Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı IOS 0844948 ve 1024811 IOS tarafından desteklenen

Pratik olduğu kadar 15 ° C&#39;de tüm deniz suyu veya yapay deniz suyu (GB), yetişkin hayvanların ve kültürleri tutun. Emin olun yumurta ve zigot SW dalmış tutulur. Damıtılmış veya ters ozmoz su ile yeniden sahip ticari olarak hazırlanmış deniz tuzu SW kaynağı olarak da hizmet eder. Hidrometre kullanarak tuzluluk kontrol ve optimum düzeyde sağlamak için tuzlar veya su ayarlayın. 1,020-1,025 arasında özgül ağırlık düzeyleri tutun. Tüm cam tutun ve plasticware kimyasallar ile herhangi bir kirlenmeyi önlemek için diğer tüm laboratuvar donatımı ayrı. Deiyonize su ya da su içinde birkaç kez çalkalayın seyreltik sodyum hipoklorür ve zaman zaman ıslatma ile durulanarak temiz embriyo laboratuvar dereceli. Patiria miniata Yetişkinler 1. alınması ve olgunlaştırılması Gametler <ol><li> Gonadları çıkarılması için bir hayvan seçin. Yumurtalıkların veya testislerin varlığı bakarak çıkarıldıktan sonra seks belirleyin P. çünkü miniata se değildirxually dimorfik. </li><li> Bir bisturi (Şekil 1A) ile deniz yıldız kolun tarafındaki 1 cm&#39;den daha büyük, küçük bir açıklık, kesin. Küçük künt uçlu forseps geri kesi kenarları çekin kullanma gonad dokusu erişmek ve kesiden yumurtalık dokusu çekin. NOT: gevşek gri veya kahverengi doku (Şekil 1B) olduğu gut doku, çekerek kaçının. Testisler beyaz veya bej iken ve görünüm (Şekil 1D) sütlü veya puslanacak deniz suyu neden olacaktır bozulduğunda yumurtalıklar, tipik, turuncu, sarı veya açık kahverengi (Şekil 1C) vardır. </li><li> Akvaryuma kadın dönün. Yumurtlama neden olabilir işlenmesinin stres yana SW bir kap içinde bir veya iki saat için erkek izole. Hayvanlar kesi boyunca iyileşmek ve birkaç ay için gametler sağlamaya devam. </li><li> Mümkün olduğu kadar az SW, 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içine testisler toplayın ve kullanılana kadar buz üzerinde muhafaza edin. Bize herhangi testisler değil Mağazabir haftaya kadar 4 ° C &#39;de toplama gününde ed. </li><li> SW birkaç mililitre küçük bir cam kültürü çanak yumurtalıklar toplayın. Hiçbir büyük parça kalmayıncaya kadar forseps iki çift dokuyu ayrı kızdırmak, yumurtalık dokusundan oosit bırakın. Not: En uygun olarak, oosit kısmı tam olarak geliştirilmiştir. Böyle oosit (Şekil 2B), kahverengi, küçük grenli ve opak olan gelişmemiş oosit alt kümesi karşılaştırıldığında, büyük yuvarlak ve oosit (Şekil 2A) belirgin bir torbacığı sarı veya açık kahverengi açıktır. Oositlerin daha yaklaşık 25% &#39;den fazla gelişmemiş çeşitten ise, oositlerin elde edilmesi için farklı bir kadın seçin. </li><li> 200 um bir gözenek boyutuna sahip olan bir gözenekli filtre kap aracılığıyla oosit ve kalan doku dökün ve akışı toplamak. Bu oosit tüm çeşitleri içeren ancak yumurtalık dokusu kaldıracaktır. W püskürtme ile filtre tarafından yakalanan dokudan kalan oosit bağdakibücür şişe ith GB. Filtre bardak 50 ml konik tüp (Şekil 3A-A &quot;) kullanılarak yapılır. </li><li> 100 mikron gözenekli filtre kap aracılığıyla adım 1.6 den yoluyla akışını dökün. Akmakta olan küçük oosit atın. Filtre üzerinde kalacak olgunlaşması için hazır büyük tam gelişmiş oosit. Temiz bir 200 ml&#39;lik bir cam kaba oosit durulayın. </li><li> Oosit 200 ml&#39;lik bir cam kabın SW 95 ml ilave edilir. 