Work related to this technique is supported by NIH/NICHD RO1 HD070044 and USDA/NIFA Hatch projects W-3171 and W-2112.

1. Mikropipet Üretimi <ol><li> enjeksiyon mikropipet <ol><li> borosilikat cam kapiller (: 1,0 mm, iç çapı (ID): dış çap (DÇ) 0.75 mm) koyun, bir mikropipet çektirmenin (sağ ve sol kılcal sahipleri merkezinde) ve kilitleyin. </li><li> uzun uzantılar ile ince ucu ile sonuçlanır böylece cam kapiller çekmek için uygun bir program kullanın. (Örnek: Isı: 825; çekin: 30; Hız: 120; Süresi: 200; Basınç: 500). </li><li> Dikkatle cihazdan çekti pipetler kaldırmak ve yatay konumda bir microforge üzerine yerleştirin. </li><li> çekti pipet ve odak noktası haline cam boncuk ile Microforge ısıtıcı iplik getir. İstenilen kalınlığı ölçümü ve ısıtıcı Filament hedef iç çapı (5 mikron) ulaşıncaya kadar yatay pipet taşımak için mercek reticle kullanın. </li><li> yaklaşık% 45 ısı ayarlama ve filamanın dokunur şekilde hafifçe aşağı pipet getirmek. kısaca ısıtıcı etkinleştirin. Bu Whasta hafifçe filamanın yapışır, böylece pipet eritmek ve soğutma üzerine, pipet düz bir kesim üreten temas noktasında kıracak. Not: Çok yüksek sıcaklıklar pipet bend yapacak ve böylece düz bir kesim mümkün olmayacak ve çok düşük sıcaklıklarda pipet (Şekil 1A) eritmek için yeterli olmayacaktır çünkü uygun sıcaklık ayarı bu adımda anahtarıdır. </li><li> Isıtıcı filament yaklaşık 10 mikron uzak konumlandırarak pipet yakın yaklaşık 30 ° açı yapar. % 60 sıcaklığını ayarlamak ve ısıtıcı etkinleştirin. Not: Bu filament üzerinde pipet viraj. Bu açı, enjektör (Şekil 1B) içine monte edildiğinde iğnenin ucu püskürtme plakasının yüzeyine paralel olacak şekilde tercih edilir. </li><li> Bunlar son derece keskin ve kırılgan olduğu gibi dikkatli mikroenjeksiyon pipetler anlaştım. </li></ol></li><li> Holding mikropipet <ol><li> Bir borosilic yerleştirin(: 1,0 mm, ID: OD 0.75 mm) cam kapiller yedik (sağ ve sol kılcal sahiplerinin merkezinde) Mikropipet çektirmenin ve kilitleyin. </li><li> uzun hatta konik ve paralel duvarlar ile ince ucu ile sonuçlanır böylece cam kapiller çekmek için uygun bir programı kullanın (: Heat: Örnek 815; çekin: 20; Velocity: 140; Zaman: 175; Basınç: 200). </li><li> Dikkatle çektirmenin cihazdan çekti pipet kaldırmak ve yatay konumda Microforge tutucu üzerine yerleştirin. Isıtıcı lif ve pipet üzerinde odağı ayarlayın. </li><li> pipet çapını ölçmek ve filamanın üzerinde çapı 180 mikron ulaşıncaya kadar pipet taşımak için mercek reticle kullanın. </li><li> Belirtilen boyutta bir elmas uç kalem ile cam kapiller işaretleyin ve sonra yavaşça camı kırmak için çekti ucunda basın. Bu, düz bir kesim (Şekil 1C) ile sonuçlanmalıdır. </li><li> filaman yakın olan ucu ile dikey bir konuma pipet getirin. sıcaklığı ayarlayın<html> % 60 microforge evi. </li><li> Yangın lehçe o 40 mikron bir kimliği ulaşıncaya kadar standart teknikler 7 kullanarak pipet ucu. Kimliği (Şekil 1D) kontrol etmek için mercek reticle kullanın. </li><li> pipet üzerinde bir açı yapar. <ol><li> yaklaşık 10 mikron uzaklıkta filamanın ve uzak ucu 5 mm geri yatay konuma pipet getirin. Yaklaşık% 60 sıcaklığını ayarlamak ve filamanın üzerinde pipet bend ısıtıcı etkinleştirin. (Yaklaşık 30 O) arzu edilen bir açı elde edilene kadar ısıtma devam edin. Açı görsel (Şekil 1E) kontrol edin. Not: Pipet, genellikle enjeksiyon tabağın tabanına göre 60 ° bir açı ile yaklaşık mikroenjektör monte edilir. onun orta düzleminde embriyo doğru enjeksiyon için gerekli olan çanak tabanına paralel şekilde pipet ucu bükülür. </li></ol></li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 2. Mikromanipülatör Kurulumu <ol><li> mikroenjektörler tamamen yağ ile yüklü olduğundan ve sistemde hiçbir hava kabarcığı olduğunu (mikroenjektör kabarcıklar enjeksiyon ince kontrol edilmesini önlemek) kontrol edin. </li><li> mikromanipülatörler orta konumda olduğundan emin olun. Bu pipetler geniş bir hareket aralığı sağlayacak. </li><li> Sol mikromanipülatör tutucuya yerleştirin tutma pipet ve sağ mikromanipulasyon tutucu içine enjeksiyon pipet yerleştirin. </li><li> Yağ kılcallık tarafından pipetler girmek ve sistem mikroenjektör kontrollerini kullanarak pipet içinde yukarı ve aşağı hareket ettirerek yağı düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol etmek için izin verin. Not: iğne içinde yağ hiçbir hareket yoksa, bir yapışmasına neden olabilir. Bu durumda, yeni bir iğne kullanınız. </li><li> görüş mikroskop alanının merkezi haline pipetler getirmek için mikromanipülatör denetimlerini kullanın. 