Name: a non-invasive and technically non-intensive method for induction and phenotyping of experimental bacterial pneumonia in mice
Uploaded: 2016-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
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This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).

모든 실험은 동물 관리 및 NIEHS의 사용위원회의 검토 후 동물 복지법과 동물 애호 관리 및 실험 동물의 사용에 미국 공중 보건 서비스 정책에 따라 수행 하였다. K. 1. 준비 폐렴 문화 주의 : 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2) 후드 또는 다른 BSL2 지정된 지역의 모든 단계를 수행하고 연구소 BSL2 가이드 라인에 따라 폐기물을 폐기합니다. <ol><li> K.의 서스펜션 성장 폐렴, 세균의 글리세롤 주식을 해동 및 K. 1 ㎖를 전송하여 작업 문화를 접종 500 ml의 이상 플라스크에서 트립신 간장 국물 (TSB)의 50 ㎖에 폐렴 재고. </li><li> 배양 로그 상 K. 900 μl를 추가하여 글리세롤 주식을 폐렴 멸균 글리세롤 100 ㎕ 및 -20 ° C 또는 -80 ° C ~에서 동결. 장기 저장을 위해, -80 ° C 권장합니다. </li><li> s의 문화 박테리아밤새 진탕 플라스크에서 1.1 TEP - 200-225 rpm.In 로그 상 성장을 촉진하기 위해 37 ℃에서 (14-18 시간)를 아침에 50 ㎖ TSB를 함유하는 플라스크에이 밤새 배양 1-5 mL로 희석 ~ 2.5 시간 동안 진탕 37 ° C에서 다시 배치합니다. </li><li> K. 1 ㎖로 이동 2 분 동안 7,500 XG에 1.5 ML 튜브와 스핀에 마지막 단계에서 폐렴 문화. 흰색 펠렛을 볼 수 있어야합니다. 부드럽게 멸균 생리 식염수 1 ㎖에 피펫으로 박테리아를 재현 탁, 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하고 2 분 동안 7,500 XG에 다시 스핀. <ol><li> 이 세척 단계의 2 배를 수행 멸균 생리 식염수 1 ml의 최종 세척 펠릿을 가져. </li></ol></li><li> 이 깔끔한 접종의 로그 현명한 연속 희석을 수행합니다. 예를 들어, 직렬 10 -1 -10 -9 희석 시리즈를 만들기 위해 멸균 생리 식염수 3.6 ml의로 접종의 400 μl를 추가합니다. </li><li> 세척 K.의 OD 600 결정 폐렴의 1 ml에 두어1:10 1 : 멸균 식염수 제 블랭킹 일회용 큐벳하고 OD 600 (100)로 측정 희석. 정확성을 보장하기 위해 중복 측정한다. 1.0의 OD (600)는 4-7 × 10 8 CFU / ㎖와 거의 동일합니다. OD 및 CFU 사이의 관계가 / ㎖ 선형하지 않을 수 있습니다. <ol><li> K.의 농도를 계산하기 위해 희석에서 OD (600)를 사용하여 폐렴의 OD를 적용 : CFU / ㎖의 위의 변환 및 인수 분해를 희석. </li></ol></li><li> K.를 사용하여 폐렴 농도 (아래 참조) 마우스에 전달하는 &lt;100 μL 부피 원하는 접종 CFU 도즈를 제조 하였다. </li><li> 또한 10-6 -10 -9 희석액 100 ㎕ 및 RT에서 개별 트립신 대두 한천 (TSA) 플레이트 상에 멸균 생리 식염수 100 ㎕를 접시. 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하고 실험에 사용하고, 오염 제어하는 ​​정확한 농도를 계산하기 위해 박테리아 콜로니를 열거. 참고 : 최종 접종의 실제 세균 농도는 500 CFU / 흡수에 의해 예측 ml의 ± 수있다. 개인의 경험을 바탕으로 CFU / ㎖ 변환 : 경험적으로 OD 600 재조정, 마우스의 생체 내에서 사용하기 전에 파일럿 연구에서 CFU / ㎖ 관계 : 실험자는 이상적으로 OD (600)를 확인해야합니다. </li></ol> K. 2. 쥐 기관 내 (IT) 흡인 구강 인두에서 폐렴 <ol><li> 그 쥐를 확인하는 고유 꼬리 마크, 문신, 또는 기타 승인 된 식별자에 의해 식별된다. </li><li> 절차를 신속히 처리하기 위해 이소 플루 란에서 쥐를 제거하기 전에 P200 피펫을 사용하여 박테리아의 접종을 투여까지 그립니다. 