Name: culture of adult transgenic zebrafish retinal explants for live-cell imaging by multiphoton microscopy
Uploaded: 2017-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy at JoVE.com

William Archer ve Notre Dame Entegre Görüntüleme Tesisi tarafından sağlanan destek için teşekkür ederiz. Özel teşekkür onların sürekli yardım ve onların bakım ve zebrafish hayvancılık için Freimann Yaşam Bilimleri teknisyenleri yönlendirilir. Bu çalışma DRH için NIH Ulusal Göz Enstitüsü (R01-EY018417, R01-EY024519) ve Zebra balığı Araştırma Merkezi, Notre Dame Üniversitesi, Notre Dame, IN hibe ile desteklenmiştir.

Not: Zebra balığı kaldırdı ve Freimann Yaşam Bilimleri Merkezi&#39;nde Notre Dame Zebra balığı tesiste muhafaza edildi. Bu yazıda anlatılan yöntemleri Notre Dame Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği tarafından görme araştırma hayvanların kullanımı için deyimi ile uyum içindedir vardır. 1. Çözümler <ol><li> doku kültürü kaput ve herhangi bir ekipman / doku kültürü kaputu aktarılır reaktif sterilize etmek için% 70 etanol hazırlayın. </li><li> (: 500 2-fenoksietanol 1) sistem 1 L su, 2-fenoksietanol 2 mL ekleyin. </li><li> 0.1 mM NaHCO 3, pH 8.0 hazırlanır. steril doku kültürü kaputu çözüm sterilize etmek 10 ml şırınga ve bir 0.2 mikron gözenek boyutu şırınga filtresi kullanın. NOT: NaHCO 3 verimli fluorodishes bir lamel yüzeyi boyunca hücre ve doku yapıştırıcı yaymak için kullanılır (bkz) 3.2 adım. </li><li> Hazırlama 1.0 M CaCl2 ve 1.0 M MgCI2. steril doku kültürü kaputu 10 ml şırınga ve 0.2 mikron gözenek boyutu şırınga filtresi ile sterilize edin. </li><li> Hank&#39;s dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlamak için, 1 mM, her bir son konsantrasyonda fenol kırmızısı olmadan Ca2 + / Mg2 + olmaksızın 1x HBSS için MgCl2 CaCl2 steril ve steril ekleyin. Steril bir ortamda çalışın. </li><li> % 50 fenol kırmızısı olmaksızın 1x en az temel ortam (MEM),% 25 CaCl2 ve MgCl2 içeren HBSS (bölüm 1.4),% 25 at serumu (HS), 10 birim / ml penisilin ve 10 karışımı, kültür ortamı hazırlamak ug / ml streptomisin. Steril bir ortamda çalışın. NOT: bu suretle gürültü oranı sinyali etkileyen autofluoresces olarak fenol kırmızısı içeren orta kaçının. 23 </li><li> fenol kırmızısı olmadan 1x MEM içinde% 1 düşük erime noktalı agaroz 10 ml hazırlayın. agaroz / 1x MEM bir Mikrodalga fırın kullanarak eritinave. Sıvı buharlaşmaya bağlı iyonu konsantrasyonları değiştirecek tekrar tekrar ısıtma agaroz (örneğin, 10 mL) arasında küçük hacimli hazırlayın. </li><li> kültür önce, otoklav 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri sterilize edin. </li></ol> 2. Işık hasar Paradigma <ol><li> Koyu-adaptasyon <ol><li> 2 koyun - 3 Tg [GFAP: nGFP] 6&#39;da mi2004 zebrabalıkları (ya da diğer ilgi transgenik zebrafish) - 14 gün boyunca ışık yoksun bir ortama yaşı 14 ay. Daha ayrıntılı bilgi için referans 2, 6, 24, 25 bkz. </li></ol></li><li> 2800 lux 2, 6, 24, 25 ışık yayarlar iki floresan lamba arasındaki sistem suda 3 koyu adapte transgenik zebrafish - 2 içeren tankı yerleştirin. </li&gt; <li> 35 saat boyunca sabit yoğun ışığa zebrafish Açığa. 33 ° C - ışık pozlama sırasında, su sıcaklığı 31 arasında muhafaza edilmektedir emin. </li></ol> Kültür için 3. Hazırlık (Retina İzolasyon gününde) <ol><li> % 70 etanol kullanılarak, doku kültürü kaputu ve bileşenleri sterilize / doku kültürü kaputu aktarılır araçlar (örneğin, MEM ve HBSS, pipet, steril pipet uçları, vb içeren şişeler.). </li><li> fluorodishes hazırlanması <ol><li> Hücre ve doku yapıştırıcı ile her retina için Coat bir fluorodish (Malzeme Tablo). </li><li> 70 ug / ml bir son konsantrasyona kadar 0.1 mM NaHCO 3 hücre ve doku yapıştırıcı seyreltilir Her fluorodish 50 uL ekleyin ve 200 uL pipet ile fluorodish merkezi boyunca çözeltisi yayılır (yaklaşık 1-1,2 cm çapında ). </li><li> Oda sıcaklığında 3 saat - 1 kaplı fluorodishes inkübe(Alternatif olarak, 4 ° C&#39;de O / N inkübe). </li><li> çözüm çıkarın ve her yıkama için 1x MEM 500 uL ile 3x yıkayın. retina eksplantlar