The authors thank Meng-Chieh Shen for images, Jennifer Anderson for providing helpful comments on the manuscript, and members of the Farber laboratory for their contributions in developing these techniques. This study was funded by NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F), and F32DK096786 (J.P.O.). This content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of NIH. Additional support was provided by the G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation to the laboratory of S.A.F and the Carnegie Institution for Science endowment.

Bu protokoller Bilim Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Carnegie Institution (protokol no. 139) tarafından onaylanmıştır. 1. Hayvan hazırlanması <ol><li> 14 saat 28 ° C&#39;de yetişkin ve larvaları korumak: 10 saat aydınlık: karanlık döngüsü. Kabuk serbest Artemia (decapsulated olmayan taramalarla, 14 dpf&#39;e başlayarak) ve ticari mikropelletler ile günde iki kez yetişkin besleyin. </li><li> Bu protokoller AB kökenli doğal yumurtlama tarafından toplanan 6-7 dpf larvaları kullanımı için optimize edilmiştir. Protokoller diğer yaştan ve her kökenden larvalar için modifiye edilebilir. eksojen yiyecek önce 6 dpf vermeyin. </li><li> Embriyo medya Tricaine (EM) ile larva, oda sıcaklığında (RT) (4 mg, 100 ml EM başına / ml Tricaine 4.2 mi) anestezisi. </li></ol> Lipid zengin Yumurta Sarısı Feed 2. Hazırlık <ol><li> Hazırlayın ve tavuk yumurta sarılarını saklayın. 12 tavuk yumurtası sarısı ve beyaz ayırın. , Kısım 1 mi 1.5 içinde sarısı Havuz1 yıla kadar -80 ° C up ml tüpler ve mağaza (12 sarısı ~ 80 alikotları yapacaktır). beyazlar, mağaza havuz ve lipid-fakir, proteince zengin yem olarak kullanmak. </li><li> İstenirse Hazırlama Floresan bir lipid analoğu (ler) Yumurta sarısı beslemesine eklenmesini sağlar. <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, opak cam tüplerde, kısım (aşağıdaki nota çözücüler tartışmaya bakınız) / ml 0.1 ug% 100 etanol veya% 100 kloroform içinde alınan, toz haline getirilmiş Floresan bir lipid analoğu Askıya parafilm ile kaplayın ve saklayın. Nedeniyle organik çözücü, hızlı buharlaştırma, uzun süreli depolama için ~ 400 ul daha az kısım birimleri kullanmayın. Not: bir lipid analoğu olan, etanol içinde süspanse edildiği takdirde, kloroform fazla N2 altında daha hızlı kurur, bir lipid analoğu olan büyük miktarlarda kullanılır. bir lipid analoğu olan, etanol içinde süspanse edilir ise, adım 2.2.4 lipozom besleme eklemeden önce kurutuldu ve yeniden süspansiyon haline olmak zorunda değildir, ancak toplam etanol konsantrasyonu 0 geçmemelidir.Lipozom besleme içinde% 1 etanol, potansiyel olarak karıştırıcı fizyolojik etkilerini önlemek için. </li><li> Floresan yağlı asit analoglan için: EM 20 ml% 5 yumurta şansı emülsiyonun toplam hacmi hazırlayın. Bu kaynaktan canlı konfokal görüntüleme ve gıda alımı deneylerinde ya da 1 ug / ml 6.4 uM 4,4-difloro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indasen bir son konsantrasyon (BODIPY Cı 16) 5 ml lik kısımlar halinde hazırlanması stereomikroskop görüntüleme için BODIPY C12. 1.5 ml&#39;lik plastik tüp içine Floresan bir lipid analoğu istenilen miktarda aktarın. Tüpün dışına lipid darbe özen N2 akışı altında lipid kurutun. </li><li> Hemen tüpün tarafı aşağı akışı pipetleme 5 ul% 100 etanol içinde tekrar süspansiyon, 95 ul EM ekleyin ve iyice karıştırın. Not: Karışım homojen görünmelidir; renkli lipit tüp tarafta kalır veya sıvı clumpy belirirse, lipit tamamen çözülmüş ve daha etanol gerektirir değil. fro tüp korumakbuz üzerinde m ışık ve mağaza. </li><li> Floresan kolesterol analog: Canlı görüntüleme çalışmaları için 5 mi% 0.5-5, yumurta sarısı, emülsiyon 2.4 ug / ml kolesterol bir son konsantrasyon hazırlar. 1.5 ml&#39;lik plastik tüp içine kolesterol istenilen miktarda aktarın. Tüpün dışına lipid darbe özen N2 akışı altında lipid kurutun. </li><li> Hemen sonra, tüp iki aşağı akış pipetleme saflaştınldı H2O RT% 1 yağ asidi içermeyen BSA 85 ul karışımı ile RT% 100 etanol içinde 15 ul içinde süspanse Işıktan tüp korumak ve buz üzerinde saklayın. </li></ol></li><li> Yumurta Sarısı Lipozom Besleme hazırlayın. <ol><li> 50 ml konik tüp içinde EM yumurta sarısı bir çözülmüş kısım ekleyin. 1-2 dakika boyunca seyreltilmiş yumurta sarısı karışımını Vortex; Karışım, homojen bir emülsiyon olarak görünür. </li><li> Yeni, taze 50 ml konik tüp protein holdingler kaldırmak ve toplamak için ince mesh süzgeç vasıtasıyla karışımı dökün. </li><li> Darbe SONICAlipozom oluşturmak için RT&#39;de: a dörtte inç konik mikrotip (6 W çıkış yoğunluğu her set arasında 5-10 sn duraklatma 5 kez (5 x 1 sn, 1 sn kapalı)) yumurta karışımını te. Sonikatör güç ayarları bağımlı enstrüman ve bu nedenle her enstrüman ve mikro uç için optimizasyon gerektirir. Not: Sürekli kullanıma kadar homojenliği sağlamak için oda sıcaklığında lipozom karışımı sallayın. </li></ol></li><li> arzu edildiği takdirde, yumurta sarısı lipozomlara Floresan bir lipid analoğu ekleyin. Hemen Sonikasyon sonrasında, lipozomlar içine dahil 30 saniye boyunca yüksek hızda lipozom karışımı ve girdap içine hazırlanmış lipid pipetleyin. folyo tüp sararak ışıktan karışımı korumak ve oda sıcaklığında sallanan devam ediyor. </li></ol> 3. Besleme Paradigma <ol><li> Besleme için Larva hazırlayın. <ol><li> beslenme engelleyebilir belirgin morfolojik kusurlar için besleme, ekran larva başlamadan önce. 60 mm x 15 mm Petri kapları veya 6 veya 12-kuyu pla Transfer larvalarıTES EM asgariye düşürmek ve hazırlanan lipozom çözeltisi, 5 ml ile değiştirin. </li><li> Gerekirse, EM 5 mi EM ve / veya 5 mi% 5 yumurta akı için beslenmemiş kontrol larvaları transferi ve paralel olarak tedavi. </li></ol></li><li> Yavaşça flüoresan lipid analogları varsa ışıktan korumak için devam ederken gıda alımını teşvik etmek için yem boyunca kuluçkaya rocker larvaları (30 rpm&#39;de 29-31 ° C) sallayın. Larvalar ihtiyacı ışığa maruz kalması durumunda, bir renkli cam inkübatör kapaklı maruziyeti en aza indirmek. </li><li> besleme süresinin sonunda, EM 3 kez özgürce yüzme larva durulayın. Not: Larva besleme sırasında herhangi bir noktada lipozomlar alıcı başlayabilir. bu larvalar aynı anda beslenme başlaması önemlidir ise, gıda alımı için ekran besleme 1 saat sonra (3.4) ve beslemeyi tamamlamak için yumurta sarısı emülsiyonu ile besleme başlamıştır tek larvaları dönün. </li><li> az sayıda gıda alımı için bu noktada larvaları Ekran ea olmayabilirt (genellikle ~% 0-5). Onlar beslenen olmadığını belirlemek için buz üzerinde bir metal blok üzerinde anestezi ya da hafif soğutulmuş olan larva bağırsak inceleyin: lipozomlar tüketilen larva karanlık bir bağırsak (Şekil 1) sahip olacaktır. </li><li> Hemen gıda alımı için görüntü veya işlem larvaları. Alternatif olarak, bir yerde taze EM larva ve 28 ° C&#39;de inkübe metabolik işleme oluşmasına izin vermek. </li></ol> Canlı Görüntüleme Larva Montaj 4. <ol><li> Montaj Medya hazırlayın. <ol><li> % 3 metil selüloz: -20 ° C &#39;de yıllık yakın kaynama EM, girdap, 4 ° C&#39;de 2-3 gün tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında kaya ve mağaza 25 ml 0.75 g metil selüloz ekleyin. 