Bu çalışma NIH hibe AI071815 (CEH) ve Yol Haritası Nanotıp Geliştirme Merkezi ödülünü PN2EY016586 (MLD) tarafından desteklenmiştir.

1. GP 120, Etiketleme Bu protokolde kullanılan floresan boyalar, proteinlere bağlanarak etkili olan mikroskobik görüntüleme için yeterince fotoğraf stabil durumda ve bizim mikroskop ile kullanılabilir lazerlerin dalga boyları uyarma maç. Etiketleme proteinler için floresan moleküller seçerken Bu üç kriter yerine getirilmesi gerekir. <ol><li> Döviz Onun gp120 DH12 (Dr. Michael Cho, Iowa State Üniversitesi tarafından hediye) santrifüj filtre ünitesi (30 kDa MWCO) ile steril PBS protein tampon 6-etiketli. Gp120 konsantrasyonu fazla 1 mg / ml olmadığından emin olun. Not: Onun 6-etiketli diğer X4 veya R5 tropik suşları gp120 proteinler de test edilmiş ve ticari İmmün Technologies şimdi mevcuttur var. </li><li> ~ PH 8.5 olan sodyum bikarbonat 50mM son konsantrasyon elde etmek için protein çözeltisine sodyum bikarbonat pH 9.0 ekleyin. </li><li> Di amin reaktif Alexa Fluor 488 (AF488) floresan boya, ekleBir 10-kat molar fazlalıktan az su içinde ssolved. Karanlık oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca bu karışım inkübe. </li><li> Fazla boya kaldırmak için, daha önce olduğu gibi santrifüj filtre ünitesi kullanın ve sütun taze steril PBS ekleyin. Tüm ücretsiz boya (4 ml PBS ile 3-4 yıkar) kaldırılıncaya kadar bu adımı yineleyin. Gp120 yaklaşık 1 mg / ml &#39;ye kadar konsantre edilir aşağı doğru dönmeye başlayacaktır. Not: boya suda çözünür ya da başka bir jel filtrasyonu kullanılabilir ise diyaliz veya santrifüj filtre ünitesi tarafından serbest boya çıkarma çalışır. </li><li> Etiketli protein proteini (F / P) bir molekül başına floresans yoğunluğunu ölçmek için, uygun dalga boyunu (örneğin, AlexaFluor 488 için 488 nm&#39;de) ve protein olarak floresan boya konsantrasyonları (uM cinsinden) (kullandığımız belirlenmesi ardından &#39;protein ve etiketleri&#39; ayarı) kullanarak ve bir NanoDrop spektrofotometre Eğer F / P oranı veren bu iki sayının bölün. Aynı prosedür gibi ICAM-1 ve Cy5 gibi diğer proteinler ve boyalar için kullanılır. Not: spectroph diğer tipleriotometers bir NanoDrop mevcut değilse, F / P oranı elde etmek için protein konsantrasyonunu ve floresanslı boya konsantrasyonu elde etmek için kullanılabilir. </li></ol> 2. Akış Hücre Montaj ve çift-katlı Hazırlık Akış hücresi ve çift-katlı hazırlanması için genel prosedür, daha önce 14 ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Burada bir Bioptech akış hücresi üzerine yaptığı 6-etiketli gp120 DH12 içeren bilayers hazırlamak için özel protokol özetlemektedir. Bulaşıcı virüsler veya enfekte olan hücreleri içeren çalışmalar için ve ne zaman küçük miktarlarda sınırlı reaktifler, bir tek Ibidi akışı odası (yapışkan Slayt I 0.2 Luer) nedeniyle gerekli adımlar 2,4-2,9 aynı çift katmanlı hazırlık prosedürü ile kullanılır ve takip edilebilir. Ibidi akışı odaları için bilgi şirketin web sitesi, elde edilebilir <a href="http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf">http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf</a> </a&gt;. <ol><li> Pirhana çözeltisi (45 ml sülfirik asit (Trace Metal derecesi% 98) ve 15 ml% 30 hidrojen peroksit) 14 hazırlayın. Plastik kelepçeleri ile batırmayın kapağı 15 dakika Pirhana çözüm kayıyor. </li><li> Pika-saf su ile dolu bir behere kayar kapağı ve 2 dakika (her bir tarafta bir dakika) için akan suyun altında her biri yıkayın aktarın. Kuruması için raf üzerine yerleştirin. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi 14 Bioptechs FCSII odaları birleştirin. </li><li> % 12.5 ihtiva eden bir lipozom karışımı Ni 2 + şelatlama lipidler 16 yakalama ve iki tabakalı bir yüzeye His 6-gp120 sunulması için kullanılır. Cama ucu dokunmadan microaqueduct slayda lipozom karışımından 1 ul damla ekleyin. Daha önce gösterildiği gibi, 14, beş nokta 1μl vardır, böylece akış hücre başına 5 bilayers maksimum hazırlamak için, 4 kez daha fazla tekrar edin. </li><li> Lipidler üstüne kapak kayma yerleştirin. Paslanmaz çelik bir cl ile beyaz tespit bileziği Kapakamp ana ünite üzerinden tüm aparatları çevirmek ve mühür. Bir işaretleyici ile bilayers yeri işaretleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe. </li><li> Video &#39;de gösterildiği gibi, sol perfüzyon tüp için iki-yollu ile tüp takın. 50 ml 10x HBS [10x: Üzerinde 3-yollu (tüp daha önce insan serum albumini (HSA) (HBS / HSA içeren Hepes tamponlu salin (HBS) dolmuştur ile tüp sonunda olumlu bir menisküs üret HEPES tamponlu tuzlu: 200 mM HEPES, pH 7.2, 1.37 M NaCl, 50 mM KCI, 2 HPO 4 Na 7 mM, 60 mM D-glukoz] 20 ml 25x HSA, 500 ul 1M CaCI2, 1 ml 1 M MgCl2 ve dH 500ml ve 0.22μm filtre ile filtre) bir toplam hacim getirmek için 2 0 ve kabarcıklar yoksundur. sağ perfüzyon tüpü hortumu bağlayın ve yavaşça akış hücresi ile tampon itin. </li><li> 1 ml şırınga doldurma ve 3-yollu bir açık kısmına takarak 100 uM NiCl 2 içeren kazein ~ 300 ul ile iki tabakalı engelleyin. Gently yoluyla tampon itin ve şırınga boşaltırken önce her iki stopcocks kapatın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> His 6-etiketli AF488-etiketli gp120 (konsantrasyon olarak 16 in daha önce tarif belirlenir) eklenir. Biz HIV-1 virionu yüzey 17&#39;de bulunabilir env kümelerin yerel yoğunluk taklit etmek gp120/μm 2 ~ 250 moleküllerdir. Daha önce 14 olarak bildirilen Benzer şekilde, iki tabaka üzerine ~ 250 molekülleri / um ICAM-1 2 kullanın. Kazein ile yapılabilir gibi akış hücre içine yerleştirin. Oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika (folyo ile kaplayın) inkübe. Aynı prosedür gibi His-12 etiketli iki tabakalı üzerine ICAM-1 Cy5-etiketli gibi diğer proteinler ayırmak için kullanılır. </li><li> Tampon 5 ml bilayers yıkanır. </li></ol> 3. FRAP üzerinden Bilayers Kalite Kontrolü Bilayers Proteinler yanal yayılabilir olmalıdır. Bilayers üzerine hücreleri eklemeden önce, bu temin etmek önemlidirHazırlanan iki tabakalı proteinlerin hareketliliği. Burada konfokal mikroskoplar tarama TIRF, geniş alan Epifloresans veya lazer ışıklı en objektif üzerinde elle yapılabilir (FRAP) yöntemi 3 Photobleaching sonra Floresan Kurtarma açıklar. Amaç çift katlı lipid, ağartıcı bir nokta, ve ağartılmış alana unquenched moleküllerin dönüş izlemek için floresan görüntü tamamen homojen alanları etmektir. 