그것은 열망과 최상의 결과를 얻으려면, 오버 플로우를 방지하기 위해 &lt;100 μL의 볼륨을 사용합니다. 여기서, K. 2000 CFU / 50 μl를 사용 폐렴. </li><li> 이소 플루 란 가스 (1 L / 분의 유량으로 예를 들면, 2 % 이소 플루 란)와 투명한 챔버 또는 instit 따라 마우스를 마취utional 가이드 라인. 함께 마취 된 마우스의 수는 실험자의 쾌적함 수준 한번에 전형적으로 1-2에 의해 결정된다. 호흡을 관찰하고 심호흡을 볼 수 있으며 2 ~ 3 초이 호흡 사이에 계산 될 수있다 일단 마취의 수준을 확인합니다. 주 : 휘발성 (흡입) 마취제 가능한 교란 영향에 대한 우려가있는 경우, 마취 케타민 / 자일 라진의 복강 내 주사로 대신 이루어질 수있다. 상술 한 방법에 깊은 마취는 몇 분 정도. 더 장기간 마취 유도되면, 안연고는 안구 건조를 방지하기 위해 사용되어야한다. </li><li> 마우스가 마취되면, 경사 플렉시 글라스 보드의 못 (그림 1) 사이에 뻗어 고무 밴드에서 상악 절치에 의해 중단 semirecumbent 부정사 위치에 놓습니다. </li><li> 부드럽게 P200의 pipett와 구강에 무딘 비 래치의 집게 한 쌍의 예금 복용량 옆으로 마우스 혀를 당겨이자형. 혀 또는 구강 인두 하나에 외상을 유발하지 않도록 세심한주의를 운동. </li><li> 수축 혀를 유지하면서 마우스를 흡입 할 때까지 부드럽게 장갑을 낀 손가락으로 코를 폐색. 마우스 둘 이상의 흡입제를 가지고 있으며, 어떠한 액체 구강 보이지까지 코를 덮도록 계속. 코를 커버하는 마우스는 의무적 코 숨을 쉬는만큼 마우스, 폐에 세균을 흡입 할 수 있도록하는 데 도움이됩니다. </li><li> 접종 보드에서 마우스를 제거하고 마우스가 마취에서 회복되는 동안 콧 구멍을 차단하는 침구 또는 파편을 방지하기 위해 뒷면에 마우스를 배치, 새장으로 돌아갑니다. </li><li> 일단 모든 마우스는 투여 된 마취에서 해제 한 K. 투여 된 경우에만 마우스를 포함하는 칸막이 / 방에서 집 마우스 48 시간 게시물 감염을 넘어 경우 폐렴. 체중을 포함, 매일 쥐를 모니터링합니다. </li><li> 마우스가 48을 넘어 할 수있는 경우 매일 매시 및 / 또는 보조 열을 사용하여시간. </li></ol> 3. 기관지 세척액 (BALF) 수집 및 분석 <ol><li> 제도적 지침에 따라 쥐를 안락사. 이 CO 2 흡입 자궁 전위와 관련된 폐 합병증을 피할 여기, 150 ㎎ / ㎏ 나트륨 펜토 바르 비탈 또는 방혈 다음에 상업 안락사 솔루션의 등가 선량의 독극물 주사를 사용합니다. </li><li> 뒷면에 위치 마우스와 특히 가슴과 목 영역에 70 % 에탄올로 모피를 분사하여 마우스를 소독. </li><li> 다음 집게로 흉골을 잡고, 바로 흉골 아래에 세로 컷을 확인, 닉은 폐를 허용 다이어프램은 흉강에 다시 가을. 기관을 노출, 혈관의 양쪽에 흉강을 통해 잘라 후 목을 통해입니다. </li><li> 기관이 양쪽에 세로 근육으로 둘러싸여으로 조심스럽게 같이 중간의 실수로 측면에 조직을 밀어이 기관에 혈액을 소개 할 수있는 주변의 혈관을 절단 방지 할 수 있습니다. 혈관이 다친 경우, 이전 기관 루멘에 액세스하는 거즈와 주변 지역을 청소하십시오. </li><li> 닉 기관 다운 헤드에서 길의 약 ¼을 수술 용 가위 또는 바늘을 사용하여 꼬리 쪽 기관에 1X 인산 완충 식염수 (PBS) 1 ml의 미리로드 1 mL의 주사기에 부착 된 캐 뉼러를 삽입한다. 사용 마우스는 연령이나 여성 8 주 &lt;경우, 600-800 μL에 lavaging 볼륨을 줄일 수 있습니다. </li><li> 모든 로브가 팽창하고 배를 반복, 주사기와 함께 다시 밖으로 볼륨을 풀 수 있도록 천천히 폐에 볼륨을 누릅니다. PBS는 콧 구멍에서 나오는 경우 캐 뉼러는 기관에 충분히 밀어되지 않았거나 인플레이션이 너무 빨리 발생한다. 폐이 잘 팽창되지 않은 경우 또는, 캐 뉼러 너무 멀리 밀어 된, 약간 철회. </li><li> 얼음에 15 ML 튜브에서 풀링 세척를 수집합니다. </li><li> 회전5 분 1,200 XG에 영공의 세척 유체는 1.5 ML 튜브에 뜨는 수집 및 -80 ° C에서 동결. 