10 uM&#39;lik bir son konsantrasyon 200 uM 1-metiladenin 5 ml. </li><li> 15 ° C&#39;de büyük bir sığ kültür çanak ve yere oosit aktarın. Hacim kültür tabağına bir yüksek yüzey alanlı oksijen alışverişine izin verir. Oosit olgun değil ya da bu olgunlaşma aşamasında kalabalık ise iyi gelişmemiş olabilir. Kültür az 200 oosit / ml kadar birkaç GB yemekler artı 10 uM 1-methlyadenine ayrıldı. </li><li> F oosit bu olamayacağım oosit kılacak gibi artık 45-90 dakika boyunca olgun, ama izin verertilized. Olgunlaşma tam olup olmadığını belirlemek için, bir diseksiyon kapsamında oosit bakmak. Olgunlaşma sırasında hücre zarı ile Germinal vezikül doğru hareket eder ve sigortalar. Daha sonra bozulur ve bu nedenle artık olgun oosit (Şekil 2C) görülebilir. </li></ol> Olgun OOSİT 2. Döllenme <ol><li> GB yaklaşık olarak 1 ml kültür, küçük bir cam tabak içinde testis dokusunda, yaklaşık bezelye boy, kıyma küçük bir küme seçti. </li><li> Olgun oositlerin yaklaşık 100 ml elde edilen süt, deniz suyunun 2-3 damla transferi ve karıştırmak için kültür kaplarına girdap Pasteur pipet kullanın. Testis doku parçalarını transfer kaçının. Polyspermy ve sonraki zayıf gelişmesine neden olabileceğinden spermlerin daha büyük miktarlarda ekleyerek kaçının. </li><li> Birkaç dakika sonra, bir diseksiyon kapsamında oosit gözlemlemek. Döllenmiş yumurta veya zigot, cel kapalı yükselir net bir kabarcık bir gübreleme zarf varl membran (Şekil 2B). NOT: kötü fertilizasyon oranları da iyi gelişmemiş olabilir sağlıksız bir kültürün bir göstergesi olduğundan yumurta az 90 civarında daha% döller eğer kültürü ile devam etmeyin. </li><li> Döllenme işlemi tamamlandıktan sonra, 100 mikron gözenekli filtre içinden dökülmesi ve taze yazılımı ile bir kültür kabı içine durulanarak zigot üzerinde verilmeksizin değiştirilebilir. Bu oksijen açlığı önlemek için fazla sperm kaldırmak için önemlidir. 15-30 dakika boyunca 15 ° C &#39;de kültür tabağına yerleştirin. </li></ol> 3. De-jelleştirici ve Kürek döllenmiş yumurta <ol><li> 60 x 15 mm polistiren Petri kabı kapağı alarak enjeksiyon yemekleri hazırlayın. <ol><li> Mikroenjeksiyon mikroskop görüş alanını eşleşen alanı çevresinde yemeğin arkasında, üzerinde kalıcı bir işaretleyici kalem çizgi çizin. Bu, tüm embriyolar sıralı görüş alanı içinde mikroskop olmasını sağlar. </li><li> Daire, p bir çizgi puanı bir cam Pasteur pipet kullanınreferably daire (Şekil 3B) bir tarafında kapalı. Enjeksiyon iğneleri (4.5 Adım) kırmak için daha sonra bu hattı kullanın. Not: Reaktifler genellikle deniz kestanesi embriyolar, örneğin, protamin sülfat ya da poli-L Lisin, gereksiz yapıştırmak için kullanılan. P. De-jöleli miniata zigot kaplanmamış plastiğe çok iyi sopa. Onlar cam yemekler iyi sopa unutmayın. </li></ol></li><li> Kaplanacak yüzey olması ve böylece her bir çanak yaklaşık 10 mi GB ekleyin, ancak bu embriyolar bozmakta sıralı olabilir su çanak aşırı sıçrama olmaz. </li><li> P. çıkarın önce kürek çekme asit SW ile miniata zigot jöle ceket. Bu jöle ceket modeli deniz kestanesi türleri için gözlenen daha kapsamlıdır. <ol><li> PH 4,0-4,2 aralığında asit SW hazırlayın. PH değeri, normal gelişim izin verecek şekilde jel kaplamanın etkin şekilde çıkarılmasını sağlamak için çok önemlidir. </li><li> GB 1 L&#39;lik bir stok SW içinde 1 N (1 M) tek HCI damla ekleyin. Her damla tamamen karıştırmak için izin verve daha HCI ilave edilmeden önce pH izlemek. NOT: Uygun pH HCl sonuçlarının birçok ml biri, ancak bir kerede tüm hacmi eklemeyin. NOT: SW ile davlumbaz 1 N HCI hazırlayın ve 12 N (12 M) HCI. </li><li> 100 mikron gözenekli filtre üzerine onları dökerek zigot üzerinde SW çıkarın. (Yaklaşık 10 mi) mümkün