4X büyütme kullanarak, mikropipet uçları (doğru açıda p olduğunu kontrol edinçanak alt) için arallel. Not: iğne Doğru kurulum başarılı bir enjeksiyon için ve sonuç tutarlılığı için anahtardır. </li><li> Üreticinin kalibrasyon kılavuzuna aşağıdaki lazer sistemi kalibre edin. </li></ol> Enjeksiyon Dish 3. Hazırlama (Şekil 2) <ol><li> 100 mm petri kabı kapağının merkezine,% 20 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş ısıtıldı (37 ° C), SOF-HEPES (malzeme bölümünde ayrıntılı olarak bileşimin) içindeki bir 50 ul damla yerleştirin. solüsyonu 2 ul damla enjeksiyon damla yakın enjekte edilecek - 1 yerleştirin. embriyolar RT aşağıda soğumasını etmediğinden emin olun. Not: Bu protokolde enjeksiyon siteyi görselleştirmek ve daha sonra takip edebilmek için enjekte çözüm Dekstran-Kırmızı boya katacak. </li><li> mineral yağ, yaklaşık 10 ml kullanılarak enjeksiyon plaka damla örtün. </li><li> ters mikroskop aşamasında enjeksiyon çanak yerleştirin ve pip getirmekEnjeksiyon damla içine ettes. iğneler damla içindeki odak olup olmadığını kontrol edin. mikromanipülatör denetimlerini kullanarak gerektiği gibi kendi yüksekliğini ayarlayın. </li><li> Enjeksiyon damla üst tarafında - (20 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 17) 30 zigot - Bir microdispenser kullanarak, yaklaşık 20 yükleyin. Enjeksiyon damla embriyo sayısı kişi bunları enjekte etme hızı tarafından belirlenmektedir, ki böylece, oda sıcaklığında enjeksiyon gerçekleştirin. 30 dakika içinde enjekte edilebilir olanlarına göre daha fazla embriyolar yüklemeyin. <ol><li> microdispenser içine embriyolar yüklemek için, tam pistonu bastırın ve embriyoları içeren çözelti içine ucu batırın. Dokunmatik embriyolar cam kapiller ucu (seferde bir) ile aldı ve yavaş yavaş piston böylece her embriyo kılcal girer serbest olması. tüm embriyolar toplanır veya microdispenser kapasitesi dolana kadar bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Yüklenen embriyolar serbest tüm hacim co kadar pistonu hafifçe bastırmak içinembriyolar ntaining kılcal salınır. </li></ol></li></ol> 4. Mikroenjeksiyon <ol><li> 4X objektif kullanarak, negatif basınç (emme) uygulanarak enjeksiyon pipetine enjekte edilecek çözelti yüklenir. 3 zigot - 2 enjekte etmek yeterli bir çözüm yükleyin. Sonra enjeksiyon damlasına kadar hareket ettirin. </li><li> ucu bir zigot yakın alır bu yüzden enjeksiyon damla içinde holding pipet hareket ettirin. zigot 20X amaca tutma pipet ve değişime onarılır böylece tutma mikroenjektör ile negatif basınç (aspirat) uygulayın. </li><li> zigot tutma pipet takıldıktan sonra, yavaşça ayırarak olmadan etrafında embriyo hareket enjekte pipet kullanarak kalitesini kontrol edin. Kaliteli zigot iki kutup bedenlere sahip (tek görülür bazen rağmen) ve homojen bir sitoplazma olmalıdır. Anormal zigot (Şekil 3A) enjekte etmeyin. </li><li> Gerekirse, uygun bir enjeksiyon için embriyo yeniden konumlandırmakyer. İyi bir konumlama olan ZP ve PM arasında biraz boşluk var, bu yüzden PM lazer zarar almaz olacaktır. </li><li> Enjeksiyon pipet yavaşça enjeksiyon yerinde zigot dokunarak embriyonun orta düzlemde konumlanmasına dikkat edin. Bu orta düzleminin üzerinde değil, iğne embriyo yerine ponksiyon dönmesini sağlamak eğiliminde olacaktır. gerektiği gibi enjeksiyon pipet yüksekliğini ayarlayın. </li><li> Bir lazer (Şekil 3B) kullanılarak ZP bir delik sağlayın. <ol><li> lazer yazılım yer deliği (embriyo tutma pipet bağlı olduğu yere karşı tarafında) yapılacaktır ZP lazer retikül kullanılması. Yangın butonuna lazer kontrol penceresi tıklayın kullanma. Deliğin boyutu PM zarar vermeden geçmesi iğne ZP bir açılış oluşturmak için yeterince büyük olduğundan emin olun (Örnek: 0.662 msn Pulse genişliği / 6.9 mikron Delik boyutu). </li></ol></li><li> iğne geçirinve ZP delikten PM ile temas. İğne embriyo (Şekil 3C) içine yolu ¾ kadar ileri pipet itmeye devam edin. </li><li> Bu tutarlı bir enjeksiyon hacmini kontrol etmek için kullanılacak şekilde, çözelti, yağ ara yüzeyinde menisküsün konumunu dikkate alınmalıdır. </li><li> PM ve sitoplazma enjeksiyon iğnesi içine aspire