.
Akciğeri dokuların geri kalanından nazikçe inceleyin ve 10 mililitre formalin çözeltisi içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. BAL'ı 500 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve hücresiz süpernatanı ayrı bir tüpte çıkarın. Bir dakika boyunca 100 mikrolitre lizasyon tamponu ekleyerek kırmızı kan hücrelerini parçalayın.
Bir mililitre PBS ekleyerek parçalanma reaksiyonunu nötralize edin. BAL'ı santrifüjleyin ve peleti 100 ila 300 mikrolitre PBS'de yeniden askıya almadan önce süpernatanı çıkarın. Ardından, otomatik hücre sayımı ile %0,4 tripan mavisi lekesi ile bir hücre sayımı gerçekleştirin.
Beş mililitre soğuk PBS içeren 15 mililitrelik konik bir tüpte akciğeri dokulardan nazikçe inceleyin. Diseksiyondan sonra, akciğeri PBS'den çıkarın ve bir kağıt havlu kullanarak kurulayın. Sağ ve sol akciğeri, trakea gibi çıkarılan diğer dokulardan diseke edin.
Metin el yazmasında anlatıldığı gibi bir sindirim kokteyli hazırlayın ve akciğeri bir mililitre sindirim kokteyli içeren bir C-tüpüne aktarın. Tüpü doku ayrıştırıcıya aktarın ve akciğer dokusunu işlemek için standartlaştırılmış protokolü izleyin. Ayrışmadan sonra, tüpe 10 mililitre soğuk PBS ekleyin ve uygun şekilde karıştırın.
Buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerinde 70 mikronluk bir hücre süzgeci kullanarak tek hücreli süspansiyonu filtreleyin. Süspansiyonu santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Oda sıcaklığında bir dakika boyunca bir milimetre parçalama tamponu ekleyin.
Daha sonra parçalanma reaksiyonunu durdurmak için 10 mililitre soğuk PBS ekleyin ve süpernatanı çıkarın. PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın ve otomatik hücre sayımı ile tripan mavisi lekesi ile bir hücre sayımı gerçekleştirin. Farelerde bakteriyel pnömoniye bağlı akciğer hasarından sonra, enfekte gruplar, enfekte olmayan kontrole kıyasla daha düşük vücut ağırlığı gösterdi.
Streptococcus pneumoniae veya Spn grubu, vücut ağırlıklarını taban çizgisine doğru geri kazanırken, Klebsiella pneumoniae veya Kpn ile enfekte fareler, altı günlük enfeksiyondan sonra yavaş iyileşme gösterdi. Enfekte gruplarda BAL-protein konsantrasyonu ve hem BAL hem de akciğerler için toplam hücre sayısı belirgin şekilde daha yüksekti. Her iki modelde de enflamatuar süreci gösteren temsili histolojik kesitler, Kpn ile enfekte farelerde 10. günde bile kalıcı alveolar inflamasyon kanıtı gösteren aşılamadan sonra ikinci, dört ve altıncı günlerde elde edildi.
Kpn ile enfekte olmuş fareler 10. güne kadar yaralanmaya devam ederken, Spn ile enfekte olmuş fareler altıncı güne kadar akciğer iltihabını çözdü. Altı günlük Spn enfeksiyonundan sonra çok renkli akış sitometrisi ile bağışıklık hücresi manzarası, doğal öldürücü hücreler de dahil olmak üzere granülosit, interstisyel makrofajlar, monositler, B hücreleri ve T Hücreleri sayısında artış gösterdi. Bu yöntemi denerken, kateterin yerleştirilmesi, tekrarlanabilir enfeksiyonlara sahip olmanın anahtarıdır.
Bu, akut akciğer hasarı ve çözünürlüğü çalışması için hedeflerin belirlenmesi için bir platform görevi gören güvenilir bir yöntemdir.