2 dakika içinde% 50&#39;lik bir geri kazanım kabul edilebilir. Bütün büyük mikroskop üreticileri (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) bu uygulama için iyi çalışır objektif ışıklı TIRF sistemleri satmak. Her bir şirketin TIRF aydınlatma ve diğer işlevsel özelliklerinden varyasyonları sağlarken, görüntü kalitesinde esasen aynıdır. <ol><li> Ağartma en aza indirmek için düşük uyarım yoğunluğu kullanın. Böyle bir NA 1,3-1,45 40x, 60x veya 100x gibi yüksek sayısal açıklık objektif kullanın. Işık intens azaltmak için, standart bir floresan veya TIRF mikroskobu kullanılarak zamanSığ, uyarma ışık yolu nötral yoğunluk filtreleri koydu. Çoğu lazer sistemleri düşük voltaj ile akusto optik ayarlanabilir filtre (AOTF) veya akusto optik ışın ayırıcı (Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor) ayarlayarak düşük aydınlatma için ayarlanmış olabilir. </li><li> Bir &quot;ön-bleach&quot; görüntü kaydedin. Düşük ışık koşullarında binning telafi etmek için, soğutmalı bir CCD kamera ile 2x2 veya 4x4 olarak ayarlanmış olabilir Eğer kazanç kullanılabilir, yüksek ya da uzun pozlama (saniye sırasına örneğin) ayarlanmış olabilir. Bir konfokal kullanıyorsanız, iğne deliği diyafram açılabilir; kazanç yüksek ayarlayın ve yavaş tarama veya kullanılan ortalama. </li><li> Bleach bir nokta. Standart bir floresan veya TIRF mikroskop kullanıyorsanız, maksimum şiddeti aydınlatma sağlamak için tüm ND filtreleri kaldırırsanız, alan diyafram kapatın ve birkaç saniye için örnek maruz bırakmaktadır. Konfokal tarama bir lazer kullanarak, ağartıcı bir noktaya 8x yaklaşık 4x lazer güç ve maksimum zoom ayarı. Eğer Konfokal kullanımı için bir uyarı: çok yüksek yakınlaştırma değil iki tabakalı dizgin zarar görebilir çünkügeniş anlamda kullanılmaktadır fotonlar yoğunlaştı. </li><li> On on beş saniye aralıklarla, görüntü kaydetmek 3.1 ve 3.2 ile aynı aydınlatma ve kayıt ayarlarını kullanarak. Iki üç dakika içinde nokta &quot;ön-bleach&quot; görüntünün ancak yaklaşan yoğunluğu kurtarmak gerekir. Hızlı kurtarma başarılı bir mobil çift-katlı bir işaretidir. Spot karanlık kalırsa kenarı yüksek kontrast koruyorsa, ve özellikle, floresan proteinleri iki tabakalı hareketsizse ve deney için kullanılmamalıdır. </li></ol> Not: Mevcut mikroskop, biz 4 saniyeden daha kısa sürede tipik konsantrasyonlarda floresan ICAM açıcılar 240 mikron 2 lik bir alana sahip dairesel bir noktaya 641 nm ışık 0.9 mW sunabilirsiniz. Okuyucular 30 saniyeden az bir kez tekrarlanabilir bir şekilde bu testte gerçekleştirmek için fazlasıyla yeterlidir beyazlatma ile bir Hg veya Xe lamba kritik uyum bulmalısınız. Ayrıca ek det için 3 başvuru için sevk edecekleriniyerli diziler. 4. Hücreler ve İmmünofloresan Boyama Enjeksiyon <ol><li> 37 ° C (bu, yaklaşık 30 dk için bir CO 2 ile 37 ° C inkübatörde yapılabilir) ile akış hücresi ısınmaya. </li><li> 1 ml şırınga ile aktive insan CD4 + HBS / HSA ~ 400 ul T hücrelerinin (2-5x10 6 / akış hücresi) ekleyin. Hücreler 37 ° C inkübatörde ~ 45 dk için çift-katlı eklemek edelim. Ibidi odaları kullanılması durumunda, ek tampon her 15-20 dk kaynağı. </li><li> % 2 paraformaldehit enjekte edilerek hücreleri düzeltmek ve 37 de 10 dakika inkübe ° C. </li><li> 1 ml oda sıcaklığında PBS tamponu ile 3x yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 hücreleri enjekte edilerek geçirgenliği. </li><li> Oda sıcaklığında PBS tamponu 1 ml (fosforile proteinlerin sondalama zaman, işleme sırasında fosfat kaldırılmasını önlemek için PBS 1mM son konsantrasyon veya başka bir fosfataz inhibitörü sodyum vanadat ekleyebilirsiniz) 3x yıkayın. Için% 5 keçi serumu ile kazein kullanarak engellemeOda sıcaklığında 25 dak. Hayvan serumu tipi sekonder antikor bağlıdır. </li><li> Oda