İskelet kas rejenerasyonunu düzenleyen insan kas atası hücrelerinin izole sokulması, donör değişkenliğini korurken rejeneratif sürecin temelini oluşturan süreçleri araştırmamıza olanak tanır. Bu teknik, az sayıda hücre kullanılarak az miktarda doku ve bunların henotipik analizinden insan kas dölat hücrelerinin büyük verimlerinin alınmasını sağlar. Bu yöntem özellikle insan kas atası hücrelerini izole etmek ve çoğalma ve farklılaşma yeteneklerini izlemek ve iskelet kas rejeneratif süreci ile bu verileri ilişkilendirmek için tasarlanmıştır.
Bu oldukça basit tekniğin en zor yönü, hücrelerin verimini ve saflığını optimize etmek için her adımın tekrar tekrar yapılmasını sağlamaktır. Hücrelerin başarılı bir şekilde yalıtımı için tamamlanması gereken birden çok adım vardır. Bazı adımların görsel olarak gözlemlenirse anlaşılması daha kolaydır.
Biyopsi dokusundan insan kas progenitor hücreleri izole etmek için, steril koşullar altında steril bir Petri çanak içine kas dokusu yerleştirin, ve bir milimetre küp parçalar halinde doku kıyma steril bir neşter kullanın. Tüm doku lar doğrlandığında, parçaları 10 mililitre PBS içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dokuları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice azarlamadan önce yer çekimine göre yerleşmelerine izin verin. Parçaları ikinci kez yıkadıktan sonra, PBS'yi 10 mililitre düşük glikozlu Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamıile değiştirin.
Dokular yerleştikten sonra supernatant çıkarın ve sindirim aracı üç mililitre parçaları yeniden askıya. 30 dakika boyunca 37 derece santigrat derecede dokular yerleştirin, bir mililitre serolojik pipet ile kas parçaları her 10 dakikada bir trituration ile. Kuluçka sonunda, numunelere 83 mikrolitre ek sindirim ortamı ve 24 mikrolitre Dispase çözeltisi ekleyin ve tek tip bir bulamaç elde edilene kadar dokuları her 5 ila 10 dakikada bir geniş delikli pipet ucuyla triturate.
Tek tip bir bulamaç insan kas atahücrelerinin maksimal kurtarma için önemlidir. Bulamaç standart 1,000 mikrolitrelik pipet ucundan geçmezse sindirime devam edin. Pax7-pozitif hücreleri izole etmek için, leke ve protokole göre hücreleri kapısı.
Sıralayın CD56, CD29 çift pozitif insan kas atası hücreleri bir akış sitometre bir akış sitometre ile 100 mikrometre nozül bir basınç ta inç kare başına 20 kilo floresan-hücre sıralama tampon 300 mikrolitrelik yastık içeren toplama tüpleri içine. Sonra kollajen kaplı 24-iyi plakalar içine sıralanmış insan kas atası hücreleri tohum 3.5 kat 10 santimetre kare konsantrasyonu için önceden ısıtılmış büyüme ortamı içeren. Birleştirme taramaları gerçekleştirmek için plakayı bir görüntüleme sitometresine yükleyin ve Yeni Tarama ve Plaka Kategorisi Oluştur, Plaka Profili ve Plaka Kimliği'ni seçin.Uygulama Altında, Confluence ve Confluence 1'i seçin ve görüntülemek için bir kuyu seçin.
Hücrelerin arka plana göre beyaz göründüğü bir odak düzlemi bulun ve Kayıt Kılavuzu'nu seçin. Taranması gereken tüm kuyuları vurgulamak için fareyi kullanın ve Tarama başlat'ı seçin. Tüm kuyu alanı otomatik olarak taranır.
Plaka ve hücre türü için en uygun çözümleme ayarlarını seçin ve Çözümle'yi Başlat'ı seçin. Başlangıçta birleşimi ölçmek için görüntüleme sitometresini kullanın. Daha sonra görüntüleme sitometresi üzerindeki hücreleri saymak için, her kuyudaki ortamı 200 mikrolitre boyama çözeltisi ile değiştirin.
37 santigrat derecede 15 dakika sonra, 100 mikrolitre taze Ham F12 ile boyama çözeltisini değiştirin. Plakayı görüntüleme sitometresine geri döndürün ve Uygulama altında Hücre Canlılığı ve Live Dead Total'i seçin. Canlı kanal parlak alan görüntü olacak, Dead kanal propidium iyodür boyama gösterecektir, ve Toplam kanal Hoechst 33342 boyama olacak.
Odak Kurulumu altında Otomatik'i kaydedin'i tıklatın. Toplam kanalının altında, kanalı maviye ayarlayın. Çekirdekleri odaklamak için Odak Bul'u kullanın ve odak noktasını seçmek için Ofset'i ayarla'yı tıklatın.
Ölü kanalının altında, kanalı kırmızıya ayarlayın ve ölü hücreleri odak lamak için Odak Bul'u kullanın. Odak noktasını seçmek için Ofset'i ayarla'yı tıklatın ve tarayıp başlatmak için Tsk'i Başlat'ı seçin. Ardından, plaka ve hücre türüne uygun çözümleme parametrelerini seçin ve çözümlemesi başlatmak için Çözümle'yi Başlat'ı seçin.
Çözümleme tamamlandığında, görsel olarak analizin hücreleri uygun şekilde saydığını doğrulayın. Tarama ve analiz tatmin ediciyse, plakayı kuvöze geri döndürün, aksi takdirde analiz parametrelerini tarayıp değiştirin. İnsan kas atası hücreleri ölü hücreleri veya enkaz ortadan kaldırmak için yan ve ileri dağılım alanı dayalı ilk gating olayları ile tespit edilebilir, 7-AAD için negatif ve bu nedenle canlı sadece hücreleri seçerek takip.
Cd56 ve CD29 hücre yüzeyi belirteçleri için pozitif hücreler daha sonra insan kas atası hücre popülasyonu temsil eder. İnsan kas atası hücreleri de Pax7 ifade ile tespit edilebilir. Nitekim, Pax7 FACS sonra toplam nüfus zenginleştirilmiş ve birden fazla pasajlar aracılığıyla korunur.
Burada, temsili bir kesişme tetkiki gösterilir. Yeşil anahatlar görüntüleme sitometresi tarafından oluşturuldu ve görüntüleme sitometresinin seçili analiz ayarlarına göre birleşimi nasıl belirlediğini gösterdi. Bir heterojenlik ve çekirdek sayıları donörler arasında yaygındır.
Bu heterojenliği keşfetmek ve doğru bir şekilde karakterize etmek görüntüleme sitometresinin önemli bir uygulamasıdır. Ancak, benzersiz donörlerin kesişme ölçümleri ve çekirdek sayıları son derece ilişkilidir. Miyotubelar oluşturmak için farklılaşmış insan kas atahücreleri embriyonik miyozin ağır zincir ekspresyonu ile ayırt edilebilir.
Her donörden aynı hücre popülasyonunu izole etmek için akış sitometresindeki gating parametrelerini seçerken tutarlı olmak önemlidir. Bir kez izole, insan kas atahücreleri birden fazla amaç için kullanılabilir, çoğalması ve insan kas atası hücrelerinin farklılaşması benzersiz metabolik gereksinimleri belirlenmesi de dahil olmak üzere. Insan kas atası hücrelerinin izolasyon insan ve fare kas atahücreleri üzerinde hücre yüzeyi marker ekspresyonu farklılıkları ayrımcılık izin verdi.