edilen sonuçlanacaktır enjeksiyon pipet üzerinde negatif basınç (aspirat) uygulayın. iğne içine sitoplazma hareketi hızlandırır kadar veya enjeksiyon solüsyonu ile karıştırma sitoplazma içeriği görülebilir zaman devam ediyor. Bu PM (Şekil 3D) kırılma gösterecektir. </li><li> çözüm yağı interfaz menisküs başlangıç ​​noktasına geçmiş bir zigot çapı eşdeğer ilerlemiştir kadar pozitif basınç (enjekte) uygulayarak zigot sitoplazmaya solüsyonu ardından sitoplazmik içeriğin geri enjekte edilir. Not: Bizim koşullarda, bu Repreyaratabilecek enjekte çözeltisi (Şekil 3E), yaklaşık 7 Pl. </li><li> Bir 4X amaca Değişim ve enjeksiyon damla alt tarafına enjekte embriyo / s taşıyın. tutma mikroenjektör pozitif basınç uygulayarak embriyo serbest bırakın. Enjekte / olmayan enjekte edilen embriyoların takip ve verimli çalışmanıza yardımcı olmak için üst tarafta olmayan enjekte edilen embriyolar ve damla alt tarafında enjekte olanları tutun. </li></ol> 5. Embriyo Kurtarma ve Enjeksiyon Sonuçları <ol><li> Önceden ısıtılmış SOF-HEPES ile yeni bir tabağına yaklaşık 200 ul 3 damla sağlayın. Bir microdispenser (yukarıda anlatıldığı gibi) kullanılarak enjekte embriyolar toplayın. 3 SOF-HEPES yoluyla damla taşıyarak enjekte embriyolar yıkayın. </li><li> Mikroenjeksiyon sırasında parçalanmış embriyoların saymak ve atın. İlki bütün ZP doldurun, şeffaf görünür beri bir parçalanmış zigot sağlam bir birinden rahatlıkla ayırt edilebilir ve genellikle sitoplazmik vardır: NotEmbriyonun dışarıya sızıntı içeriği. </li><li> İsteğe bağlı olarak, bir floresan mikroskop kullanılarak mikroenjeksiyon verimliliğini kontrol edin. UV ışığı maruziyeti sonraki gelişimini etkileyebilir embriyo hasarına neden olabileceğini unutmayın. </li><li> 38.5 ° C &#39;de, mineral yağ altında 4 mg / ml sığır serumu albümini (BSA) ile desteklenmiş, potasyum simpleks optimizasyonu ortamı 50 ul damlalar (KSOM) 25 enjekte edilen embriyoların Kültür gruplan, doyma noktasına kadar,% 5 havadaki CO2 ve nem. </li><li> enjeksiyondan iki gün sonra,% 5 FBS ile kültür ortamı Ek. </li><li> enjeksiyondan sonra blastosist (BL) oranlarını 7 gün kontrol edin. blastosist embriyolar / o damla kültür embriyo sayısının toplam sayısı olarak BL oranlarını hesaplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle,+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida.">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Ross, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+activation+of+bovine+oocytes+using+bovine+and+murine+phospholipase+C+zeta.">Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta.</a> BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).</li><li>Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumonji+domain-containing+protein+3+regulates+histone+3+lysine+27+methylation+during+bovine+preimplantation+development.">Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).</li><li>Bogliotti, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4+Developmental+outcomes+and+effiency+of+two+CRISPR/Cas9+microinjection+methods+in+bovine+zygotes.">4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).</li><li>Bakhtari, A., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DPPA3+prevents+cytosine+hydroxymethylation+of+the+maternal+pronucleus+and+is+required+for+normal+development+in+bovine+embryos.">DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos.</a> Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).</li><li>Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+process+of+polishing+borosilicate+glass+capillaries+used+for+fabrication+of+in-vitro+fertilization+(iVF)+micro-pipettes.">Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes.</a> Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).</li><li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pipette Cookbook 2015 P-97 &amp; P-1000 Micropipette Pullers. , (2015).</li><li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , (2014).</li><li>Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of cloning. , (2002).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+reporter+gene+after+microinjection+of+mammalian+artificial+chromosomes+into+pronuclei+of+bovine+zygotes.">Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes.</a> Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