그 후, 단백질, 사이토 카인 등에 대한 다양한 생화학 적 분석의 측정에 뜨는 (즉, BALF)를 사용합니다. 펠렛은 기관지 공간에서 세포를 나타냅니다. </li><li> 적혈구 (적혈구)의 색상에 기초하여 세포 펠렛에서 명백한 경우, 1X PBS 5ml를 첨가하여 1 분간 ACK 용해 완충액 1 ㎖로를 Lyse는 분해 반응을 중단하고 버퍼에 희석. ACK 용해 버퍼 처리 여부 역시 동일하게 모든 표본을 처리합니다. </li><li> 스핀 셀을 5 분 동안 1,200 XG에서, 상청액을 가만히 따르다 및 1X PBS 1 ml의 세포를 가져온다. </li><li> 총 영공 세포의 열거에 대한 혈구에 소용돌이 카운트 세포. </li><li> 세포의 밀도를 바탕으로 (80 감염된 마우스 μL와 순진 마우스 ~ 150 ~)은 cytospin 원심 분리기에서 슬라이드 챔버에 약 80-150 μl를 추가합니다. 스핀 셀현미경 상으로의 세포 차동 인구를 결정하기 위해 다음 염색을 위해 슬라이드. </li><li> 세포가 하룻밤 슬라이드에 건조하도록 허용합니다. 얼룩 얼룩 2 슬라이드를 정착의 7 배, 얼룩 1에서 9 번, 7 번 찍기로 트라이 얼룩 (예를 들어, 헤마 (3) [표 참조])와 세포 (얼룩 사이에 린스), 그리고 건조 할 수 있습니다. 얼룩 건조 후, 수동으로 커버 슬립 슬라이드 및 현미경에 의한 차이를 계산합니다. 일반적으로, 호중구 및 단핵 세포 / 대 식세포는 쉽게 크기 및 핵의 형태에 의해 구별된다. </li></ol> 4. 폐 및 주변 조직에 세균 부하 결정 <ol><li> 시작하기 전에 : 폐와 비장에 대한 1X PBS 900 ㎕의 혈액에 대한 1X PBS의 90 μl를 희석 튜브를 준비합니다. 박테리아를 배양하고, 실온에서 설정 라벨 플레이트; 따라서, 조직이 수집 한 후 시간이 박테리아 성장을위한 균질화 및 도금 사이 최소화됩니다. 참고 : 인해 이종 deposi에흡인 발생할 수 있습니다 폐에 세균 기, 각각의 마우스는 총기도 세포 수 또는 총 (양자) 폐 세균 부담 중 하나의 분석을 위해 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 단계 3.1에 따라 마우스를 안락사이어서 응고를 방지하기 위하여 헤파린 튜브에 배치 좌심실로부터 혈액을 수집한다. 1X PBS 2 ㎖로 비장과 배치 제거하여 1X PBS 5 ㎖를 포함하는 15 ML 튜브의 모든 폐 로브와 장소를 제거합니다. 얼음에 튜브를 놓습니다. 각 조직 / 마우스 사이의 에탄올로 악기를 청소주의하십시오. </li><li> 바람직하게는, 각 샘플 사이에 변경 될 수 일회용 균질하여, 얼음 조직 균질화. 일회용 균질 팁 실험 사이의 재사용을 위해 멸균 할 수 있습니다. </li><li> 조직이 균질화되면, 직렬 희석 및 플레이트를 수행합니다. 플라스틱에 분할 선을 그려서 하나의 TSA 접시에 중복 주어진 조직 / 희석의 플레이트 샘플. 도금 및 디lution 제안은 다음과 같습니다 (모든 경우에, 시료 10 μl를 접시에 퍼져)과 24 시간 후 감염 부검을 기반으로합니다. 48-72 시간 샘플을 분석하는 경우, 희석 더 많은 수의 나중 시점에서 세균 부담 증가로 인한 도금 될 필요가있다. <ol><li> 혈액 - 멸균 1X PBS의 90 μL에 혈액의 10 μl를 추가하여 1:10 희석. 플레이트 단정하고 중복 1:10 희석 샘플. 혈액이 도금 된 후 10 분 사이토 카인과 케모카인의 측정을 위해 플라즈마를 추출하기 위해, 9300 XG에 잔류 혈액을 회전. </li><li> 직렬 멸균 1X PBS 900 μL로 균질화 폐의 100 μl를 추가하여 100 : 폐를 들어 - 1 - 1:10 희석. 플레이트 깔끔한 균질 중복의 모든 희석. </li><li> 비장를 들어 1 - 희석 : 10-1 : (100)를 직렬로 멸균 1X PBS 900 μL로 균질화 비장의 100 μl를 추가하여. 플레이트 깔끔한 균질 중복 모두 희석. </li></ol></li><li> 확산 샘플을 간략하게 건조 할 수 있습니다. </li&gt; <li> 밤새 정적 37 ° C 배양기에서 TSA 판과 장소를 반전. </li><li> 상기 플레이트의 양측에서 각각 희석로부터 세균 콜로니를 평균하여 정착하고 박테리아의 수를 결정한다. 폐 5 mL 및 비장 2 ml의 초기 희석의 요인은 전체 조직 CFUs를 결정합니다. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