olan en küçük SW miktarda bir 200 ml&#39;lik bir cam kaba durulayın. Asit SW (pH 4,0) ile 150 ml beher kadar doldurun ve zigot 3 dakika boyunca asit SW oturmak için izin. </li></ol></li><li> Iki adet 200 ml&#39;lik çanaklar arasında ileri ve geri onları dökerek zigotlardan jöle ceket şerit, 200 mikron mesh filtre üzerinden zigotların geçen her zaman. Bir 2 dakikalık bir zaman penceresi üzerinde 5-10x çevresinde filtre içinden zigotların dökün. </li><li> 100 mikron gözenekli filtre üzerine zigotların dökerek asit SW çıkarın. SW ile küçük bir cam kültürü çanak içine zigotların durulayın. De-jöleli zigot plastik tabaklar yapışabilir. Satır embriyolar derhal; daha j üretmeye başlarzamanla plastik tabaklar zayıf yapışmasına yol açar kedward ceket. </li><li> Cam kültürü çanak zigotların pick up ve enjeksiyon yemekleri düz çizgiler içine yerleştirmek için bir ağız pipet (Şekil 3C-C &#39;) kullanın. Cam, yumuşak kadar bir alev üzerinde bir Pasteur pipeti ince yan merkezini eritin. Hızlı bir cam çok ince esneme elde etmek için ayrı cam uçlarını çekin. Cam soğuduktan sonra, (bir ağız pipet Wessel ve arkadaşları görmek hazırlama hakkında ek bilgi için., 2004 17 Sweet ark. 2004 18) Pasteur pipet küçük ucunu kesiyorum. <ol><li> Sadece tek bir zigot girerek bir seferde pipet çıkış böylece çapı, embriyoların çapından biraz daha büyük olan bir kürek pipet hale getirmektedir. Bu, tek bir sıra oluşturacak şekilde izin verir. Küçük çaplı pipetler döllenme zarfı şerit ve P. gibi zigotların bozabilir miniata zigot hiyalin membran a yoknd oldukça yumuşak. </li><li> Zigot plastik tabak sopa yoksa, ek süre asit SW (birkaç dakika daha kadar) için saklayın. Alternatif olarak, daha küçük çaplı bir pipet zigotlar daha etkili bir şekilde yapışmasına izin vermek için jöle katı çıkartılmadan yardımcı olabilir. </li><li> Zigot biraz olumlu batmaz ve yüzer ya da sadece yemeğin alt yukarıda hover eğiliminde. Zigotlar nazik bir pipet (Şekil 3D) çıkar çıkmaz, çanak yüzeyine bastırılır, böylece bu durumda kürek pipet yerleştirin. NOT:. Bu yemekler birçok satır sığdırmak için izin olan P. miniata embriyonik membranlar zamanla nüfuz daha zor hale gelmez ve bu nedenle tek bir tek tabak üzerinde zigot yüzlerce enjekte edebilir. </li></ol></li></ol> Zigotlar 4. Enjeksiyon <ol><li> Final konsantrasyona uygun morfolino antisens oligonükleotitlerin konsantrasyonları (MASO), mRNA ya da enjeksiyon çözeltileri DNA&#39;lar ile hazırlayın200 mM KCl entration. 400-800 uM MASO ve DNA, 2.5 ng / ml toksisiteyi en aza indirirken, morphant fenotipleri üretme eğilimindedir. Yumurta nihai konsantrasyonu, bir başlangıç ​​konsantrasyon 14. 1/125 olur. 5 dakika boyunca 65 ° C&#39;ye kadar Masos ısı ihtiva eden enjeksiyon çözeltileri için kullanımı ve daha sonra oda sıcaklığında saklamak için hemen önce. <ol><li> Enjekte edilen embriyolar sıralama kolaylığı için,% 0.1 lik bir konsantrasyon elde etmek için enjeksiyon solüsyonu için rodamin dekstran izleyici ekleyin. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre çekme aracı, bir iğne cam kılcal boru (1,0 mm dış çaplı x 0.75 mm İÇ, 100 mm uzunluk) çekerek enjektör hazırlayın. Deniz kestanesi enjeksiyon için uygun iğneler de deniz yıldızları için iyi çalışabilir, böylece benzer parametreleri 19 kullanın. </li><li> Bir Microloader pipet kullanarak bir enjeksiyon iğnesi içine enjeksiyon solüsyonu yaklaşık 2 ul yükleyin. </li><li> M içine iğnenin künt ucunuanipulator. Set 100 milisaniye darbesine Picospritzer ve 40 psi hava basıncı. </li><li> Mikroskop sahneye sıralı embriyoların bir tabak koyun ve görüş alanındaki tüm embriyolar var. Atılan hattı iğneye yakın tarafında olacak şekilde çanak yönlendirilir. Uç hattının ortasına yakın ve sadece su yüzeyinin üstünde olacak şekilde yaklaşık 60 ° &#39;lik açı iğne yerleştirin. </li><li> Atılan hat odaklanın ve ucu odak noktası haline gelene kadar iğne düşük. Biraz daha ipucu indirin ve attı hattının sırtlar içine hafifçe çalıştırarak açık ara. Çanak yüzeyinden ucu kaldırın ve zigot ilk satırının üstünde konumlandırmak ve zigot odaklanmak. </li><li> Bir 60 ° bir açıda gelen zigotun merkezi impale sağlayacak şekilde ucu aşağı indirin. İğne kolayca P. nüfuz miniata zigot. Enjeksiyonundan bir bolus tanıtmak için ayak pedalı (veya enjeksiyon iğnesi malzeme zorlayarak diğer araçlarla) adımembriyo ölü m çözeltisi. </li><li> % 20-30 embriyo çapı ya da 25 ile 80 pl bir bolus nişan. Bolus bundan daha büyük veya daha küçük ise, Picospritzer üzerinde enjeksiyon süresini ayarlamak ve sonraki embriyo enjekte edilir. İstenen bolus boyutu elde etmek süresini ayarlamak için devam edin. 100 msn süresince başlayın. Yaklaşık 200 milisaniye daha büyük uygun hapını tanıtmak gerekirse iğne Yeniden bölünürler. İğneyi atın ve en az 15-20 msn iğne boyutu çok büyük olduğu gibi bu hap boyutu elde etmek için gerekli ve normal gelişimini bozabilir, yeni bir tane hazırlayabilirsiniz. </li><li> Enjeksiyon yemeğin kalan zigotların enjekte edin. Embriyolar kolayca bölünme başlayana kadar ve ilk bölünmesinden sonra tek blastomer içine enjekte edilebilir. Periyodik olarak, iğne yapışmazlar, zigotların kaldırmak için su yüzeyinin üzerinde iğne kaldırın. Gerekli iğne ucu yeniden kırmak ya da bir tıkanma meydana gelirse yeni bir iğne yüklerseniz. </li></ol><ol><li> Embriyolar SW 15 ° C&#39;de geliştirmeye olanak sağlar. Oksijen alış verişine olanak sağlamak için, kültürler içinde hacme büyük bir yüzey alanına koruyun. Embriyolar kalabalık değil emin olun; veya 200 embriyolar / ml altında kültürleri tutun. Embriyonun istenilen aşamaya bağlı olarak, yaklaşık 20-24 saat sonrası döllenme enjekte embriyolar toplamak planlıyoruz. NOT: Bu genellikle sıralamak ve normal gelişen embriyo kolayca morfolojik ayırt edilir, ancak henüz yüzme olmadığından toplamak ve ideal bir zamandır. </li><li> Embriyolar yumurtadan varsa, yavaşça yüzme önlemek için şok tuz. SW yavaşça girdap şeklinde sallandı enjeksiyon çanak GB 10 ml 5 M NaCI 200 ul ilave edin. Bir kaç dakika sonra, embriyolar yemeğin altına düşecek. Bu toplayın ve normal tuzluluk SW taşıyabilirsiniz. </li><li> Injecti kullanılan izleyici ile uyumlu uygun bir floresan ışık kaynağının altında enjekte embriyolar toplayınçözüm üzerinde. Hiçbir izleyici kullanılmışsa, sıralama embriyolar normal morfolojiye seçmek için. </li><li> Ağız pipet kullanarak, SW asgari bir miktarı ile embriyolar floresanlama çekmek ve SW ile dolu küçük bir kültür çanak içine üfle. İdeal ağız pipetler embriyolar onlara zarar vermeden ve dışarı çıkardı, ama istenmeyen embriyolar ve yabancı GB da yukarı çekti, böylece büyük olmamak için yeterince büyük bir açılış var. </li><li> Bir kez istenen tüm embriyoların yeni bir çanak içine toplanmıştır, floresan ışığı altında embriyoların gözlemlemek ve herhangi bir un-enjekte edilen embriyolar veya az gelişmiş embriyolar kaldırmak. </li><li> Kültür bir kuluçka istenen aşamalarında embriyolar sıralanır ve görüntüleme veya diğer istenen protokolleri ile devam edin. </li></ol>