4 ° C&#39;de dondurma ve eritme işlemlerine ait döngülerin tekrar hava kabarcıkları kaldırır. larva montaj sırasında buz üzerinde% 3 metil selüloz saklayın. </li><li> % 1.2 düşük montaj agaroz için: 0.3 g ilave 25 ml EM agaroz düşük eritmek ve 2 ml t içine kaynatın, kısım getirerek çözmekUBE ve sıcaklıkta bir blok üzerinde 26-28 ° C&#39;de muhafaza. Kullanılmayan tam bölünen miktarları, oda sıcaklığında saklandı veya -20 ° C ve kullanım sırasında tekrar kaynatılır edilebilir. Agaroz larvalarının maruz ya da ısıtmalı aşırı olabilir önce işlemek için yeterli serin olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Düşük büyütme, orta hacimli canlı görüntüleme için, buz üzerinde metal bir blokta bir doku üzerinde bir cam slayt yerleştirin ve slayt soğumasını bekleyin. yapıştırılmış bir balıkçı satırı poker kullanarak,% 3 metil selüloz üzerine larva transferi, slayt üzerine (buz üzerinde 4 ° C&#39;de muhafaza edilmiştir)% 3 metil selüloz bol miktarda uygulayın (0.41 mm çapında misina bir cam kılcal tüp sonu) bu metil selüloz seyreltilebilir olmayan (böylece aşırı EM drenaj) ve istenen şekilde larva konumlandırmak için troth oluşturun. </li><li> kısa vadeli (&lt;20 dk), bir dik yağ emersion amacı ile yüksek büyütmeli canlı görüntüleme, yöntem barınağa lamel ile larva monte edin. <ol><li> siyanoakrilat bazlı tutkal (Superglue) kullanınBir cam slayt bir ucuna aa 22 mm x 30 mm&#39;lik bir örtücü cam ekleyin. lamel bitişik slaytta% 3 metil selüloz ince bir çizgi koymak ve geniş bir delik Pasteur pipetiyle slayt larva transfer etmek için bir poker kullanın. o metil selüloz sulandırmak olmayacak şekilde aşırı EM çıkarın. </li><li> Bir poker kullanarak, yavaşça lamel yanında başlarını (sağ görüntü safra kesesi kadar yan, yukarı karaciğer daha fazla görüntüye sol taraf) onların yüzüne metil selüloz içinde larva yerleştirin. </li><li> nazikçe ikinci lamel köşelerinde ve spot superglue larvaları köprü monte lamel lamel ve slayt diğer bir kenarını yerleştirin. Bu adım sırasında veya bu larvalar yaralanmamış kalırken görüntüleme böylece amacı ile aşırı baskı uygulamak etmemeye dikkat edin. </li></ol></li><li> Uzun vadede, dik daldırma amacı ile yüksek büyütmeli görüntü, agaroz larva monte edin. agaroz sonra aktarmak% 1.2 düşük eriyik küçük bir kana bir larva ekleBir petri agaroz küçük bir hacme larva. <ol><li> Hızla Agaroz katılaşır önce poker ile larva yerleştirin. Agaroz 2-3 dakika kurumasını ve kurumasını önlemek için taze EM ile tam agaroz kapsayacak şekilde izin verin. </li></ol></li><li> Uzun vadede, ters amacı ile yüksek büyütmeli görüntü, agaroz bir cam alt çanak larvalarını monte edin. <ol><li> Buz üzerinde bir metal blok soğutun. Aşırı soğutma ve larva donmayı önlemek için bir doku ile ayrılmış metal blok üzerinde çanak yerleştirin. çanak bir larva transferi ve bir doku ile fitilleme ile EM kaldırın. </li><li> larva üstünde 28 ° C düşük erime agaroz (% 1.2) bir damla yerleştirin ve hemen bir poker (aşağı en iyi görüntüye sol tarafında karaciğer, safra kesesi aşağı görüntüye sağ tarafı) ile yerleştirin. Soğuk bloktan çanak çıkarın 2-3 dk kurumasını bekleyin ve agaroz kapsayacak şekilde taze EM yeterli hacim kazandırmak (~ 2-5 ml). </li></ol></li></ol> 5. Gıda Alımıtahlil <ol><li> 6.4 uM BODIPY C16 ihtiva eden bir yumurta şansı lipozom Beslemenin sonunda, plastik bir 1,5 ya da 2 ml tüp içinde 10 yıkanmıştır larva az havuz EM çıkarın ve donma ek. örnekler birkaç ay boyunca ışıktan korunan -80 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. Not: Eğer mümkünse, birden çoğaltır toplamak. (Kullanılan aynı kavrama ideal olarak larva) arka lipit floresan normalleştirmek için bu adımda beslenmemiş larvaları toplamak için önemlidir. </li><li> Modifiye Bligh-Dyer lipit çıkarma 3,21 gerçekleştirin. <ol><li> Buz üzerinde örnek (2 O kullanılabilir Alternatif olarak arıtılmış, lH), 100 | il homojenizasyon tamponu (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) ekleyin. (: 1 sn kapalı 1 sn 5 sn toplam) bir mikrotip sonikatör ile buz üzerinde homojenize. Bu larvaların tamamen homojenize olup olmadığını kontrol edin; değilse, tekrarlayın. 13 ml&#39;lik atılabilir bir camdan yapılmış bir kültür tüpüne transfer (diğer cam tüpler kullanılabilir). Not: kloroform tehlikelidir; Tüm takip eden lipit eski yerineBir kimyasal kaput oda sıcaklığında çekiş adımlar. </li><li> (: Metanol kloroform) 2: Kullanılan homojenizasyon tamponu her 100 ul için 1 375 ul ekleyin. Vortex 30-60 sn, kullanılan 100 ul homojenizasyon tamponu başına kloroform ve vorteks 30 sn 125 ul ekleyin, 10 dakika inkübe edilir. </li><li> 200 mM Tris pH 125 ul ekle 7,5 kullanılan 100 ul homojenizasyon tamponu (ışıktan korunan 2,000 x g, 5 dakika, RT) vorteks 30 saniye ve santrifüj başı. Dikkatle santrifüj örnekleri kaldırın. Bir üst faz sulu bir larva kalıntılardan bir arayüz, ve bir alt organik faz (lipidler içerir) olarak iki faza ayrılır. </li><li> temiz bir cam pipet ile alt organik fazı toplamak ve temiz bir 13 ml&#39;lik cam tüp içine aktarın. Not: arayüzde sulu fazı ve larva enkaz önlemek için özen gösterin; kirlenme meydana gelirse, santrifüj adımı ve hatırlamak tekrarlayın. Üst, sulu faz atın; o kaldırmak ve bu atmak yararlı olabilirOrganik fazı toplama önce aşaması. Örnek 1 aya kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> ışıktan koruyarak, vakum altında organik faz (0.12 atm) kurutun. lipid çözünürlüğü azaltacaktır gibi sıvı buharlaştırılarak sonra numuneleri kuru devam etmeyin. 