세균성 폐렴의 쥐 모델은 폐 호스트 방어 반응에 중요한 통찰력을 제공하고, 유전자 타겟팅 및 생체 생물학 및 약리학 적 개입에 협력. 위대한 진보는 감염된 영공 10, 11에 호중구 모집을 지배하는 케모카인 및 접착 분자에 대한 우리의 이해에 특히되었습니다. 폐렴의 생체 모델을, 셀 기반 또는 대체 접근 방식과는 달리, 또한 내분비에 중요한 통찰력을 제공하고 있습?...

지역 사회 획득 폐렴은 예방 접종의 개선 및 항생제 전략 1, 2에도 불구하고 지난 40 년 동안 사망률이 거의 전반적인 변화, 미국의 감염으로 인한 사망의 주요 원인 남아있다. 보건 수준인지 진행의 부족에도 불구하고, 최근 몇 년 동안 극적인 진보 순방향 폐 감염 마우스 모델의 사용에 의해 가능하게 이러한 많은 단계와, 폐렴 분자 세포 병인에 대한 이해 만들어왔다. 마우스의 유전 취급 용이성은 쥐와 인간의 면역 시스템, 상업적으로 사용할 수있게 한 쥐의 표적 면역 시약의 광대 한 배열의 유사성은 함께 필드의 급속한 발전을 촉진했다. 문헌에 기술 세균성 폐렴의 마우스 모델은 일반적 병원균 접종 1 내지 4의 기술 경로에 의존했다 : I)을 에어로졸; ⅱ) INTRanasal 전달; ⅲ) 경구 전달; 및 ⅳ) 수술 기관 내 주입 (즉, 기관 절개술) 3. 감염의 모든 노선 장점과 단점 3 있습니다. oronasal 식물, 전신 마취에 대한 요구 사항의 혼합물 특히, 상대적으로 상부기도의 노출 가능성에서, 말초 폐에 전달 접종, 전달 된 병원균의 엽성 분포, 전문 기술 요구 사항 및 절차 사망률의 변동이 걸쳐 다양 구혼. 일반적으로 사용되는 경구 감염 기법, 또는 직접 후두 시각화 3-5 아래 &#39;블라인드&#39;(비 시각) 접근법을 통해 기관 내 (translaryngeal) 삽관을 포함한다. 두 방법 모두 강력한 반면, 상당한 훈련이 필요하며 또한 상부기도에 외상의 위험을 수행한다. 본 보고서에서, 우리는 승, 경구 감염의 기술적, 비 집약적 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명이에 박테리아 (제공된 예에서 클레 브시 엘라 폐렴)을 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐에 전달 마취 된 쥐의 구강 인두로 피펫. 우리와 다른 사람은 성공적으로 6-9 흡인 성 폐렴 기술을 사용했다. 이 다양하고 쉽게 배울 폐 배달 방법은 사이토 카인과 다른 단백질, 병원체 관련 분자 (예를 들면, 리포 폴리 사카 라이드), 셀 (즉, 입양 전송)를 포함하여 폐, 많은 추가 비 부식성 요원의 전달에 확장 될 수있다 독소 (예컨대, 블레오 마이신). 중요한 기술적 사항을 논의에 더하여, 또한 하류 세균 클리어런스 측정 (즉, 집락 형성 단위 [CFU 상기 폐 및 말초 기관에서 정량) 백혈구를 포함한 폐렴 후속 호스트 응답을 평가하는 통합 정량 방법을 설명 영공에 축적.