monte kadar kurumasını kaplanmış fluorodishes önlemek için, MEM onları korumak. </li></ol></li><li> Adım 1.6 açıklandığı gibi kültür ortamı hazırlayın. Kültür ortamı 1 haftaya kadar 4 ° C saklanabilir. </li></ol> Retina Eksplantlarından 4. İzolasyon ve Kültürleme Not: Aşağıda belirtilen protokol ağırlıklı tarif edilen ışık hasarı paradigmasının lezyonlu retinal bölgedir dorsal retina, izolasyonu içindir. Bu nedenle, hasar kaynaklı çoğalması ve interkinetic nükleer göç ilişkili olay dorsal retinada meydana gelir. Ancak, izolasyon prosedürü araştırmacı / araştırma sorusunun özel ihtiyaçlarına göre retina bölgeleri elde etmek için ayarlanabilir. <ol><li> Bir ışık hasarlı transgenik zebrafish a euthanize1&#39;de ta süresi: 500 2-fenoksietanol. </li><li> 1000 uL pipet ile bir fluorodish gelen MEM Kaldır sıvı kalıntılarının sadece ince bir film böylece. </li><li> Kuru bir kağıt havlu üzerine zebrafish aktarın Dumont forseps (forseps # 5, 45 ° açı) bir eğri çifti ile göz çıkarmak ve fluorodish aktarabilirsiniz. </li><li> Optik sinir ile gözün arka görünecek şekilde bir stereomikroskop kullanılarak, (Şekil 1D) fluorodish kapak kayma üzerine öğrenci ile göz yönlendirmek. </li><li> McPherson-Vannas bir makas ile gözün arka yakın kesim, optik sinir çıkarın. Buna ek olarak, gözün dışında astar bağ dokusu kaldırmak. </li><li> Lamina cribrosa aracılığıyla bir makas bıçağı ile piercing ve nazal ve gözün zamansal taraflarında boyunca keserek optik sap bir kesi yaparken 5. forseps bir çift ile nazal ve temporal tarafı arasındaki göz tutun (Şekil 1E bkz , parçalı line). </li><li> retina dorsal yüzü ve dorsal retina ventral ayrı doku çekmek için diğer çifti tutmak için # 5 forseps iki çift, bir kullanma. NOT: sklera yukarı bakacak iken objektif ve ganglion hücre tabakası lamel karşı karşıya böylece dorsal retina yönlendirmek için tavsiye edilir. </li><li> 5. forseps (Şekil 1 H, I) &#39;in ikinci bir çift retina bağlı lens tutarken, 5. forseps bir çift dorsal retinadan sklera çıkarın. </li><li> Merceği çıkarmak için, McPherson-Vannas makas kullanın ve retina (Şekil 1I, J) zarar vermeden merceğin arkasında kesti. Bazen, objektif adım 4.7 ayırır. Bu durumda, 5. forseps ikinci bir çift ile bir kesim kenarında retina tutarak forseps ile dikkatlice sklera çıkarın. </li><li> retina zarar vermeden lensi çıkarırken vitrözü çıkarın. kapak kayma bakan ganglion hücre tabakası ile retina düzleştirmekfluorodish (Resim 1L, M). </li><li> % 1 düşük erime noktası agaroz 10 uL ile retina Surround ve agaroz katılaşmaya edelim. </li><li> Hatta hafif bir yükseklik dokusuna derinlemesine odaklanma yeteneğini etkileyebilir sıvı agaroz retina asansör olmadığını izleyin. Kaldırma görülürse, agaroz kaldırmak için bir pipet kullanın. daha eklemek denemeden önce kalan agaroz seti olsun. </li><li> tüm fluorodish kapsayacak şekilde% 1 düşük erime noktası agaroz eklemeden önce birkaç kez adımı yineleyin 4.12. Agaroz katılaşmış sonra, 1.5 ml kültür ortamı ilave edin. </li><li> Retina izolasyon prosedürü ile, oluşan stres kurtarmak sağlamak için yaklaşık 12 saat boyunca 32 ° C&#39;de ayarlanmış bir% 5 CO2 / hava ortamında retina eksplant kültürünü koruyun. Işık ile muamele zebrabalıkları aynı sıcaklıkta retina korumak için 32 ° C sıcaklık ayarlama (adım 2.3). </li></ol> 5. multiphoton Mikroskopi (Malzeme Tabloya bakınız), 40X Apo uzun mesafe suya daldırma hedefi (1.15 NA) ile donatılmış bir multiphoton mikroskop, bir galvanometre tarayıcı ve bir için optimize edildi dört adet 35 mm Petri kapları için bir ekleme içeren çevresel odası. görüntüleri olmayan bir descanned detektörü (R-NDD) ile elde edildi. <ol><li> Görüntüleme önce, bir% 5 CO 2 / hava atmosferi elde etmek için çevresel odasını dengelenmesi. Boş Petri kapları odasına gaz sızıntısını önlemek için tutucu takılı olduğundan emin olun. </li><li> mikroskopi sistemi açın. </li><li> Çevre odası dengelenmiş sonra, 40X Apo uzun mesafe suya daldırma hedefi (NA 1.15) üzerine kırılma endeksi sıvı ekleyin. Not: suya benzer optik