2&#39;de lipitleri tekrar süspansiyon: buz üzerinde ve mağaza: 1 (metanol kloroform). kloroform uygun hacmi: metanol çözeltisi kullanılan algılama yöntemine bağlı olarak değişir; düşük başlangıç ​​ve gerektiği gibi sulandırmak devam ediyor. Genel kural 10 havuza larva için 10 ul kullanmaktır. </li></ol></li><li> Bir kanalize TLC plaka üzerine eşit aralıklı aralıklarla tüm numune hacimleri nokta ve rutin biyomoleküler görüntüleme (örneğin, bir floresan plaka okuyucu) için kullanılan bir lazer tarayıcı ile plaka tarayın. 510-665 nm 500-650 nm ve maksimum emisyon bir maksimum eksitasyon sahip maddeler listesine dahil Floresan bir lipid analoglan için, 520 nm&#39;lik bir emisyon toplama 488 nm lazer ve kullanımı. <ol><li> görüntüleme yazılımı ile her noktada toplam floresan ölçmek. Not: Doğal eşleştirilmiş, beslenmemiş larva örneklerin floresan çıkarılarak arka plan lipit floresan meydana Doğru. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Carten, J. D., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+system+swims+into+focus:+using+the+zebrafish+to+visualize+intestinal+metabolism+in+vivo.">A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo.</a> Clin Lipidol. 4 (4), 501 (2009).</li><li>Babin, P. J., Vernier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+lipoproteins+in+fish.">Plasma lipoproteins in fish.</a> J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).</li><li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish.">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).</li><li>Marza, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+and+nutritional+regulation+of+a+zebrafish+gene+homologous+to+mammalian+microsomal+triglyceride+transfer+protein+large+subunit.">Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit.</a> Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).</li><li>Stoletov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+lipid+accumulation,+lipoprotein+oxidation,+and+macrophage+lipid+uptake+in+hypercholesterolemic+zebrafish.">Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish.</a> Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+effects+of+high-carbohydrate+feeding+of+larvae+on+adult+glucose+metabolism+in+zebrafish,+Danio+rerio.">Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio.</a> Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).</li><li>Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+a+combined+high+cholesterol+diet+and+high+glucose+environment+on+vasculature.">Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature.</a> PLoS One. 8 (12), 81485 (2013).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+and+attenuation+of+oxidized+lipid+accumulation+in+hypercholesterolemic+zebrafish.">In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish.</a> J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).</li><li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).</li><li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation.">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li><li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18,+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease.">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li><li>Matthews, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFalpha-dependent+hepatic+steatosis+and+liver+degeneration+caused+by+mutation+of+zebrafish+S-adenosylhomocysteine+hydrolase.">TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase.</a> Development. 136 (5), 865-875 (2009).</li><li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity.">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC Physiol. 10, 21 (2010).</li><li>Chu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Akt1+enhances+adipogenesis+and+leads+to+lipoma+formation+in+zebrafish.">Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (5), 36474 (2012).</li><li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost.">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).</li><li>Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+approaches+to+the+study+of+zebrafish+nutrition.">Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition.</a> ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).</li><li>Farber, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+digestive+physiology+using+fluorescent+phospholipid+reporters.">Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters.</a> Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).</li><li>Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+yolk+lipid+processing:+a+tractable+tool+for+the+study+of+vertebrate+lipid+transport+and+metabolism.">Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism.</a> Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).</li><li>Otis, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+apolipoprotein+biology:+comprehensive+expression+analysis+and+a+role+for+ApoA-IV+in+regulating+food+intake.">Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).</li><li>Bligh, E., Dyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).</li><li>Otis, J. P., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+vertebrate+digestive+function+and+lipid+metabolism.">Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism.</a> Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).</li><li>Andre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+fatty+acid+binding+protein+gene+expression+reveals+the+cephalocaudal+patterning+during+zebrafish+gut+morphogenesis.">Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis.</a> Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).