<ol><li>Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+fluorescence+in+thick+specimens%2C+with+an+application+to+cyclin+B-GFP+expression+in+starfish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell+Auspices+Eur.+Cell+Biol.+Organ%22%5BJournal%5D)">Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes.</a> Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).</li>
<li>Terasaki, M., Runft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-stage+dependence+for+1-methyladenine+induced+reinitiation+of+meiotic+maturation+in+starfish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes.</a> Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).</li>
<li>O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+multiple+Src+family+kinases+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization.</a> J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).</li>
<li>McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+wnt+and+frizzled+genes+during+early+sea+star+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns+GEP%22%5BJournal%5D)">Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development.</a> Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).</li>
<li>Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+network+for+neurogenesis+in+a+sea+star+embryo+connects+broad+neural+specification+and+localized+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).</li>
<li>McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+embryonic+skeletogenic+mesenchyme+lineage+in+a+sea+cucumber+reveals+the+trajectory+of+change+for+the+evolution+of+novel+structures+in+echinoderms%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms.</a> EvoDevo. 3, 17(2012).</li>
<li>Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+cluster+and+chordate-like+expression+of+ParaHox+genes+in+a+sea+star%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star.</a> BMC Biol. 11, 68(2013).</li>
<li>Morino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+activation+of+VEGF+signaling+and+the+evolution+of+the+skeleton+in+echinoderm+pluteus+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Dev%22%5BJournal%5D)">Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae.</a> Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).</li>
<li>Hart, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+evolution+of+the+sea+star+egg+receptor+for+sperm+bindin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin.</a> Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).</li>
<li>McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergence+genetics+analysis+reveals+historical+population+genetic+processes+leading+to+contrasting+phylogeographic+patterns+in+co-distributed+species%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species.</a> Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).</li>
<li>Keever, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discordant+distribution+of+populations+and+genetic+variation+in+a+sea+star+with+high+dispersal+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Int.+J.+Org.+Evol%22%5BJournal%5D)">Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential.</a> Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).</li>
<li>Lambert, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLambert%2C+P+%22Sea+Stars+of+British+Columbia%2C+Southeast+Alaska%2C+and+Puget+Sound%22">Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound</a>. , UBC Press. (2000).</li>
<li>Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+control+of+meiosis%3A+specificity+of+the+1-methyladenine+receptors+in+starfish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).</li>
<li>Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+gene+regulatory+network+architecture+across+500+million+years+of+echinoderm+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).</li>
<li>Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+evolutionary+act%3A+precise+cis-regulatory+basis+of+difference+in+the+organization+of+gene+networks+of+sea+stars+and+sea+urchins%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins.</a> Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).</li>
<li>McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+gene+regulatory+network+subcircuit+drives+different+developmental+fates+in+the+vegetal+pole+of+highly+divergent+echinoderm+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos.</a> Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).</li>
<li>Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+and+handling+echinoderm+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Obtaining and handling echinoderm oocytes.</a> Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).</li>
<li>Sweet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastomere+isolation+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Blastomere isolation and transplantation.</a> Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).</li>
<li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).</li>
<li>Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantropic+retroviruses+as+a+transduction+tool+for+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).</li>
</ol>

