Bu teknik, kriketin embriyonik veya larva gelişimini teşpetmek için tasarlanmış deneyler için temel bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Bu tekniğin en büyük avantajı esnek olması ve RNA girişim veya genomik manipülasyon kullananlar gibi çeşitli deneysel yaklaşımları desteklemesidir. Prosedürü gösteren Hadley Wilson Horch, laboratuvarda baş araştırmacı olacaktır.
Bu prosedüre başlamak için damlama su ile beveler iplik öğütücü düzlemi ıslak. Çekilen iğneyi bevene yerleştirin ve 20 derecelik bir açıya çevirin. İğneyi öğütme plakasına değene kadar indirin ve 2-3 dakika yaslayın.
Bir cam mikroskop slayt yapıştırılmış olan çift sopa bant üzerine yaslı iğne yerleştirerek bevel değerlendirin. Slaytı, kamera ve görüntü edinme yazılımıyla donatılmış bileşik bir mikroskobun sahnesine yerleştirin. 20x hedefi kullanarak iğne nin görüntüsünü elde edin.
İğnenin iç lümen çapını ölçmek için görüntüleme yazılımını kullanın. Sekiz mikrometreden daha küçük veya 12 mikrometreden daha büyük bir açıklık olan iğneleri atın. İlk olarak, suda% 1 agarose 40 mililitre yapmak ve 10 santimetre Petri kabına dökün.
Katılaşmadan önce agarose yüzeyine bir yumurta kuyusu damgası yerleştirin. Agarose katılaştırıladıktan sonra, kuyuları ortaya çıkarmak için damgayı çıkarın. Daha sonra agarose iyi plakayı %1 penisilin streptomisin içeren HBS ile doldurun.
Yemeğin kapağını yerleştirin, Parafilm'e sarın ve dört santigrat derecede saklayın. Bundan sonra, kriket ler için yumurta koymak için bir yumurta toplama çanak yapmak için beyaz oyun kum ile 35 milimetrelik Petri çanak doldurun. Yaklaşık 18 tarafından 18 santimetre kesilmiş bir kağıt havlu kare ile yumurta çanak kapağı.
Kağıt havlu ile musluk suyu ile doldurun. Sonra, Petri kabını yatırın ve fazla suyu çıkarmak için üstçe hafifçe sıkın. Çanak altında kağıt havlu kare köşelerini tuck ve yerinde kağıt havlu tutmaya yardımcı olacak bir ters kapak içinde yumurta çanak yerleştirin.
Kriket kutusuna yumurta çanak yerleştirin ve yetişkin kadın bir ila iki saat boyunca yumurta oviposit sağlar. Bu arada, agarose çanak enjeksiyon için yumurta tutmak için hazırlık oda sıcaklığına ısınmak için izin verin. Hazır olduğunda, kriket kutusundan taze yumurtlu yumurtluyon içeren yumurta toplama kabını çıkarın.
Kağıt havlu çıkarın ve bir beher üzerinde 0,5 ve bir milimetre arasında bir gözenek boyutu ile bir süzgeç yerleştirin. Yavaşça akan musluk suyu altında süzgeç içine yumurtlama çanak içeriğini durulayın. Kriket yumurtaları süzgeç sepetinde kalırken kum taneleri süzgeç örgüsünün içinden aşağıdaki kabın içine düşecektir.
Ters ozmoz suyu ile bir kap doldurun ve bir tepsiye yerleştirin. Süzgeci kabın üzerine ters çevirin ve yumurtaları suya çıkarmak için çanağa dokunun. Yumurtalar kabın dibine batar.
Daha sonra, çapı yaklaşık üç milimetre lik bir açıklık yapmak için bir P1000 pipet ucu kapalı ucu kesmek için makas kullanın. Bir P1000 pipetter bu ucu yerleştirin ve agarose yumurta kalıpları çanak için konteyner yumurta aktarmak için kullanabilirsiniz. Plastik cımbız kullanarak, agarose kuyularında yumurta sıraya.
Her yumurta bir kuyunun dibine batar. Petri kabını enjekte etmeye hazır olana kadar bir kapakla kapatın. Başlamak için, diseksiyon mikroskobu altında yumurta çanak yerleştirin ve yaklaşık 10x düşük büyütme seçin.
20 mikrolitre yükleme uçları ve P10 pipetkullanarak 1,5 mikrolitre enjeksiyon çözeltisi çizin ve yükleme ucunu enjeksiyon iğnesinin geniş ucuna yerleştirin. Enjeksiyon çözeltisini enjeksiyon iğnesine at. İğneyi enjeksiyon gövdesine takın ve sıkın, iğnenin gövdeye düzgün ve sağlam bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
Daha sonra enjeksiyon gövdesini mikromanipülatöre dikkatlice takın, iğneyle kırılmamaya veya yaralanmamaya dikkat edin. Hem yumurtaya hem de iğneye mikroskoptan bakarken, iğneyi çanak ızgaranın sol üst köşesindeki X'e yakın hareket ettirin. Ucu HBS artı penisilin streptomisin kabına tamponlu çözelti girene kadar iğne düşürün.