</li><li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening.">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PLoS One. 7 (12), 52549 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada açıklanan teknikler araştırmacılar, bir lipit bakımından zengin yem ile larva Zebra balığı tedavi canlı larva diyet lipit işleme görselleştirmek ve larva besin alımını ölçmek için izin verir. başarı sağlamak için, özel dikkat birkaç kritik adımlar verilmelidir. Ticari tavuk yumurtası değişir; Potansiyel değişkenliği en aza indirmek için biz omega-3 yağ asitleri için zenginleştirilmiş değil kafes ücretsiz tavuk organik yumurta tüm testleri gerçekleştirmek. Düşük besleme oranları daha genç 6 gıda alımını (yani, çene ya da bağırsak malformasyon, düzgün yüzmek için yetersizlik) engelleyen gelişimsel mutasyonlar ile endojen sarısı enerji kaynaklarını, sağlıksız balık veya balık kalan dpf&#39;e balık görülebilir. endojen sarısı mağazaları bitkin ve sarısı tükenmesi sindirim sisteminin daha iyi görselleştirme sağlar kadar larvaları eksojen gıda gerekmez çünkü Farber laboratuvar genellikle 6-7 gün sonra döllenme (dpf) de beslenme çalışmaları gerçekleştirir. beslemeOda sıcaklığında, aynı zamanda önemli ölçüde yemek larvaların sayısını azaltır. gıda alımı ve sonuçları yanıltabilecek sonraki deneylerde beslenmemiş larvaların kasıtsız dahil edilmesi için ekran larva Başarısızlık. Buna ek olarak, maksimum floresans ve böylece deney hassasiyetini korumak mümkün ışıktan Floresan bir lipid analoglan ve analoglan ile beslenen bütün larva örnekleri korumak için önemlidir. besin alımı ölçüleceği Son olarak, yemek atılır başlayacak beri yem ve kovalamaca (post-besleme metabolizma dönemi), 4 saat olmak üzere toplam aşmak için izin vermez. Şu anda, yemek ve ilgili floresan lipit analogları atılır hangi oran bilinmemektedir, ancak floresan en az 2 gün sonrası yem (JPO ve SAF yayınlanmamış veri) için larva vücuda devam edebilir. değiştirmek ve ilgi deneysel soruları cevaplamak için protokolleri gidermek için çeşitli yollar vardır. lipid bakımından zengin besleme t çeşitli süreler için gerçekleştirilebilirime: 4 saat lipid büyük miktarda bağırsak dolduracak ise 1 saat, küçük bir yemek sağlayacaktır. Ancak, uzun 6 saat daha larvaları besleme sarısı olarak tavsiye edilmez ve EM sonuçlarını yanıltabilecek steril koşullarda ve yumurta sarısı / beyaz emülsiyon içinde bakteriyel aşırı çoğalma (yani, artan inflamasyon, değişmiş bağırsak Mikrobiyota profili) hazır değildir. Larva hızla yeniden ısıtmadan sonra yeniden beslenen başlar kısa soğutma veya anestezi ile hareketsiz yem Larva akut etkilerini araştırmak için beslendikten sonra hemen muayene edilebilir, ancak soğutma anestezi üzerine emesis sergileyebilir larva olarak immobilizasyon tercih edilen yöntem (SAF yayınlanmamış gözlem) &#39;dir. Alternatif olarak, takip süreleri çalışmadan önceki beslenme lipidlerin taşıma ve metabolizması için izin vermek için besleme sonra gerçekleştirilebilir. Beslemeler genellikle 5 mi lipozom çözeltisi içinde gerçekleştirilmektedir, ancak besleme başarıyla 1 ila 20 ml arasında değişen hacimlerde gerçekleştirilmiştir. çeşitli konsantrasyonlardaYumurta sarısı s larva beslemeler için kullanılabilir; Farber laboratuvar rutin% 5 yumurta sarısı (1 ml yumurta sarısı 19 ml EM eklenen),% 0.5 yumurta sarısı, ve% 10 yumurta sarısı ile deneyler yapar. dikkate alınması gereken floresan lipid analoglarının potansiyel sınırlamalar vardır. Bir floresan lipit analog seçerken sonuçları yorumlarken floresan kısmı lipid kimyasal yapısına nasıl lipit fizyolojik işlenir ve nerede dikkate almak önemlidir. Örneğin, trigliseridleri, emilmeden önce bağırsak lümeninde, serbest kolesterol ve yağ asitleri serbest yağ asitleri ve gliserol, ve kolesterol esterleri ayrılır. floresan trigliserid veya kolesterol ester analogu diyet verilmiştir, bu nedenle vücutta floresans floresan kısım, orijinal trigliserid veya kolesterol ester bağlı olduğu yağ asidi, serbest kolesterol, ve gliserol izler. farklı flüoresant lipit analogları benzersiz hücresel yapılar etiket ve bu gerçeği seçiminde 3 sırasında dikkate alınmalıdır. Ayrıca Not, yerli yağ asitlerinin metabolizması ile karşılaştırıldığında, bir BODIPY kısmının eklenmesi yağ asidi zincir uzunluğuna (SAF yayınlanmamış veri) için ~ 2-3 karbon eklemeye eşdeğerdir. Burada açıklanan teknikler alanında açıklanan önceki deneyleri üzerinde önemli gelişmeler göstermektedir. Larvalar desteklenmektedir beslenen edildiği bu tavuk yumurta sarısı yem gelişimine önce, iki el yazması detaylı çalışmalar haşlanmış yumurta 4,23 sarısı. Burada anlatılan teknik, yumurta sarısı nedeniyle hızlı bir oksidasyonuna sabit bu toz yumurta sarısı, çok kısa bir yarı-ömrü vardır kaynatılmış ve kullanımdan önce tozu olması gerekmez avantajını sunar. Sıvı yumurta sarısı, aynı zamanda hali hazırda etkili bir diyet teslimat için Floresan bir lipid analoglan kabul lipozomlar gibi hazırlanabilir. Seçenek olarak ise, radyo-etiketli lipitlerin inves için kullanılabilirdiyet lipid metabolizmasını araştırılmazsa ve gıda alımını ölçmek, ancak floresan lipit analogları radyoaktivite ile ilişkili güvenlik tehlikelerini sunmazlar. Araştırmacılar radyoaktif işaretli lipidlerin kullanmak isteyen, ancak eğer Farber laboratuar radyoetiketli lipidler dahil edilebilir olduğunu doğrulamak için çalışmalar yapıldı ve başarıyla beslenen, 19 lipozomlar etti. Burada açıklanan floresan lipit analogları onlar endojen ve radyoaktif işaretli lipidler çok benzer metabolizmasını gösterir çünkü seçilen ve alçak ve yüksek güç görüntüleme için yeterince parlak idi. Larvalarına karşı Floresan bir lipid analoglan beslemek için bu tekniğin geliştirilmesi da öncelikle, herhangi bir diğer yöntemler, in vivo olarak, diyet yağ taşıma ve birikimini görselleştirmek için kullanılabilir. Floresan lipit analoglarının doğrudan görselleştirme serum lipit gibi fizyoloji dolaylı önlemler kullanarak üzerinde bir avantaj sağlayabilir. Larva zebra balığı gıda alımının doğru ölçülmesi ayrıca uzun STA oldualanına meydan nding. Larvalar beslemek için izin N -methylpyridinium iyodür (4-Di-10-ASP), ve floresan ölçmek - tek alternatif floresan lipofilik izleyicinin 4- (4- (didecylamino) stiril) ile etiketlemek, kültür paramecia&#39;nın oldu bir plaka okuyucu 24 ile karın içi alan. Son olarak, bu teknikler hem orta verimli ekranlar (diyet lipit işleme, yani ileri genetik ekranlar) yanı sıra odaklanmış yüksek büyütme görüntüleme çalışmaları için geçerli olma avantajına sahip (yani, genetik, hipotez odaklı çalışmaları ters). Gelecekte, bu teknikler fenotipe uygulanabilir ve zebrabalıkları Metabolik ve GI bozuklukları çeşitli modeller ekran.