sıcaklığında PBS tamponu 1 ml 3x yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat - 30 dk için ~ 300 ul tamponu / akış hücresi olarak primer antikorun ekleyin. İlk zar-proksimal aktivasyon sinyali algılamak için, LCK total veya Fyn, (pLck) lck fosforile için özel antikorlar kullanır. </li><li> Oda sıcaklığında PBS tamponu 1 ml 3x yıkayın. Primer antikor ile yapılan tampon olarak uygun floresan ile işaretlenmiş sekonder antikor ekleyin. Bizim deneyler için, keçi anti-tavşan sekonder 568-etiketli Alexa Fluor kullanın. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. PBS tamponu 1 ml 3x yıkayın. </li><li> Not: Sadece sekonder antikor (hiçbir birincil antikor) ile tedavi edilmiş bir kontrol çift katlı olması şarttır. Adımları 4.1-4.5 ve 4.6 atlama izleyin, sonra adım 4.7 ile devam edin. Bu ikincil antikorun spesifik olmayan bağlanma seviyesinin belirleyecektir. Alternatif olarak, bir etiket, doğrudan kullanabilired primer antikorlar. </li></ol> 5.. TIRF mikroskopi ile görüntü alma TIRF mikroskopisi, bir 250 nm ya da cam substrat ve hücre ara yüzeyde ince düzlemi ile sınırlı flüoresan sinyallerin eksitasyon sağlar. Bu çift katlı lipid gelen ve hemen apposed hücre zarları sadece sinyallerin görüntü alımı garanti eder. Bu nedenle, sinaps sadece moleküller görüntülenmiştir edilir. Hücre altındaki TIRF görseller membran-proksimal alanı için, dorsal membran içine içselleştirmiş veya yeniden dağıtılır proteinleri tespit edilmez. Daha sonra ek olarak, standart Geniş açılı, ya da diğer hücre birimleri ile karşılaştırıldığında birikimi ya sinaptik alanda proteinlerin dağılımını saptamak için konfokal mikroskopi ile görüntü elde etmek için önemli olabilir. Bütün büyük mikroskop üreticileri (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) bu ap için işe objektif ışıklı TIRF sistemleri satmakplikasyon. Her bir şirketin TIRF aydınlatma ve diğer işlevsel özelliklerinden varyasyonları sağlarken, görüntü kalitesinde esasen aynıdır. Her TIRF mikroskop çalışması için kendi ayrıntıları vardır, ama aşağıdaki genel kurallar yüksek çözünürlüklü görüntü elde etmek için geçerlidir. <ul><li> Aydınlatma ağartma önlemek için düşük olmalıdır. </li><li> Kamera lineer bir cevap olmalıdır. </li><li> Kamera hiçbir doygunluğu ile görüntüleme geniş dinamik aralık yeteneğine sahip olmalıdır. </li><li> Tüm ayarlar kantitatif analizleri için sürekli ayarlanması gerekir. </li></ul> 6. Veri Analizi CD4 + VS de gp120 ile T hücre etkileşimi sonucunda aktif hücre içi sinyalleri incelemek için, TIRF görüntüleri kantitatif analizleri gibi aktif ve sinaps 15 alınırlar lck ve Fyn gibi olsun ya da hücre içi sinyal molekülleri belirlemek için yapılır. Burada çoğu görüntü analizi için uygulanan basit bir yöntem tarifBöyle ImageJ ve Metamorph gibi uygulama paketleri. Biz burada yöntem 12 için Windows, Macintosh ve Linux üzerinde çalışan ImageJ, kullanmışlardır. Analyze&gt; Set Ölçümleri sekmesinde, Alan için onay kutularını ve gri Ortalama değer. Bir çokgen veya bir serbest izlenen kapalı şekli resmin üzerine ilgi bir bölge yapmak ve&gt; Ölçü analiz ne zaman, yazılım bir sonuç tabloda bu ölçüm verileri koyacağız. Alan piksel sayısında ya da 2 um olacaktır. Ortalama keyfi birimler ortalama yoğunluğudur. Bunun çıkarılır arka yoğunluğu sahip olması gerekir. Alanı tarafından ortalama çarparak eksi arka keyfi bir