özelliklere sahip kırılma endeksi sıvı uzun süreli görüntüleme sırasında suyun buharlaşmasını önlemek için kullanılır. </li><li> Yeri gribiodasına retina eksplant ile orodishes. aydınlık ışığını kullanarak, ışık yoluna örnek konumlandırmak ve odak düzlemi içine dorsal retinanın midregion getirmek. </li><li> GFAP odaklanmak GFP epifluorescent ışığı kullanın: nGFP Müller glia çekirdekleri (Şekil 2A, C) pozitif. NOT: nGFP pozitif çekirdekler ya da loş floresan olacaktır: eksplantlar düz veya agaroz eksplant altında biriken monte değilseniz, bu GFAP üzerine odaklanmak zor olacaktır. <ol><li> Aynı retina eksplant içinde farklı bir bölgeye hareket odaklama sorunu aşmak olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde farklı bir retina eksplant taşıyın. </li></ol></li><li> görüntü elde etme yazılımı olarak, &#39;A1 Milletvekili GUI&#39;, &#39;TiPad&#39;, &#39;A1 Kompakt GUI&#39; ve &#39;ND edinme&#39; pencereleri açın. multiphoton görüntüleme için, &#39;IR NDD&#39; seçeneği &#39;A1 Kompakt GUI&#39; seçilen olduğundan emin olun. </li><li> &#39;Batan içindegın &#39;alanına, 1. dikroik ayna IR-DM seçin ve GFP floresan elde etmek 525/50 bant geçiren filtre seçin. </li><li> &#39;A1MP GUI&#39; etiketli bir pencerede IR lazer açın. Lazer hazır olmak için bir kaç dakika sürer. GFP floresan heyecanlandırmak ve &#39;A1 Milletvekili GUI&#39; penceresinde &#39;Otomatik hizalama&#39; butonuna tıklayarak lazer hizalama için 910 nm dalga boyu ayarlayın. </li><li> Oda ve ekipmanları ışıkları photomultiplier tüpünün aşırı pozlamayı önlemek için &#39;A1 Milletvekili GUI&#39; deklanşör açmadan önce kapalı veya örtülü olduğundan emin olun. gürültü seviyelerini azaltmak için, karanlık bir ortamda mikroskop ev. </li><li> ikisinin bir zoom ve 4.8 us / piksel piksel konut anda 300 x 300 piksel, görüş alanı görüntülerini elde edin. Kabaca &#39;A1MP GUI&#39; ve &#39;A1 Kompakt GUI&#39; penceresindeki kazanç &#39;satın alan&#39; değiştirerek lazer gücünü kurdu. </li><li> z-yığını ayarlama <ol><li> ND edinme &#39;penceresinde&#39; içinde Z&#39;-altpencere &#39;z-yığınının üst odak düzlemini ayarlamak için ganglion hücre tabakası odaklanın. Bazı GFAP: nGFP pozitif hücreler tipik olarak retina (Şekil 2A, D) taban sınırı belirlemeye yardımcı olur ganglion hücre tabakası, yer almaktadır. </li><li> Onl düzeyi ile odak düzlemi hareket ettirin (Şekil 2A, B), loş etiketli GFAP varlığı ile karakterize edilir: INL (Şekil 2A, C) muadilleriyle yuvarlak ve genişlemiş göreli nGFP pozitif hücreler . </li><li> z-yığının altında bu uçağı ayarlayın. Tüm onl (Şekil 2A, B) yansıması olacaktır emin olun. </li><li> Görüntüleme döneminde yeniden ayarlama gerektiren odak düzlemi vardiya, yaşıyor yaparken &#39;ev&#39; pozisyon olarak atamak için &#39;z&#39; altpencere orta konumda çift tıklayın. değişiklik &#39;simetrik mod tanımlanan&#39;ve &#39;göreli&#39; tıklayın. </li><li> 1 mikron 0.7 arasında z-adım boyutunu ayarlamak. </li></ol></li><li> Z-yoğunluk düzeltmesi: <ol><li> nedeniyle ışık saçılması piksel yoğunluğu kaybını telafi etmek için z-yoğunluk düzeltmeleri yaparken dokusunun derin katmanlarında görüntüleme. </li><li> düzeltme kurmak için, &#39;z-yoğunluk düzeltme&#39; penceresini açın. &#39;Z-yığın aralığı&#39;, &#39;ND Kimden&#39; seçin ayarlamak için. </li><li> ve kazanç (A1 Kompakt GUI ( &#39;A1MP GUI&#39; in &#39;edinim alan&#39;) lazer yoğunluğu (bu durumda, ganglion hücre tabakası karşılık gelir) &#39;z-yoğunluk düzeltme&#39; penceresinde alt odak düzlemi üzerine tıklayın ve set ). </li><li> sonradan seçilen odak düzlemi için &#39;z-yoğunluk düzeltme&#39; penceresinde &#39;cihaz ayarları&#39; başlığı altında gösterilen ayarları onaylamak için &#39;z-yoğunluk düzeltme&#39; penceresinde &#39;z-değerleri&#39; yanındaki oku tıklayın. </li><li> Orta a için işlemi tekrarlayınlazer gücü ve kazancı artan nd üst düzlemler. Gerekirse ek odak düzlemi eklenebilir. 4 - Şekil 2 deneyler için özel lazer ve kazanç ayarları için Tablo 1&#39;e bakınız. </li><li> &#39;A1 Milletvekili GUI&#39; penceresindeki &#39;satın alan&#39; olarak ayarlayın. 