zigot Mikroenjeksiyon memeli embriyolarının içine çözümleri tanıtmak için köklü bir yöntemdir. türleri ve Deneyin amacı göre bazı farklılıklar ile, bu teknik genel olarak kullanılabilir. Biz bir künt uç mikropipet girişinde yardımcı olmak için bir lazer kullanarak intrasitoplazmik mikroenjeksiyon nasıl gerçekleştirileceğini gösterir. (Örneğin sığır, koyun ve domuz gibi) bazı hayvan türlerinin zigot, embriyo içinde bir kez enjeksiyon pipet görselleştirme engelleyen, karanlık bir si...

1-hücre embriyoların Sitoplazmik mikroenjeksiyon çok güçlü bir tekniktir. Bu, örneğin, gen fonksiyonu çalışma ya da gen düzenlenmiş hayvanlar oluşturmak için, gen, çıkıntılara üretilmesi için embriyo herhangi bir çözüm sunmak için de kullanılabilir. En tarımsal-ilgili çiftlik hayvanı zigot kendi sitoplazma opak ve 1 karanlık kılan çok yüksek yağ asidi kompozisyonu var. Onlar da oldukça esnek plazma zarı (PM) var. Bu özellikler kemirgen türleri zorlu ve sık sık yanlış kullanılan geleneksel pronüklear / sitoplazmik enjeksiyon kullanılarak mikroenjeksiyon yapmak. Sonuçlar, daha kolay olan ve aynı zamanda daha yüksek canlılığı 2&#39;de elde edilen, enjekte edilen embriyolar için daha az zarar yana Sitoplazmik mikroenjeksiyon pronükleer mikroenjeksiyon fazla avantajlara sahiptir. Bu protokolün genel amacı çiftlik hayvanı zigot sitoplazması içine çözümler sunmak için başarılı bir yöntem ortaya koymaktır. yapabilmek içinBesi embriyoların yüksek verimle sitoplazmik mikroenjeksiyon, bir lazer, bir küt uç cam iğne mikroenjeksiyon için kullanılan zona pellucida (ZP) ve daha sonra bir delik oluşturmak için kullanılır. Bu strateji enjeksiyon sırasında embriyo üzerinde baskılı mekanik zararı azaltmayı hedefliyor. Sonra, enjeksiyon iğnesi içinde sitoplazmik içeriğin aspirasyon çözümü embriyo sitoplazmaya teslim edilmesini sağlamak PM verimli ve güvenli kırılmasına izin verir. Bu teknik başarıyla zigotik sitoplazma 3,4 içine siRNA teslim etmek ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarı (CRISPR) / CRISPR ilişkili sistem 9 (Cas9) sistemi 5 ile mutasyon üretmek için sığır embriyolarının kullanılmıştır. Ayrıca sığır cumulus-kapalı oosit 6 enjekte etmek (küçük değişikliklerle) uygundur. Burada, bir boya teslim eden enjeksiyon protokol açıklar, herhangi des enjekte uygulanabilir olabilirzigot içine IRED çözüm ve bu tekniği kullanarak en az erimesine yol açar ve erken embriyo gelişimini etkilemediğini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Sutter instruments</td><td>B100-75-10</td><td>These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>Equipped with 10X magnification lense.</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Nikon/ Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.</td></tr><tr><td>Laser</td><td>Research Instruments</td><td>7-47-500</td><td>Saturn 5 Active laser.</td></tr><tr><td>Microdispenser</td><td>Drummond</td><td>3-000-105</td><td>The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.</td></tr><tr><td>100 x 15 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.</td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>These dishes are used for culturing the embryos in 50 &amp;mu;l drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>Any incubator that can be set to 38.5 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; conditions can be used.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.</td></tr><tr><td>Control Unit HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>Heating system attached to the stereomicroscope.</td></tr><tr><td>Heated Microscope Stage</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>Heating system attached to the stereomicroscope.</td></tr><tr><td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>sigma</td><td>M8410</td><td>Keep the mineral oil at room temperature and&amp;nbsp; protected from light using foil paper.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>Use a stem-cell qualified FBS.</td></tr><tr><td>Zygotes</td><td></td><td></td><td>Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be &lt;em&gt;in-vitro&lt;/em&gt;- or &lt;em&gt;in-vivo&lt;/em&gt;-derived.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Sodium DL-lactate</td><td>Sigma</td><td>L4263</td><td>Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>D-(&amp;minus;)-Fructose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3510</td><td>Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td>Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>Final concentration: 5 &amp;mu;g/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Water for embryo transfer</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>SOF-HEPES medium</td><td>Made in the lab</td><td></td><td>pH 7.3 - 7.4, 280 &amp;plusmn; 10 mOs. Filter sterilized through a 22 &amp;mu;m filter can be stored in the fridge at 4 &amp;deg;C for 1 month. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr></tbody></table>