birim içinde proteinin entegre yoğunluğu döner. <ol><li> Ortalama ve Alan için ölçümleri ayarlayın. </li><li> Bir deney durumu için görüntüleri açın. </li><li> Her hücre için, takip ve ilgi (ortalama) bölgesi ölçmek ve izlemek ve faiz (arka plan) bölge dışında bir bölgeye ölçmek. </li><li> Zaman, bir deney koşulu ile kopya ölçümleri da yapılıyor ve Excel ya da diğer elektronik tablo programı içine yapıştırın veya ölçümleri kaydedin. </li><li> Her deneysel koşul için 6.2 adıma geri dönün. </li><li> Ölçümler tamamlandığında, sonuçları hesaplamak. Formül şunlardır: Ortalama yoğunluğu = ortalama - arkaplan Entegre yoğunluğu = Ortalama yoğunluğu * alan </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar VS azından gp120 ile etkileşimi sonucu olarak, başlangıç ​​membran-proksimal sinyalleşme LCK molekülleri ve Fyn aktivasyonu ve alım ölçmek için, birincil insan CD4 + T hücreleri gp120 ve ICAM-1 15 taşıyan bilayers üzerine getirilmiştir. Sadece ICAM-1 ile bilayers tanıtıldı Hücreler sinyal bazal düzeylere tanımlamak için bir kontrol olarak görev yaptı. Specific floresans yoğunluğunu ICAM-1 çift-katlı ile etkileşen hücreleri için gp120 ve ICAM-1 içeren bilayers ve bütün temas alanı içinde hücreleri için gp120 temas alanı içinde ölçülmüştür. Ortalama floresan yoğunluğunda bir artış, bir genişletilmiş işareti işe alım ve VS sinyal molekülünün aktivasyonu. Bu, daha da entegre floresans yoğunluğunu benzer bir artış ile gösterilecektir. Bununla birlikte, entegre floresans yoğunluğunu herhangi bir değişiklik olduğunda ise, bu sinyal molekülünün bir dağıtılması gösterir. Hücreleri gp120 ve ICAM-1, lck toplam ve pLck (Y394) içeren bilayers etkileşim sonra VS arayüzü alınan ve gp120 (Şekil 1 ve 2) ile kolokalize edildi. LCK toplam ortalama yoğunluğu (Şekil 1) tek başına ICAM-1 ile daha gp120 ve ICAM-1 hem de içeren iki tabaka daha yüksek, ama entegre yoğunluk seviyeleri (Şekil 1) benzerdi, lck içine yeniden dağıtılır düşündürmektedirCD4 + T hücre gp120 bağlama üzerine merkezi bir küme. Ancak, pLck (Y394) (Şekil 2) miktarının gp120 ve ICAM-1 içeren bilayers üzerinde ortalama yoğunluğu ICAM-1 tek başına bilayers üzerinde daha yüksek olduğunu gösterdi ve entegre yoğunluğu gp120 ve ICAM her ikisi ile bilayers daha yüksek oldu -1 ICAM-1 tek başına bilayers ziyade. Arayüzünde lck toplam seviyeleri gp120 ve ICAM-1 ve ICAM-1 tek başına bilayers, aktivasyon döngü lck az kalıntı Y394 ve gp120 bağlayıcı artış fosforilasyon üzerine yapışan hücreler benzer iken bu olduğunu gösterir. Bunun aksine, Fyn fazla gp120 Fyn ve ICAM-1 hem de ihtiva bilayers üzerinde daha ICAM-1 tek başına bilayers üzerine hücrelerinin temas alanında mevcut olduğu gibi, (Şekil 3) VS için işe değildi. Sonuç olarak, Fyn değil, lck, HIV-1 gp120 kaynaklı VS aktif kinaz olduğu sonucuna varıldı. Şekiller: at Membran-proksimal sinyal HIV-1 gp120 kaynaklı VS. Üzerindeki temsilcisi hücrelerin Görüntülerigp120 + ICAM-1 çift-katlı (üst panel) ve ICAM-1 çift-katlı (alt paneller) gösterilmektedir. Şekil 1 &#39;de sarı bir çizgi ile işaretlenmiş bölge tarafından gösterildiği gibi, tek tek hücrelerin floresans yoğunlukları hücre izlerin bir elle takip alanları içinde ölçüldü. TIRF mikroskopi ile saptanan ortalama yoğunluğu ve entegre Kantitasyonu, sırasıyla, sol ve sağ grafik olarak gösterilmiştir. 