<table><tbody><tr><td>Klebsiella pneumoniae, serotype 2</td><td>ATCC</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic soy broth</td><td>Becton Dickenson</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4&quot;</td><td>Claflin Medical Equipment</td><td>MEDC-031122</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Solution 1</td><td>Fisher</td><td>23-122-937</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Solution 2</td><td>Fisher</td><td>23-122-952</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Fixative</td><td>Fisher</td><td>23-122-929</td><td></td></tr><tr><td>27&amp;frac12; gauge tuberculin syringes</td><td>Fisher</td><td>14-826-87</td><td></td></tr><tr><td>Lithium heparin plasma collectors</td><td>Fisher</td><td>2675187</td><td></td></tr><tr><td>L-shaped disposable spreaders</td><td>Lab Scientific</td><td>DSC</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, pH 7.4</td><td>prepared in-house</td><td>n/a</td><td>Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (5.75 g), KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 g)&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>prepared in-house</td><td>n/a</td><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl (4.145 g), KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4</td></tr></tbody></table>

a non-invasive and technically non-intensive method for induction and phenotyping of experimental bacterial pneumonia in mice

지역 사회 획득 폐렴이 중요한 공중 보건 문제로 남아 있지만, 세균성 폐렴의 쥐 모델은 최근 기본 세포 및 분자 기전에 대한 우리의 이해에 중요한 임상 발전을 촉진하고있다. 생체 마우스 모델에서 호스트 방어 반응의 통합 생리학과 탄력성을 캡처 방식은 대안, 단순화 된 생체 접근 방식에 의해 공개되지. 여러 방법 폐내 에어로졸 포함 생쥐 박테리아의 접종, 비내 전달 &#39;블라인드&#39;및 가시 조건 경구 기관 내 삽관 한 경피 기관 내 삽관에 대한 문헌에 기술되어있다. 모든 방법은 상대적인 장점과 한계가 있습니다. 여기서, 우리는 상세히 마우스로 흡입 (즉, 흡입) 관련 박테리아의 기관 내 전달을위한 비 침습적 기술적 비 집약 저렴하고 빠른 방법을 서술동안 전신 마취하에 구강 인두로 피펫 감염성 접종의. 이 방법은 비 - 부식성 생물학 및 화학 물질의 다양한 폐 전달을 위해 사용되며, 심지어 폐 절차 최소한 이전 경험 실험실 학습 비교적 쉽게 할 수있다. 흡인 성 폐렴 방법을 설명하는 이외에, 우리는 또한, 특히, 생체 내 마우스 폐 선천성 면역 반응 후의을 분석하기위한 단계별 과정을 제공하는 박테리아 간극 감염된기도의 세포 성 면역 반응을 정량화하는 방법에 관한 것이다. 폐렴 평가에이 통합 간단한 방법은 폐의 선천성 면역에 따라 유전 적, 환경 적 조작의 효과를 신속하고 강력한 평가를 할 수 있습니다.