bağırsak diyet lipit işleme düzenleyen mekanizmalar, karaciğer karmaşık lipit sentezi ve lipoprotein metabolizmasını kontrol eder ve bu organların besin alımını kontrol etmek için merkezi sinir sistemi ile çalışmak nasıl tam olarak anlaşılamamıştır. Obezite, kalp-damar hastalıkları, diyabet ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının mevcut salgın hastalıklar ışığında bu biyoloji aydınlatmak için biyomedikal ilgi çekicidir. Hücre kültüründe Çalışmalar ve fareler diyet lipidler ve hastalık ve Zebra balığı (Danio rerio) arasındaki mekanik ilişkileri anlayışımız çoğunluğu sağladı bu çalışmayı tamamlamak için ideal bir model olarak ortaya çıkmaktadır. Zebra balığı, yüksek omurgalılar 1,2 benzer gastrointestinal (Gİ) organları, lipid metabolizmasını ve lipoprotein ulaşım var hızla geliştirmek ve genetik uysal vardır. Larva zebrafish optik netlik in vivo çalışmalar kolaylaştırır, bir particulahücre dışı ortamın olarak GI sistemin çalışması için r avantajı (yani, safra, Mikrobiyota, endokrin sinyal) ex vivo. uyarınca, genetik, izlenebilir ve vesile birleştiren araştırma vücut ile Zebra balığı larvalarının görüntüleme yaşamak için modellemek için neredeyse imkansız bir diyet manipülasyonlar (yüksek yağ 3,4, kolesterol 5 ve -Karbonhidrat diyetler 6,7), ve kardiyovasküler hastalık 8 modelleri çeşitliliği, diyabet 9,10, karaciğer yağlanması 11-13 ve obezite 14-16, metabolik anlayışlar bir dizi sağlamak için ortaya çıkıyor. Metabolik araştırma içine larva Zebra balığı geçiş önemli bir yönü zebrabalıkları ve Zebra balığı benzersiz güçlü istismar yeni testlerin gelişmesine diğer model hayvanlarda geliştirilen tekniklerin optimizasyonu olduğunu. Bu protokol teknikleri Lipi larva zebrafish beslemek için geliştirilmiş ve optimize edilmiş sunulurD-zengin yemek, hücre içi çözünürlük bütün vücut diyet lipit işleme görselleştirmek ve gıda alımını ölçün. o yağ ve kolesterol (lipidler ~ tavuk yumurtası,% 60 trigliserit kolesterol ~% 5 olduğu sarısı, ve% 35% 58 fosfolipit vardır oluşturan yüksek seviyede içerdiği tavuk yumurta sarısı lipit bakımından zengin bir yemek oluşturmak için seçildi ). Zebra balığı diyetler ve beslenme alayları laboratuarları 17 arasında standardize edilmemiştir olarak tavuk yumurta sarısı, tipik ticari zebrabalıkları Mikropellet gıdalar (~% 15 lipidler) ve belirli yağ asitleri türlerin bilinen yüzdeleri ile standartlaştırılmış bir yem olduğu avantajı daha fazla yağ sağlar. Ayrıca, yumurta sarısında Resim Floresan bir lipid analoglan ince katman kromatografisi yoluyla metabolizmasını araştırmak taşıma ve diyet lipidlerin 18 birikimini, hayati boya 3 ve karmaşık lipidlere kovalent eklenmesi ile, her iki hareket ederek lipid damlacıkları olarak resim hücresel bileşenleri görselleştirmek (TLC) 19 </sup&gt; Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) (SAF yayınlanmamış veri) ve toplam besin alımı 20 için sayısal bir tahlil sağlar.