30-350 hücreleri toplam, her durum için ölçüldü. Barlar = 5 mm. Üç tekrarlama deneyler birindeki verileri gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3757/3757fig1.jpg" /> Şekil 1. CD4 + T hücreleri 45 dk için tek başına gp120 ve ICAM-1 ya da ICAM-1 içeren bilayers üzerine sunulan ve daha sonra sabit ve LCK toplam boyanmıştır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3757/3757fig2.jpg" /> Şekil 2. CD4 + T hücreleri iki tabakalı üzerine tanıtıldıs 45 dk için tek başına gp120 ve ICAM-1 ya da ICAM-1 içeren ve daha sonra pLck (Y394) için ve lekeli sabitlenir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3757/3757fig3.jpg" /> Şekil 3. CD4 + T hücreleri 45 dk için tek başına gp120 ve ICAM-1 ya da ICAM-1 içeren bilayers üzerine sunulan ve daha sonra sabit ve toplam Fyn için boyanmıştır.

<ol>
	<li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions.">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li><li>Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+kinetics.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics.</a> J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Bond+Dynamics+in+Contacts+between+T+Lymphocytes+and+Glass-supported+Planar+Bilayers+Reconstituted+with+the+Immunoglobulin-related+Adhesion+Molecule+CD58.">Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58.</a> J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).</li><li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity.">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li><li>Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+host+cell-surface-derived+molecules+by+HIV-1.">Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1.</a> Aids. 10, 1611-1620 (1996).</li><li>Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+adhesion+molecules+in+HIV+type+1+infection+and+their+impact+on+virus+neutralization.">Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, S247-S254 (1998).</li><li>Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LFA-1+expression+on+target+cells+promotes+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+and+transmission.">LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission.</a> J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li><li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions.">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li><li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus.">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+virion+ICAM-1+to+human+immunodeficiency+virus+infectivity+and+sensitivity+to+neutralization.">Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.</a> J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).</li><li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse.">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li><li>Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120-induced+partial+T-cell+receptor+signaling+creates+an+F-actin-depleted+zone+in+the+virological+synapse.">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse.</a> J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).</li><li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4++T+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li><li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes.">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li></ol>

Yazarlar çıkarları hiçbir çatışma beyan ederim.