laser-assisted cytoplasmic microinjection in livestock zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Lazer destekli sitoplazmik mikroenjeksiyon hayvancılık zigot sitoplazması içine çözümler sunmak için güçlü ve güvenilir bir protokoldür. 3 önce ve enjeksiyon yanı sıra tekniğin genel hatlarıyla sonra zigot genel hatlarını göstermektedir. Dekstran, kırmızı püskürtme ve enjeksiyon verimliliği ve doğruluk izleme sitesi sağlamak için çözelti enjekte olarak kullanılır. Çözeltinin başarılı dağıtım boya homojen olarak s...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes at JoVE.com

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Lazer destekli Hayvancılık Zigotlann Sitoplazmik Mikroenjeksiyon

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

laser-assisted-cytoplasmic-microinjection-in-livestock-zygotes

Research

JoVE Journal

Genetics

9.0K Görüntüleme.  University of California, Davis. This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Video: Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Larva Zebra balığı Skin bir İndüklenebilir Gal4 / UAS İfade Sisteminin Kullanılması doğuştan gelen bağışıklık ve preneoplastik Hücre Etkileşimleri Canlı Görüntüleme

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Gelişim Biyolojisi

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetik

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biyoloji

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Farelerde gen kaseti knock-in ve flox alelleri oluşturmak için zigot mikroenjeksiyonu

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Deniz Kestanesi Zigotlar Yüksek Randımanlı Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

Fare Lentiviral Gene lazer destekli teslim yumurta döllenmiş

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

Education

JoVE Science Education

Temel Biyoloji

Biyoloji II: Fare, Zebra Balığı ve Civciv

Laser-Assisted Lentiviral Gene Delivery: A Technique to Permeabilize Mouse Fertilized Eggs to Facilitate Lentiviral Gene Delivery

Source: Martin, N. P., et al. <a href="https://www.jove.com/v/58327">Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs.</a> J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the laser-assisted permeation of the protective layer of zona pellucida in mouse fertilized eggs for facilitating lentiviral gene delivery. Lentivirus enables the generation of transgenic animals with a gene of interest stably integrated into their genome.

Lazer Destekli Lentiviral Gen Dağıtımı: Lentiviral Gen Dağıtımını Kolaylaştırmak için Fare Döllenmiş Yumurtalarını Geçirgen Hale Getirme Tekniği

Source: Martin, N. P., et al. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the ...