15 daha büyük bir kazanç alanı ve photobleaching atlatmak için görüntüleme başında bir kazanç daha yüksek 126 seçmekten kaçınmak ve gürültü seviyeleri arttı. NOT: lazerler ve photomultiplier tüpleri photobleaching kaçınarak kurmak mikroskop için en uygun görüntüleme koşulları elde etmek mikroskopi sistemleri, deney lazer ve kazanç ayarları arasında farklılık gösterdiğinden. </li><li> &#39;Z-yoğunluk düzeltme&#39; penceresinde &#39;nispi yoğunluk düzeltme&#39; seçin. </li></ol></li><li> &#39;ND edinme&#39; penceresinde &#39;timeseries&#39; altpencere içinde, 8 saat süre ile &#39;hayır gecikme&#39; için aralığını ayarlayın. Ardından, t &#39;Run z-düzeltme&#39; tıklayın emin olun&#39;ND edinme&#39; penceresi düğmesini o z yığın &#39;alt pencere 3-D timeseries elde etmek. </li><li> görüntü alımı süresince 29 ° C - 27 arasındaki bir sıcaklıkta retina eksplantlar koruyun. </li><li> görüntü elde etme dönemi boyunca, gerekirse, post-görüntüleme analizi için görüntü kalitesini korumak için güç seviyesini ve kazanç yeniden ayarlayın. 5.11.4 - ayarlamaları için adımları 5.11.2 gerçekleştirin. </li><li> odak düzlemi kayarsa, duraklatmak veya akışını durdurur ve yeniden adımı 5.11 gerçekleştirin. NOT: &#39;göreli z-düzeltme&#39; adım 5.12.7 seçildi ve adım 5.11.4 gerçekleştirildi Eğer geniş photobleaching oluştu sürece, güç ve kazanç düzeylerini yeniden ayarlamak için gerekli olmamalıdır. </li></ol> Hız 6. Analizi <ol><li> görüntüde &#39;faiz bölgeyi&#39; ayarı, zaman ayıklayın. &#39;Zaman ölçümü&#39; aracını kullanın ve bir elektronik tabloya zaman değerleri ihracat. </li><li> DI içeren bir bölgeyi kırpmaviding GFAP: nGFP pozitif çekirdeği. </li><li> o sonradan bölme çekirdeği bazal INL ile ilgili olarak göç mesafeleri ölçmek için bir referans noktası ayarlamak için İNM uğramayan en az bir çekirdeğin içerecek şekilde kırpılmış bölgenizi seçin. Not: Bazal INL kalan bir çekirdek seçmek için, bu timeseries bir 3-D yeniden hazırlanması için yardımcı olur. </li><li> Bir GFAP Alternatif olarak,: nGFP pozitif hücre elde etme süresi boyunca ONL gözlenir, bir referans noktası belirlemek için, bazal INL için onl çekirdekten yayılan sabit uzunluktaki dikey bir çizgi kullanın. </li><li> &#39;Gösteri dilimleri görünümü&#39; fonksiyonunu kullanarak, dik projeksiyonlar oluşturabilir. Daha sonra, &#39;maksimum intensite projeksiyonu&#39; ile &#39;dilim&#39; dan modunu değiştirmek. </li><li> dik maksimum projeksiyon &#39;xy&#39; görünümü kapatın. göç / bölme çekirdeği, en iyi görünür hangi yönüne bağlı olarakLSO &#39;xz&#39;- ya da&#39; yz&#39;-görünüm ya da kapatın. </li><li> farenin sağ tuşu ile kalan resmin üzerine tıklayın ve bu görünümden yeni belge oluşturma &#39;fonksiyonu&#39; xz &#39;veya&#39; ile yz&#39; görüntü serisi &#39;ayıklayın. Gerekirse, görüntüyü döndürmek. </li><li> &#39;Manuel ölçüm&#39; fonksiyonunu kullanarak, bazal INL kalır ve İNM uğramayan çekirdeğin alt düzeyde görüntü boyunca yatay bir çizgi çizin (= referans noktası Şekil 4A - E, kırmızı yatay çizgi). </li><li> Referans çizgisi ve analiz yazılımı &#39;hat ölçümü&#39; aracını (- E Şekil 4A) kullanarak timeseries için göç çekirdeğin bazal noktası arasındaki mesafeyi ölçün. </li><li> nükleer zarf ayırır kez tüm hücreye GFP difüzyon aşağıdaki tanımlanabilir ise, soma bazal konumunu ölçmek. </li><li> Bir tablo yazılımı kullanarak, mesafeyi bir nu arsaçekirdeğinde (Şekil 4F) geçen zamana karşı göç. <ol><li> Oluşur (v), grafik mesafeler nükleer zarf arıza öncesi dönem için gitti apikal göç hızı (Şekil 4G) belirlemek. </li><li> grafik içinde veri serisini seçin, fare sağ tıklayın ve ilgili fonksiyon &#39;y = mx + c&#39; dahil bir lineer regresyon eğrisini yerleştirin. Işlevinde eğimi &#39;m&#39; hızı temsil v (Şekil 4G). </li><li> Tekrarlayın bazal göç hızı, v b (Şekil 4H) belirlemek için hızlı bazal göç birinci faz için 6.11.1 ve 6.11.2 adımları. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Fausett, B. V., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+alpha1+tubulin-expressing+Muller+glia+in+regeneration+of+the+injured+zebrafish+retina.">A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina.</a> J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).</li><li>Kassen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish.">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-stage+neuronal+progenitors+in+the+retina+are+radial+Muller+glia+that+function+as+retinal+stem+cells.">Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells.</a> J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).</li><li>Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+is+produced+by+dying+retinal+neurons+and+is+required+for+Muller+glia+proliferation+during+zebrafish+retinal+regeneration.">Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration.</a> J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).</li><li>Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-Cytoskeleton-+and+Rock-Mediated+INM+Are+Required+for+Photoreceptor+Regeneration+in+the+Adult+Zebrafish+Retina.">Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina.</a> J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).</li><li>Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-renewing+division+of+zebrafish+Muller+glial+cells+generates+neuronal+progenitors+that+require+N-cadherin+to+regenerate+retinal+neurons.">A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons.</a> Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).</li><li>Sauer, M. E., Walker, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioautographic+study+of+interkinetic+nuclear+migration+in+the+neural+tube.">Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube.</a> Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).</li><li>Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+modulate+interkinetic+nuclear+movement+in+retinal+progenitor+cells.">Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells.</a> J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).</li><li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis.">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).</li><li>Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neurogenesis+by+interkinetic+nuclear+migration+through+an+apical-basal+notch+gradient.">Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient.</a> Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).</li><li>Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+is+the+main+driver+of+interkinetic+nuclear+migration+in+the+retina.">Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina.</a> Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).</li><li>Becker, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+of+chick+retinal+development+in+relation+to+gap+junctional+communication.">Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication.</a> J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).</li><li>Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+maintains+the+quiescent+progenitor+cell+state+of+postnatal+retinal+Muller+glia.">SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia.</a> Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).</li><li>Nickerson, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+and+analysis+of+postnatal+mouse+retinal+development.">Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development.</a> BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).</li><li>Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+photoreceptor+types+in+zebrafish+are+generated+by+symmetric+terminal+divisions+of+dedicated+precursors.">Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+adult+rat+retinal+explant+model+for+screening+of+potential+retinal+ganglion+cell+neuroprotective+therapies.">Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).</li><li>Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+retinal+whole+mounts.">In vitro imaging of retinal whole mounts.