C57BL / 6 마우스 K. 2000 CFU에 감염되었다 폐에 인두 흡인을 통해 폐렴 43816 (혈청 형 2). 이 용량에서, 마우스는 일반적으로 임상 증상을 혼수, 프릴 모피, 및 5 ~ 10 % (그림 2A)의 체중 감소를 포함하여 12 ~ 24 시간 게시물 감염을 표시하기 시작합니다. 48 ~ 72 시간의 후 감염 내에서 마우스의 대부분은 일반적으로 감소 활동 구부리고 자세에서 20 %의 체중 ...

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A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

여러 가지 방법 마우스에서 세균성 폐렴 모델링 문헌에 기재되어있다. 여기서, 우리는 구강 인두로 피펫 세균 접종의 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐렴을 유도하기위한 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명합니다. 폐 선천성 면역 반응의 평가를위한 다운 스트림 방법도 자세히 설명되어 있습니다.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

a-non-invasive-technically-non-intensive-method-for-induction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K 조회수.  National Institutes of Health.  여러 가지 방법 마우스에서 세균성 폐렴 모델링 문헌에 기재되어있다. 여기서, 우리는 구강 인두로 피펫 세균 접종의 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐렴을 유도하기위한 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명합니다. 폐 선천성 면역 반응의 평가를위한 다운 스트림 방법도 자세히 설명되어 있습니다. 

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Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

연구

면역학 및 감염병학

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

의 내부 기관 관리<em&gt; 헤모필루스 인플루엔자</em&gt; 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

면역 적격 설치류에서 강력한 폐렴 모델에 대해 항균 효능을 평가하기<i&gt; S. 폐렴</i&gt;<i&gt; H. 인플루엔자</i&gt;<i&gt; K. 폐렴</i&gt;<em&gt; P. 녹농균</em&gt; 또는<em&gt;를했다. baumannii가</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, murine models of co-infection have been the primary tool developed to explore the pathologies of both the primary and secondary infections. Despite the prevalence of this model, considerable discrepancies regarding instillation procedures, dose volumes, and efficacies are prevalent among studies. Furthermore, these efforts have been largely incomplete in addressing how the pathogen may be directly influencing disease progression post-infection. Herein we provide a precise method of pathogen delivery, recovery, and analysis to be used in murine models of secondary bacterial pneumonia. We demonstrate that intratracheal instillation enables an efficient and accurate delivery of controlled volumes directly and evenly into the lower respiratory tract. Lungs can be excised to recover and quantify the pathogen burden. Following excision of the infected lungs, we describe a method to extract high quality pathogen RNA for subsequent transcriptional analysis. This procedure benefits from being a non-surgical method of delivery without the use of specialized laboratory equipment and provides a reproducible strategy to investigate pathogen contributions to secondary bacterial pneumonia.

Here, we present methods to improve secondary bacterial pneumonia studies by providing a non-invasive route of instillation into the lower respiratory tract followed by pathogen recovery and transcript analysis. These procedures are reproducible and can be performed without specialized equipment such as cannulas, guide wires, or fiber optic cables.

이차 세균성 폐렴의 뮤린 모델을 위한 정확한 병원균 전달 및 회복 시스템

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...