Çıkar çatışması yazarlar tarafından ilan edilmiştir.

Bu tekniğin acemi kullanıcılar için zor ama başarıyla morphant embriyolar oluşturmak için gerekli olan iki kritik adımlar vardır. İlk olgun ve düzgün döller sağlıklı oosit seçmektir. Bir kültürde normal gelişim yüzdesi mevsime göre, hayvanın sağlığını ve oositler tek bir bireysel, hasat edilen sayısıdır. Oositler Ekim ile Nisan arasında daha kaliteli olma eğilimindedir. Bu çoğunluk Şekil 2A yerine Şekil 2B gibi bakmak emin geçmeden önce oosit dikk...

(Yaygın yarasa yıldızı olarak da bilinir), deniz yıldızı, Patiria miniata, bir 6 8 evrimsel 4,5 gelişim hücresel 1- 3 çeşitli, ve ekolojik çalışmalar 9 11 için ilginç ve çok yönlü bir model sistem olarak ortaya çıkmaktadır. Yetişkin P. miniata Baja California 12 Sitka, Alaska pasifik kıyılarında dağıtılır ve kolayca deniz akvaryumunda tutulur. Oositler elde yıl boyunca ve her kadın onlarca yumurta binlerce tutabilir. Oositler kolayca olgunlaştı ve dıştan 13 döllenir. Oluşan embriyolar kolay gözlem için izin şeffaf; onlar eşzamanlı geliştirmek ve geliştirme için sadece deniz suyu gerektirir. Tüm genom düzeneği ve çok sayıda transcriptomes, P. mevcuttur miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Bu avantajlar araştırma aralığı için ideal hale getirmektedirve öğretim amaçları. Son yıllarda, S. miniata gelişim düzenleyici gen şebekesi için bir model sistem 14-16 analiz haline gelmiştir. Bu tür çalışmaların amacı, düzenleyici genlerin tüm iltifat belirlemek ve bunların etkileşimlerinin ağı belirlemektir. Bu çalışmaların çoğu antisens oligonükleotidlerinin ya da in vitro sentezlenen mRNA ile tanıtım yoluyla perturbe gen ifadesini gerektirir. Buna ek olarak, sis düzenleyici analizler düzenleyici DNA 15 işlevini karakterize etmek için kullanılır. Bu analizler karışıklık reaktifler ve / veya DNA muhabiri embriyolara inşa tanıtılması gerektirir. Ayrıca, bu düzensizliklerin bir aşağı akış etkisine karakterize etmek için, bir potansiyel hedefler, gen ekspresyonunda değişmeler için çok sayıda embriyolar tahlil gerekir. Zigot yüzlerce mikroenjeksiyon teknikleri bu işin merkezindedir. P. dahil derisidikenliler miniata </em&gt;, cinsel olgunluğa ulaşmak için birçok ay gerektirir. Bu nedenle, geliştirilmesi ve bu deneysel hayvan transgenik çizgiler korumak için genel olarak pratik değildir. Bu nedenle, transgenik yetişkinlerin üreme verimli embriyolar modifiye oluşturabilirsiniz olamaz. Bunun yerine, pertürbasyon mikroenjeksiyon yoluyla de novo gerçekleşmesi gerekir. Mikroenjeksiyon hücre geçirgen olmayan reaktif ile embriyolar değiştirmek için bir fırsat sunuyor. Aşağıdaki protokol, bir 2-3 saat mikroenjeksiyon yoluyla oturma döllenmiş yumurta yüzlerce DNA, mRNA, hücre izleyiciler ve morfolino antisens oligonükleotitlerin bir yöntemi tarif etmektedir. Bu gibi akış aşağı deneyler çeşitli için yeterli malzeme oluşturur, ancak in situ hibridizasyon, RNA sekansına ve Western blot ile, QPCR ancak bunlarla sınırlı değildir.