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li><li>Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Retinal+Ganglion+Cell+Dendritic+Field+Degeneration+Imaged+in+Organotypic+Retinal+Explant+Culture.">Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).</li><li>Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blue+light+on+photoreceptors+in+a+live+retinal+explant+system.">Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system.</a> Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).</li><li>Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+processes+by+long-term+live+imaging--historic+problems+and+current+solutions.">Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions.</a> J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).</li><li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish.">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).</li><li>Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repressing+notch+signaling+and+expressing+TNFalpha+are+sufficient+to+mimic+retinal+regeneration+by+inducing+Muller+glial+proliferation+to+generate+committed+progenitor+cells.">Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells.</a> J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).</li><li>Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3+defines+three+populations+of+Muller+glia+and+is+required+for+initiating+maximal+muller+glia+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+retina.">Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina.</a> J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).</li><li>Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Muller+glial+dependent+neuronal+regeneration+in+the+damaged+adult+zebrafish+retina.">Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).</li><li>Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+IL-6+family+cytokines+synergize+to+stimulate+Muller+glia+reprogramming+and+retina+regeneration.">Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration.</a> Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).</li><li>Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+is+necessary+and+sufficient+for+Muller+glia+dedifferentiation+and+retina+regeneration.">HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration.</a> Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).</li><li>Lenkowski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+regeneration+in+adult+zebrafish+requires+regulation+of+TGFbeta+signaling.">Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling.</a> Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).</li><li>Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+position+and+morphology+of+committed+precursor+cells+in+the+zebrafish+retina+adapt+to+architectural+changes+upon+tissue+maturation.">Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation.</a> Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).</li><li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitor+of+phagocytosis,+O-phospho-L-serine,+suppresses+Muller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina.">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).</li><li>Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+dynamic+imaging+of+retinal+microglia+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+living+photoreceptors+contributes+to+inherited+retinal+degeneration.">Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration.</a> EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).</li><li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo.">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li><li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord.">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Hasarlı yetişkin Zebra balığı retinanın ağırlıklı kullanılan immünositokimyasal yöntemler 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30 yenilenmesini düzenleyen mekanizmaları araştıran çalışmalar. kültür retina eksplantlar koşulları oluşturulması ve bu tür INM olarak fenomenler, canl...