Önceki çalışmalar, hücre-hücre konjuge sisteminde görüntülenmiştir VS var, ancak bu çalışmalar sinaps de supramoleküler yapıları görselleştirmek için yeterince yüksek çözünürlüklü görüntüleri vermedi. Laboratuar olarak, virüs zarf gp120 ve hücresel adezyon molekülü ICAM-1 eksprese enfekte hücrelerin yüzeyine temsil cam desteklenen düzlemsel iki tabakalı sistemi kullanılmaktadır. Yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahip iki tabakalı yüzeye 100-200 nm içinde floresan sinyalleri algılar TIRF mikroskobu ile birlikte, biz VS az ICAM-1 gp120 ve supramoleküler ayrılığı tespit edebildi. VS 15 azından gp120-temas alanı için, Fyn Dahası, standart bir yöntem immun iki tabakalı sistemine uygulanabilir ve LCK aktif spesifik alım algılamak ve ölçmek için kullanılmıştır, ancak. Bu nedenle, düzlemsel iki tabakalı TIRF mikro bir 2D düzlemde sinaps arayüzü yüksek çözünürlüklü görüntüleme için bir deney sistemi sunuyorSkopi, hem geniş alan veya konfokal aydınlatma yöntemleri gibi. Ancak, sistemi de out-of-düzlem, ligand hareketlilik ayarlanması gibi sınırları vardır ve biyolojik membranların dalgalanmalar düzlemsel bilayers tarafından yeniden değildir. Dahası, bu bir in-vitro sistemde ve bu nedenle bu tür moleküler hareketlilik ve hücresel motilite düzenleyen enfekte hücre ve hücre iskeleti makine üzerinde mevcut olacağını, diğer membran moleküllerini eksikliği gibi diğer sınırlamalara sahiptir. Ayrıca, bu tür trimerler karşı gp120 monomerleri gibi moleküller, dinamikleri ve dağıtım iki tabaka üzerinde fizyolojik temsil edilemez. Bununla birlikte, belirgin olmadığını hatta bu sınırlamalar, bu sistem virüs-hücre ya da hücre-hücre etkileşimleri çalışmak için hala çok değerli olduğunu ve bu yöntemleri supramoleküler örgütü tespit etmek ve yüksek çözünürlüklü resimler arayan araştırmacılar için yararlı bir rehber olarak hizmet edebilir Konvansiyonel hücre-hücre konjugatı sisteminde.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Onun tagged HIV gp120 </td><td> Dr Cho gelen Hediye </td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td> Onun tagged HIV gp120 </td><td> Bağışıklık Teknoloji </td><td></td><td> Çeşitli X4 veya R5 tropik </td></tr><tr><td> HSA </td><td> Williams Medikal Firma </td><td> 521302 </td><td> İnsan Serum Albumin% 25 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra Santrifüj Filtreler </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30K </td></tr><tr><td> Tavşan mAb lck </td><td> Hücre Sinyali </td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan pAb p-LCK </td><td> Santa Cruz Biyoteknoloji A.Ş. </td><td> Sc-101.728 </td><td> Tyr 394 </td></tr><tr><td> Fyn Tavşan mAb </td><td> Millipore </td><td> 04-353 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 2 °; Ab </td><td> Molecular Probes </td><td> A11034 </td><td> Keçi anti-tavşan IgG (H + L) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-20000 </td><td> karboksilik asit süksinimidil ester </td></tr><tr><td> FCS2 Odası </td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td> Slayt Microaqueduct </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> 30mm Yuvarlak w / delik </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td> 0.75mm kalınlığında </td></tr><tr><td> Dikdörtgen Conta </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 14x24 0.25mm kalınlığında </td></tr><tr><td> Tygon Boru </td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 1/16 &quot;(25ft) </td></tr><tr><td> Üç yollu Musluk </td><td> BioRad </td><td> 7328103 </td><td></td></tr><tr><td> İki yönlü Musluk </td><td> BioRad </td><td> 7328102 </td><td></td></tr><tr><td> Sabit Slayt Ben 0.2 Luer </td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td> Gözlük Kapak </td><td> Ibidi </td><td> 10812 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml şırınga </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> KÖPEK-NTA </td><td> Avanti Polar Lipidler </td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td> Avanti Polar Lipidler </td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td> Cam coverslip </td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40mm </td></tr><tr><td> TIRF mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> Ulusal Sağlık Enstitüleri </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

imaging of hiv-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers

İnsan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) enfeksiyonu hücre iletim 2,10,11 hücre ile en verimli şekilde oluşur. CD4 arasındaki hücre devir + T hücreleri bu hücrenin CD4 ile enfekte hücre HIV-1 zarfı gp120 ile angajman üzerinde oluşmuş bir F-aktin-bağımlı hücre-hücre bileşke bir viral sinaps (VS), oluşumunu içeren hedef hücre 8 kemokin reseptör (CKR) CCR5 veya CXCR4. Bu virüsle enfekte donör hücre yüzeyi üzerinde mevcut olan gibi gp120 ilaveten ve reseptörleri ile, özellikle diğer zar proteinleri, adezyon molekülü LFA-1 ve ligantlar olarak, ICAM ailesi, VS oluşumu ve virüs iletiminde önemli bir rol oynar ve hedef hücrelerin yanı sıra, HIV-1 virionlar 1,4,5,6,7,13 bir zarf. VS oluşumu ayrıca reseptörlerinin gp120-angajman bir sonucu olarak transdük edilir hücre içi sinyal olayları eşlik eder. Gerçekten de, son zamanlarda CD4 göstermiştir &lt;&gt; gp120 ile + T hücre etkileşimi TCR lck dahil signalosome, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76, ITK ve PLCγ 15 ile ilişkili sinyal molekülleri alımı ve fosforilasyon indükler sup. Bu yazıda, supramoleküler düzenleme ve VS oluşumu sırasında yer alan membran proksimal sinyalleşme olayları görselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Biz Viral zarfın gp120 ve hücre adezyon molekülü ICAM-1 taşıyan HIV bulaşmış hücre yüzeyi temsil eden bir model olarak indirgemeci cam desteklenen düzlemsel bir iki-katmanlı sistemi yararlanabilir. Protokolü etkileşim hücrelerinde hücre içi sinyal molekülleri tespit etmek için HIV-1 gp120 kaynaklı VS montaj ve bir akış hücresi i) çift katmanlı hazırlık ve montaj dahil sinyal aktivasyon olayları, ii) hücreler ve immünfloresan boyama enjeksiyon izlenmesi için genel yordamlar açıklanır TIRF mikroskopi ile HIV-1 çift katmanları gp120 ve ICAM-1, iii) görüntü elde etme, birnd iv) Veri analizi. Bu alt etki alanları için işe özgü sinyal molekülleri ile birlikte VS bireysel moleküler bileşenleri farklı salkım tespiti sağlayan bu sistem geleneksel hücre-hücre sistemi ile elde ötesinde VS arayüzünün yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers at JoVE.com

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Bu makale toplam iç yansıma floresans (TIRF) mikroskop camı desteklenen düzlemsel bilayers bir HIV-1 zarf kaynaklı virolojik sinaps oluşumu görselleştirmek için bir yöntem açıklanır. Yöntem ayrıca, HIV-1 zarfı ile endüklenen virolojik sinaps oluşumu sırasında meydana gelen sinyal molekülleri aktivasyonu ve dağıtılması algılamak için immünfloresans boyama yöntemi ile kombine edilebilir.

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

imaging-hiv-1-envelope-induced-virological-synapse-signaling-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.1K Görüntüleme.  New York University Langone School of Medicine. Bu makale toplam iç yansıma floresans (TIRF) mikroskop camı desteklenen düzlemsel bilayers bir HIV-1 zarf kaynaklı virolojik sinaps oluşumu görselleştirmek için bir yöntem açıklanır. Yöntem ayrıca, HIV-1 zarfı ile endüklenen virolojik sinaps oluşumu sırasında meydana gelen sinyal molekülleri aktivasyonu ve dağıtılması algılamak için immünfloresans boyama yöntemi ile kombine edilebilir.

Video: Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Bir Genotipik Yöntemi&#39;ne Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Ölçümü<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.