Murine Oropharyngeal Aspiration Model of Ventilator-associated and Hospital-acquired Bacterial Pneumonia

Murine infection models are critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics designed to combat causative pathogens. Infectious pneumonia is among the most common infections presented by patients in the clinic and thus warrants an appropriate in vivo model. Typical pneumonia models use intranasal inoculation, which deposits excessive organisms outside the lung, causing off-target complications and symptoms, such as sinusitis, gastritis, enteritis, physical trauma, or microparticle misting to mimic aerosol spread more typical of viral, tuberculous, or fungal pneumonia. These models do not accurately reflect the pathogenesis of typical community- or healthcare-acquired bacterial pneumonia. In contrast, this murine model of oropharyngeal aspiration pneumonia mimics the droplet route in healthcare-acquired pneumonia. Inoculating 50 &#181;L of the bacteria suspension into the oropharynx of anesthetized mice causes reflexive aspiration, which results in pneumonia. With this model, one can examine the pathogenesis of pneumonia-causing pathogens and new treatments to combat these diseases.

Infectious pneumonia is among the most common infections in human. An appropriate in vivo model is critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics. With this murine oropharyngeal aspiration pneumonia model, one can examine the pathogenesis and new treatments against these deadly infections.

호흡기 관련 및 병원-획득 세균성 폐 렴의 murine Oropharyngeal 포부 모델

Murine infection models are critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics designed to combat causative ...

의학

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

직접 경포당증 주입에 의해 마우스에 있는 심각한 폐 상해를 유도하는

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic pathogen upon influenza A virus (IAV) infection. Advanced age enhances host susceptibility to secondary pneumococcal pneumonia and is associated with worsened disease outcomes. The host factors driving those processes are not well defined, in part due to a lack of animal models that reproduce the transition from asymptomatic colonization to severe clinical disease. 
This paper describes a novel mouse model that recreates the transition of pneumococci from asymptomatic carriage to disease upon viral infection. In this model, mice are first intranasally inoculated with biofilm-grown pneumococci to establish asymptomatic carriage, followed by IAV infection of both the nasopharynx and lungs. This results in bacterial dissemination to the lungs, pulmonary inflammation, and obvious signs of illness that can progress to lethality. The degree of disease is dependent on the bacterial strain and host factors. 
Importantly, this model reproduces the susceptibility of aging, because compared to young mice, old mice display more severe clinical illness and succumb to disease more frequently. By separating carriage and disease into distinct steps and providing the opportunity to analyze the genetic variants of both the pathogen and the host, this S. pneumoniae/IAV co-infection model permits the detailed examination of the interactions of an important pathobiont with the host at different phases of disease progression. This model can also serve as an important tool for identifying potential therapeutic targets against secondary pneumococcal pneumonia in susceptible hosts.

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

This paper describes a novel mouse model for the transition of pneumococcus from an asymptomatic colonizer to a disease-causing pathogen during viral infection. This model can be readily adapted to study polymicrobial and host-pathogen interactions during the different phases of disease progression and across various hosts.

바이러스 동시 감염 시 콜로니자에서 병원체로 Streptococcus pneumoniae 의 전환을 위한 마우스 모델은 연령 악화 질병을 요약합니다.

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to high morbidity and mortality. Currently, there are no pre-clinical models that recapitulate the complexity of human ARDS. However, infectious models of pneumonia (PNA) can replicate the main pathophysiological features of ARDS. Here, we describe a model of PNA induced by the intratracheal instillation of live Streptococcus pneumoniae and Klebsiella pneumoniae in C57BL6 mice. In order to evaluate and characterize the model, after inducing injury, we carried out serial measurements of body weight and bronchoalveolar lavage (BAL) for measuring markers of lung injury. Additionally, we harvested lungs for cell count and differentials, BAL protein quantification, cytospin, bacterial colony-forming unit counts, and histology. Lastly, high dimensional flow cytometry was performed. We propose this model as a tool to understand the immune landscape during the early and late resolution phases of lung injury.

This manuscript describes the establishment of an infectious model of pneumonia in mice and the respective characterization of injury resolution along with methods for growing bacteria and intratracheal instillation. A novel approach using high-dimensional flow cytometry to evaluate the immune landscape is also described.

폐렴의 해결을 평가하기 위한 실험모델

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to ...

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

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