İğneyi görüş alanında ortalayın ve yumurta kabını hareket ettirin, böylece iğne yemeğin kenarına yumurtalardan birkaç milimetre daha yakın dır. Bundan sonra mikroskobu Rhodamine'nin iğnedeki floresangözlemlemesi ve ucuna odaklanması için uygun filtreye ayarlayın. Mikroenjektörde, enjeksiyon çözeltisi iğneden süspansiyon çözeltisine sızmaya başlayana kadar denge topuzlarını saat yönünde yavaşça çevirin.
Daha sonra boya sadece iğne dışarı sızıntı durur kadar biraz saat yönünün tersine geri düğmeyi açın. İğne hala görüş alanında ortalanmış ile, iğne ilk enjekte edilecek yumurta hedefleniyor böylece yumurta çanak hareket ettirin. Tek bir yumurta görüş alanının çoğunu dolduracak şekilde büyütmeyi yaklaşık 50x'e ayarlayın.
İğneyi enjeksiyon için pozisyona sokmak için hem mikromanipülörü hem de elini yumurta kabında kullanın. İğneyi ilerletmek için mikromanipülörü kullanın ve ucunu enjekte edilecek ilk yumurtaya takın, yumurtanın arka ucundan yumurtanın arka ucundan yumurtanın uzun eksenine doğru 20 ila %30 oranında iğne yi takın. Çözeltiyi enjeksiyon ayak pedalı veya mikroenjektörüzerindeki enjeksiyon düğmesi ile enjekte edin.
Yumurtanın içindeki küçük bir floresan madde bolusu başarılı bir enjeksiyona işaret eder. Bundan sonra, yumurtadan iğneyi geri çek. Yumurta, iğnenin geri çekilmesi üzerine istemeden kuyusundan çıkarılırsa, iğneyi geri çekerken yumurtayı kuyuya geri itmek için küçük forsepsler kullanın.
Bu çalışmada, kriket yumurtaları, RNA paraziti ve genomik manipülasyon dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok deneyde temel bir yöntem olarak hizmet veren bir teknik kullanılarak enjekte edilmektedir. Hayatta kalma oranı bu deneyin başarısını değerlendirmek için önemli bir parametredir. Yumurtanın içindeki yumurta ve embriyonik doku düzensiz bir şekilde kümelenmeye başladığından ve sonunda sarının çoğu yumurtanın bir tarafına göç ederken, ölü yumurtaların çoğu kolayca görülebiliyor.
Dört ila altı gün sonra değerlendirildiğinde, enjekte edilmemiş yumurtaların %85'inden fazlası hayatta kalırken, deneysel reaktiflerle enjekte edilen yumurtaların sağkalım oranı genellikle daha düşüktü. İğne delinmesi, boya ve tampon un piyasaya sürülmesi veya aracın varlığı veya çift iplikli RNA'nın bulunması da dahil olmak üzere enjeksiyonun tüm yönlerini kontrol etmek, deneysel manipülasyon girişiminin gerçek etkilerini anlamak için gereklidir. Enjeksiyonun phenotipik sonuçlarını değerlendirme şekli, enjekte edilene bağlıdır.
Örneğin, belirli mRNA knockdowns bir sonucu olarak henotik değişiklikler brüt anatomi düzeyinde belirgin olabilir. Öte yandan bir EGFP kodlayan bir cDNA bir G.bimaculatus actin organizatörü kontrolü altında histon 2B geni etiketli piggyback transposase kullanarak kriket genomuna yerleştirilir, egfp etiketli hist 2B protein heyecanlandırmak için floresan kullanarak yumurta her çekirdek görselleştirmek mümkün olur. İğnelerin tıkanmamalarını sağlamak bu işlemde kritik bir adımdır.
Sarısı bazen iğne ucunu tıkadığı için sonraki enjeksiyonlardan sonra birkaç ayarlama yapmanız gerekebilir. Kriket, Drosophila gibi iyi çalışılmış holometabolöz böceklere bazal olarak dallayan hemimetabolöz bir böcektir. Kriket gelişimi üzerinde çalışmak, hayvanlar alemindeki evrim ve gelişim hakkında daha fazla bilgi edinmemize yardımcı olacaktır.
Bu teknik bazı pratik alır. Enjeksiyondan 4-5 gün sonra sağkalım oranı en az %80 olana kadar kontrol enjeksiyonları uygulamanızı öneririz.