<table><tbody><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Anesthesia for larval zebrafish</td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids</td></tr><tr><td>Ultrasonic processor 3000 sonicator</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>To make egg yolk liposomes</td></tr><tr><td>Sonabox acoustic enclosure</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>To make egg yolk liposomes</td></tr><tr><td>1/8&amp;rdquo; tapered microtip</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>To make egg yolk liposomes</td></tr><tr><td>Amber vials (4 ml, glass)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini&amp;nbsp;</td><td>Benchmark</td><td>1222U12</td><td>Incubated shaker for feeds</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)</td></tr><tr><td>TopFluor cholesterol&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>810255</td><td>Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol</td></tr><tr><td>Fatty acid-free BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>For TopFluor cholesterol solubilization</td></tr><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Mounting media for live larval imaging; 22 x 30</td></tr><tr><td>VWR microscope slides&amp;nbsp;</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>16004-422</td><td>Mounting larvae for live imaging</td></tr><tr><td>Coverslips&amp;nbsp;</td><td>Cover Glass</td><td>12-544A</td><td>Mounting larvae for live imaging</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>Mounting larvae for live imaging</td></tr><tr><td>FluoroDish (glass bottom dish)</td><td>World Precision Instruments, Inc.&amp;nbsp;</td><td>FD35-100</td><td>Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica Microsytems</td><td>SP-2, SP-5</td><td>Microscope for high magnification live imaging</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Nikon</td><td>SM21500</td><td>Microscope for low magnification live imaging</td></tr><tr><td>Glass culture tubes&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>73500-13100</td><td>Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Plus&amp;nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A</td><td>Lipid extraction</td></tr><tr><td>Channeled TLC plates</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821</td><td>Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued</td></tr><tr><td>Channeled TLC plates</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>Fluorescent plate reader for food intake assay</td></tr><tr><td>ImageQuant software</td><td>GE Healthcare</td><td>29000605</td><td>Analysis of food intake assay</td></tr><tr><td>5 3/4&amp;rsquo; Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>Transfering larvae</td></tr></tbody></table>