<table><tbody><tr><td>1-Methyladenine</td><td>Acros Organics (Fisher Scientific)</td><td>AC20131-1000</td><td></td></tr><tr><td>190 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0185-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>100 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0105-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing</td><td>FHC, Inc</td><td>30-30-0</td><td>For pulling microinjection needles</td></tr><tr><td>Model P-97 Needle Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Rhodamine Green</td><td>Life Technologies</td><td>D7163</td><td>If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Also available in many pet stores</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr></tbody></table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Echinoderms uzun gen düzenlemesi ve gelişimsel süreçlerinin evrim çalışma için daha yakın üreme ve gelişme çalışmaları için bir favori model sistem olmuştur ve. Deniz yıldızı Patiria miniata önce deniz kestanesi, Strongylocentrotus purpuratus ve Lytechinus variegatus hemen hemen sadece çalışmalar yapılmıştır Bu tip bir model sistem olarak yaygınlık kazanmaktadır. Bu model sistemler bir avantajı da, belirli bir genin veya aşağı regüle kadar olan bir grup hücre etiketleme ya da bir raportör genin modifiye edilmiş embriyoların üretilmesi kolaylığıdır. Tek bir yöntem, modifiye edilmiş mikro-enjeksiyon embriyo çeşitli oluşturma yeteneğine sahiptir. Burada, P. gamet elde edilmesi için bir yöntem sunulmaktadır miniata, zigot üreten ve mikroenjeksiyon yoluyla perturbe maddeleri eklemek. Sağlıklı morphant embriyolar bundan sonra ge nicel ve nitel çalışmalar için izole edilmiştirne fonksiyonu. Bu organizma için genomu ve transkriptom verilerin mevcudiyeti uygulandı ve gerçekleştirilmesinden kolaylığı olan çalışmalar türlerini artmıştır.

Bu protokolün amacı, embriyo içine reaktifler tanıtmaktır. Bu, yeşil floresan proteini (GFP) ekspresyonunu tahrik eden bir raportör konstruktunu bir DNA enjekte edilerek protokol etkinliğini göstermektedir. DNA bölünmesi sırasında ilk olarak birleştiren Enjekte embriyolar klonal yamalar (Şekil 4A-B) GFP ifade eder. Embriyoların içine uygulanması tercih edilmekte olan birçok reaktif maddeler, yüksek miktarlarda ve embriyo optimal gruplar için toksiktir. , Gelişimini geciktirmek döl...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes at JoVE.com

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Morphant embriyolar üretme yöntemleri gelişim düzenleyici mekanizmalarının ve gen ağları incelemek için gereklidir. Deniz yıldızı Patiria miniata bu çalışmalar için gelişmekte olan bir model sistem. Burada bir embriyo kültürleri, gamet elde üretmek için protokol ve bu türlerden zigot hızlı mikroenjeksiyon sunuyoruz.

Mikroenjeksiyonu Bir Yöntem<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Zigotların

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

a-method-for-microinjection-of-patiria-minata-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

11.0K Görüntüleme.  Carnegie Mellon University.  Morphant embriyolar üretme yöntemleri gelişim düzenleyici mekanizmalarının ve gen ağları incelemek için gereklidir. Deniz yıldızı Patiria miniata bu çalışmalar için gelişmekte olan bir model sistem. Burada bir embriyo kültürleri, gamet elde üretmek için protokol ve bu türlerden zigot hızlı mikroenjeksiyon sunuyoruz. 

Video: A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Lazer destekli Hayvancılık Zigotlann Sitoplazmik Mikroenjeksiyon

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Genetik

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biyoloji

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Gelişim Biyolojisi

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Farelerde gen kaseti knock-in ve flox alelleri oluşturmak için zigot mikroenjeksiyonu

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Deniz Kestanesi Zigotlar Yüksek Randımanlı Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

Mikroenjeksiyonu Bir Yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet