csBN-MS tekniğinin geliştirilmesinde temel amaç, çeşitli doku ve organ türlerinin plazma zarında ve boyunca sinyal transdüksiyonunun altında yatan protein komplekslerinin organizasyonu ve montajına kapsamlı erişim sağlamaktı. csBN-MS şu anda doğal protein kompleksi ve alt birim bileşiminin analizi için, özellikle membran proteinleri açısından en yüksek çözünürlük çok yönlülüğünü sağlar. CSBN-MS tekniği kemirgen beynindeki membran protein derlemelerinin karmaşık karışımlarını analiz etmek için geliştirilmiş olsa da her türlü biyolojik numunenin analizine kolayca adapte edilebilir.
Yöntemimizin önemli adımlarından biri jel parçasının gömekonması ve dilimlemeden önce kesme düzlemine doğru hizalanmasıdır. Parçalamamaya veya jeli sıkıştırmamaya dikkat edin ve analizin çözünürlüğünü azaltacağı için kesme düzlemine eğilmediğinden emin olun. CSBN-MS tekniğimiz iyi sonuçlar için çok önemli olan birkaç pratik adıma sahiptir.
Bu adımların nasıl gerçekleştirilini ayrıntılı olarak göstermek, sadece bunları açıklamaktan daha kolaydır. Bu prosedürü başlatmak için doğrusal veya hiperbolik gözenek gradyan jel döküm bir pompa tarafından tahrik karıştırma iki odalı gradyan karıştırıcı kullanın. Metin protokolünde belirtildiği gibi ön karıştırma odası ve rezervuar odası için çözümler hazırlayın.
Karıştırıcıyı çalıştırın ve ön odadaki çözeltiye 30 mikrolitre APS ve 2,5 mikrolitre TEMED ekleyin. Sonra, pompa başlatmak ve ön vana açın. Yaklaşık bir dakika sonra, 90 mikrolitre APS ve 5 mikrolitre TEMED'i rezervuar odasına ekleyin ve oda bağlantısını açın.
Homojen bir gözenek boyutu gradyan oluşturmak için jel oda sıcaklığında en az 24 saat boyunca yavaş ve iyice polimerize izin verin. Nemli tutulursa polimerize jel bir haftaya kadar dört santigrat derecede dik olarak saklanabilir. Daha sonra, 0,5 ile 2,0 miligram protein arasında ayırmak için cam plakalar arasına uygun boşlukları ekleyerek yükleme yuvalarını hazırlayın.
Yuvalar en az üç santimetre genişliğinde olmalıdır. Çalışan tamponlar için, 50 milimolar trikin, 50 milimolar Bis-Tris ve 0.01% Coomassie G-250 oluşan ayakta katot tampon hazırlamak. 50 milimolar Bis-Tris oluşan standart bir anot tampon hazırlayın.
Yaklaşık 2,5 miligram membran ve iki mililitre islenme tamponu içeren% 1 non-denaturing deterjan buz üzerinde 30 dakika boyunca. Sonra 11 dakika boyunca 130, 000 kez G ultracentrifuge. Bir saat boyunca 400, 000 kez G ultracentrifugation tarafından kısa bir 50% 20 sakaroz adım gradyan üzerinde solubilisat konsantre.
Bundan sonra, tüpün altından sakaroz gradyanı hasat, solubilisat için% 0.05 Coomassie G-250 ekleyin ve jel üzerinde örnek yükleyin. Metin protokolünde belirtildiği gibi, üç adımlı voltaj protokolü kullanarak bir gecede 10 derece santigrat derecede preparatif bir BN-PAGE çalıştırın. Jel cam plakalar arasında tutarken dokümantasyon amaçlı jelleri tarar çalıştırdıktan sonra.
Jel ayırma kalitesini inceleyin. Sonra, plakaları sökmek ve ilgi şerit bölümleri çıkarmak. Şeritleri en az 30 dakika boyunca %30 etanol ve %15 asetik asitle iki kez düzeltin.
Gömme orta örnek aktarın ve bir orbital shaker üzerinde yavaş hareket te jel levha tutarken en az iki saat bekletin ve dengesağlar. Daha sonra, sabit jel şeritlerini protein göç cephesine veya bant desenine tam olarak paralel bölümler halinde kesin. Daha kolay kullanım için her bölümü eşit boyutlarda plastik film desteğine yerleştirin.
Şeritleri alt tan kapatılmış ve merkezi olarak üstte delikli, jel bölümünün üst ve alt uçlarıyla tam olarak hizalanmış stoperlerle açık bir tüpe aktarın. Katılaşmayı hızla başlatmak için silindiri sıvı nitrojene kısa bir süre batırın. Saydam gömme ortamı saniyeler içinde katılaşır ve beyaz renkli olur.
Boşluğu gömme ortamıyla doldurun, silindiri kısa bir süre sıvı nitrojene batırın ve eksi 20 derecede birkaç saat boyunca iyice donmasına izin verin. Sökülüp alındıktan sonra, plastik filmi çıkarın ve gömülü jel bölümü ile bloğu soğutulmuş metal silindire aktarın. Silindir çapı daha büyük ve gömme orta ile dış mühürlü.
Düz bir destek üzerine yerleştirilir. Silindiri gömme ortamıyla doldurun ve daha önce belirtildiği gibi iyice dondurun. Koplanar alt yüzeye sahip katı bir blok elde etmek için silindirin diğer tarafıyla bu işlemi tekrarlayın.
Daha sonra, silindirden blok çıkarın ve önceden soğutulmuş metal tutucu ya da yapıştırmak için gömme orta kullanın. Metal tutucuyu kriyoslik makinesine takın. Tutucu, dilimleme düzlemine göre dikkatle hizalanmalıdır.
Bloğun dilimleme işlemi için optimum sıcaklığa dengede olmasını bekleyin. Bu hasattan sonra jel 0.25 milimetrelik basamak boyutunda istenilen son kalınlıkta birbiri ardına dilimlenir ve düşük protein bağlayıcı özelliklere sahip reaksiyon tüplerine ayrı ayrı aktarılır. Daha sonra, dilimler triptik sindirim ve kütle spektrometrik analizine tabi tutulur.
Bu protokol, düşük bol proteinleri ifade eden mitokondriyal olmayan membranlara yüksek çözünürlüklü kompleksprofilleme uygulamasını genişletir. Karmaşık ayırma, çok az göç objesi olan güçlü bir şekilde lekelenmiş protein bantlarını gösterir. Peptit sinyallerinin kütle ve tutma süresindeki sapmaları, yanlış pozitif pik hacim ataması için çok düşük bir oran olduğunu gösterir.
Çalıştırıla-çalıştır varyasyonları, en yüksek hacimli veri kümelerinin yeniden ölçeklenmesiyle kolayca ortadan kaldırılır. Elde edilen peptit yoğunluğu bilgileri daha sonra göreceli bolluk 2545 protein profilleri yeniden inşa etmek için kullanılır. Protein komplekslerinin çözümü için jel örnekleme adım boyutunun önemi bitişik dilimlerin veri kümelerine katılarak değerlendirildi.
0.25 milimetre olarak, TPC1 ilişkili karmaşık popülasyonların boyut ayrımı batı leke analizi sonuçları ile uyum içinde güzel. İkiden fazla dilimin birleştirilmesi, TPC1 karmaşık alt popülasyonlarının ayrımcılığını ortadan kaldırır. Son olarak, analiz iyi karakterize kompleksleri hakkında bilgi sağlar ve yeni alt birimleri ve karmaşık derlemeler varlığını göstermektedir.
Ferritin için, göreceli bolluk için ayarlanmış alt birim profilleri farklı ağır / hafif zincir stoiyometries ile en az üç karmaşık izoformların varlığını göstermektedir. Buna karşılık, nicalin-nomo1 kompleksleri, gama-sekresyon çekirdek kompleksi ve GPI-transamidaz makine tüm boyut aralığı boyunca kendi çekirdek alt birimlerinin sabit bolluk oranları göstermek ve ek proteinler ile ilişki bağımsız. csBN-MS analizinin temel parametresi, numune biyokimyası, BN jel kalitesi, katıştırma ve dilimleme sırasında uygun hizalama ve elde edilen MS verilerinin kalitesi ile belirlenen komplekslerin etkin çözümüdür.
CSBN-MS'nin protein ve numunelerin izotop etiketlemesiyle taranması, farklı patofizyolojik, biyolojik veya gelişimsel hallerde kompleksomların doğrudan karşılaştırılmasına olanak sağlayacaktır. csBN-MS kemirgen beyin den membranlar üzerinde yapılan reseptörlerin büyük çeşitliliği ortaya, iyon kanalları, ve taşıyıcılar kendi alt birim bileşimi ve işlevleri açısından, ve yerli preparatlarda 3D yapısı analiz için etkili olacaktır.