high-fat feeding paradigm for larval zebrafish: feeding, live imaging, and quantification of food intake

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.

29-31 ° C&#39;de bir rocker verildiğinde, sağlıklı larvaların (≥95%) çoğunluğu 1 saat içinde yemek. yumurta sarısı emülsiyonu tüketen üzerine, larva bağırsak rengi koyulaşır. Çok koyu bağırsaklar 2 saat (Şekil 1) görülebilir. Larvalar beslenmemiş ya da beslemek için başarısız olursa, bağırsak açık kalır. Larva beslenen yumurta beyazı sergi renkli karartmak değil şişmiş bağırsak lümen. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54735/54735fig1.jpg" /> Şekil 1:. Gıda Alımı için Larva tarama Yabani tip 6-dpf&#39;e larvaları 2 saat EM% 5 yumurta sarısı ile beslenen ya da beslenmemiş kontrolleri elde etmek EM paralel olarak tedavi edildi. Stereoskop üzerinde 10X görüntülü zaman yumurta sarısı tüketilen beslenen larvalar koyu bağırsakları varken beslenmemiş larvaları açık bağırsakları var. Ölçek çubukları 0.1 mm temsil etmektedir.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Floresan bir lipid analogları ile besleme sistemik taşıma ve diyet lipid hücre içi birikiminin görselleştirme izin verir. 8 hr-yalın yöntem ve dik bir amaç ile görüntülenmiş lamel (Şekil monte için floresan sinyal 6.4 uM floresan C 16 analog larva beslenen% 5 yumurta sarısı sindirim organlarının (bağırsak, karaciğer, pankreas ve) boyunca mevcut 2) 3. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54735/54735fig2.jpg" /> Şekil 2:. 6 DPF larva Floresan Lipid Analogları görselleştirme Diyet Lipit Ulaşım Temsilcisi kompozit görüntü (sağa dönük kafa) 8 saat C 16 6.4 uM BODIPY FL ile EM% 5 yumurta sarısı ile beslenen. Larvalar yalın-yöntem lamel ile% 3 metil selüloz monte ve dik 63x ile görüntülendi<html> argon lazer ile tek bir foton konfokal mikroskop yağ daldırma objektif. Ölçek çubukları 20 uM temsil etmektedir. Karaciğer, L; bağırsak, I; pankreas, P, safra kesesi, GB; Dev Bio 3 izniyle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54735/54735fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bunların farklı kompleks lipidler (örneğin, trigliseridler, kolesterol esterleri, fosfolipidler) metabolize çünkü çeşitli lipid analoglan hücresel yapıların benzersiz kümesinin görselleştirme sağlar. Aşağıdaki 4-8 saat, beslemeleri floresan C 16 ve C 12 analogları lipid damlacıkları, floresan FL C 5 etiket lipid damlacıkları, karaciğer ve pankreas kanallarının, hücre zarının ve arteriyel ağları ve floresan C 2 analog hepatik ve pankreatik kanalları ve hücresel etiketleri etiket membranlar (Şekil 3) 3. <html> ove_content &quot;fo: keep-together.within sayfa =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54735/54735fig3.jpg" /> Şekil 3:. Farklı Floresan bir lipid analoglan Etiket benzersiz Hücresel Organlar larvaların Örnek kompozit görüntüler 4-8 saat (6 dpf) için C, 16 ° C, 12 ° C 5 veya C2-6,4 uM BODIPY FL ile EM içinde% 5 yumurta sarısı beslenen . C16 analog enterositler lipid damlacıkları (LD) gözlenmiştir, bağırsak lümeninde enterosit LD ve bağırsak lümeninde ve C2 analog C12 ve 5 analoglan. Larva yalın-yöntem lamel% 3 metil selüloz monte edilir ve bir argon lazer ile tek foton konfokal mikroskop dik 63X yağa batırılmış objektif ile görüntülendi. Ölçek çubukları 20 mikron temsil etmektedir. İlaç Discov Bugün Dis Modelleri 22 izniyle.&quot;_blank&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. larva gıda alımı tahlil nasıl genetik mutasyonlar, transgenik gen aşırı ekspresyonu araştırmak için geliştirilen ve / veya eksojen tedavi larva gıda alımını etkiler. Larva tüketilen gıda miktarını belirtmek için bir floresan lipid analog ile çivili bir lipit bakımından zengin bir yemek beslenir. Beslenmemiş larvaları Floresan bir lipid analoğu tespit edilebildiği de duyarlılığı artırmak, larvaları, bu eşiğe miktarının normale paralel olarak toplanır. Bu deney, Apolipoprotein A-IVb.1 (apoA-IVb.1) gıda alımını azaltır ve aşın göstermek için kullanılmıştır. Daha önce beslenmemiş Tg (hsp70: apoA-IVb.1: mCherry) larva 7 dpf&#39;e 4 saat 6.4 uM floresan C 16 analog% 10 yumurta sarısı ile beslenen (Şekil 4) 20 vahşi tip larva yaklaşık% 30 daha az lipidler tüketti. Şekil 4:. Örnek gıda alımını Deneyi, vahşi tipteki (WT) ve TG (HSP70: apoA-IVb.1: MCherry) (Tg) larvaları ile beslenen% 10 tavuk yumurtası sarısı 4 saat (Fed) ya da 6.4 uM BODIPY FL C16 ile EM (beslenmemiş) paralel olarak işlemden geçirildi. (A) Larvalar (n = 10) bir araya getirilmiş, lipitler ekstre edildi ve ekstraklar, bir TLC plakası üzerinde tespit edildi. (B) Toplam floresan ölçüldü, çıkarma ile beslenmemiş kardeşlerinde eşiğe normalize keyfi floresan birimlerinin (AFU), ifade ve WT göre ifade edilmiştir. WT ile karşılaştırılarak gösterildiği gibi ApoA-IVb.1 az floresan etiketli lipid analoglan yemek aşırı ifade Tg larvaları (Student t-testi, p &lt;0.001 eşleştirilmiş n = 9, deney başına 20 larva). Kutu 25-75 inci yüzdelik temsil eder ve medyan gösterilir. Bıyık 10-90 inci yüzdelik göstermektedir. yayımlanmaktadırDis Modeli Mech 20 izni ile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54735/54735fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake at JoVE.com

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.

Larva Zebra balığı için Paradigma Besleme Yüksek yağlı: Besleme, Canlı Görüntüleme ve Gıda Alımı miktarının belirlenmesi

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

high-fat-feeding-paradigm-for-larval-zebrafish-feeding-live-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Görüntüleme.  Carnegie Institution for Science. Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques. 

Video: High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

Davranışsal yanıt profilleri larva balık incelenmesi için deneysel protokol: nöro-uyarıcı kafein uygulamaya

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Çevre

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all liver cancer cases. With the introduction of effective treatments to prevent and treat hepatitis B/C, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and the more aggressive form know as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), are quickly becoming the number one risk factors to develop HCC in modern societies. To better understand the role NASH has on the development of HCC we designed a NASH-associated HCC zebrafish. The optical clarity and genetic tractability of the zebrafish larvae make them an appealing and powerful model to study the liver microenvironment and immune cell composition using non-invasive fluorescent live imaging. This protocol describes how to use a NASH-associated HCC zebrafish model to investigate the effect of cholesterol surplus in the liver microenvironment and its impact on immune cell composition at early stages of the disease. First, we feed HCC larvae (s704Tg), which express hepatocyte-specific activated beta-catenin, with a 10% high cholesterol diet for 8 days to develop a NASH-associated HCC model. Here we describe how to make use of different transgenic lines to evaluate several early malignancy features in the liver by non-invasive confocal microscopy, such as liver area, cell, and nuclear morphology (hepatocytes area, nuclear area, nuclear:cytoplasmic ratio (N:C ratio), nuclear circularity, micronuclei/nuclear herniation scoring) and angiogenesis. Then, using transgenic lines with tagged immune cells (neutrophils, macrophages, and T cells) we show how to analyze liver immune cell composition in NASH-associated HCC larvae. The described techniques are useful to evaluate liver microenvironment and immune cell composition at early hepatocarcinogenesis stages, but they can also be modified to study such features in other liver disease models.

Here, we present how to generate a non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-associated Hepatocellular Carcinoma (HCC) zebrafish model to study the impact of cholesterol surplus on liver microenvironment and immune cell landscape.

Zebra Balığında Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığına Bağlı Hepatosellüler Karsinomun Erken İlerlemesi Sırasında Karaciğer Mikroçevresinin Analizi

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

Kanser Araştırmaları

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Zebra balığı Larva otomatik Yüksek verim Davranış Analizleri

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Nörobilim

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

Brightfield Mikroskobu Kullanan Larva Zebrabalığında Karaciğer Boyutunun Ölçülmesi

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Gelişim Biyolojisi

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

Protozoon Terliksi Hayvan caudatum zebra balığı larva gıda kaynaklı enfeksiyonlar için bir araç olarak kullanma

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Zebra balığı larvalarının Microgavage

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Biyoloji

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Yüksek Verimli<em&gt; Danio rerio</em&gt; Enerji Harcaması Deneyi

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

In vivo (İn canlı) Zebra Balığı Larvalarının Tüm Beyin Görüntülemesi

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

Yazar Spotlight: Üç Boyutlu Floresan Mikroskobu Kullanılarak Zebra Balığı Larvalarının İn Vivo Tüm Beyin Görüntülemesi  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

İn Vivo Üç Boyutlu Floresan Mikroskobu Kullanılarak Zebra Balığı Larvalarının Tüm Beyin Görüntülemesi

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...

Larva Zebra balığı için Paradigma Besleme Yüksek yağlı: Besleme, Canlı Görüntüleme ve Gıda Alımı miktarının belirlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Davranışsal yanıt profilleri larva balık incelenmesi için deneysel protokol: nöro-uyarıcı kafein uygulamaya

Zebra Balığında Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığına Bağlı Hepatosellüler Karsinomun Erken İlerlemesi Sırasında Karaciğer Mikroçevresinin Analizi

Zebra balığı Larva otomatik Yüksek verim Davranış Analizleri

Brightfield Mikroskobu Kullanan Larva Zebrabalığında Karaciğer Boyutunun Ölçülmesi

Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü

Protozoon Terliksi Hayvan caudatum zebra balığı larva gıda kaynaklı enfeksiyonlar için bir araç olarak kullanma

Zebra balığı larvalarının Microgavage

Yüksek Verimli

İn Vivo Üç Boyutlu Floresan Mikroskobu Kullanılarak Zebra Balığı Larvalarının Tüm Beyin Görüntülemesi

İn Vivo Üç Boyutlu Floresan Mikroskobu Kullanılarak Zebra Balığı Larvalarının Tüm Beyin Görüntülemesi