Insanlarda farklı olarak, zebra balığı (Danio rerio) sergiler retina nöronlarının, 1, 2, 3, 4, hücre ölümü üzerine sağlam bir rejenerasyon yanıt. Tümör nekroz faktörü α, retina nöronlarının ölen salınan bir sinyal molekülü nöronal hücre ayırma yöntemi önce çoğalmaya devam nöronal progenitör hücreler 5 çoğalır ve üretilmesi için taban iç nükleer tabaka retinanın (INL) ikamet Müller glia indüklemektedir 2 ölen türleri, 3, 4. Yenilenmesi tepkisinin çoğalma fazı sırasında, Müller glia çekirdekleri ve elde edilen nöronal progenitör hücreler, hücre siklüsü (Interkinetic Nükleer Göç, INM) 6 aşamasında tekrar eden göç desen geçmesi </sup<html> &gt; 7. bazal INL konumlandırılmış Çekirdekler çıkan çekirdekleri INL için dorsalde dönmeden önce onlar bölmek Dış Nükleer Layer (onl) göç önce DNA çoğaltırlar. Canlı hücre görüntüleme teknikleri, daha sonra Sauer 8, 9, 10, 11, 12 ile bir yorum teyit Bu süreç ilk olarak, histolojik yöntemlerle nöroepitelyal gelişimi sırasında açıklanmıştır. Hem histokimyasal ve canlı hücre görüntüleme yaklaşımları İNM ve retina 9, 11, 12, 13 olmak üzere neuroepithelia gelişmekte işlevini altında yatan mekanizmaları belirlemek için kullanılmıştır. Ancak, retina yenileyici yetişkin İNM yöneten mekanizmalar çok ayrıntılı olarak araştırılmamıştırxref &quot;&gt; 6, 7. Canlı hücre görüntüleme yetişkin yenileyici retina İNM kontrol sinyal yollarının bilgimizi ilerletmek için paha biçilmez bir yaklaşım olacaktır. Yakın zamana kadar, retina INM canlı hücre görüntüleme canlı zebra balığı embriyolar ya ya da piliç embriyonik veya postnatal fare retinal eksplantlar 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16 ile sınırlı kalmıştır. Fare, sıçan ve zebrabalıkları içeren türlerin çeşitli yetişkin hayvanların retina eksplantlar, farklı hücre biyolojik yaklaşımlar 17, 18, 19, 20 için kullanılmış olmakla birlikte, canlı hücre görüntüleme deneyleri retina eksplantlar ha kullanılarakziyaretinde sürelerde bilgilendirmek kısıtlandı ve birkaç saat 21, 22 üzerinde sürekli olarak gerçekleştirilir edilmemiştir. Burada, çoklu foton mikroskopi 6 kullanarak canlı hücre görüntüleme deneyleri izleme İNM gerçekleştirmek için kültür ışık hasarlı yetişkin zebrabalıkları retina için ayrıntılı bir protokol açıklar. INM dinamikleri olarak, örneğin, hızlar oldukça potansiyel immünsitokimya kullanılarak tespit olmaz mitoz konumu, daha etkilenebilir, INM kontrol mekanizmaları araştırılırken Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları immünohistokimyasal yöntemlere göre avantajlıdır. Gelecekte, bu yöntem aynı zamanda bir potansiyele sahip gibi Müller glia ya da mikroglia davranışları ile fotoreseptör ölme fagositoz gibi retinal rejenerasyon sırasında diğer dinamik süreçleri incelemek için modifiye edilmesi.

<table><tbody><tr><td>Dumont forceps #5</td><td>World precision instruments</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>Dumont forceps #5, 45&amp;deg; angle</td><td>World precision instruments</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas scissors</td><td>World precision instruments</td><td>501233</td><td></td></tr><tr><td>Fluordishes</td><td>World precision instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>SMZ-1B</td><td>similar type of dissection stereomicroscope will work</td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet class type A2</td><td>Labconco</td><td></td><td>equivalent type will work</td></tr><tr><td>tissue culture incubator</td><td>Thermoscientific</td><td>HEPA-class 100</td><td>equivalent type will work</td></tr><tr><td>Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO</td><td>Bulbtronics</td><td>31850</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m pore-size Acrodisc syringe filter</td><td>VWR</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-lok syringe</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>60 mL Luer-lok syringe</td><td>VWR</td><td>BD309653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>FischerScientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ThermoScientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>EMD Millipore</td><td>5980</td><td></td></tr><tr><td>HBSS w/o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, w/o phenol red, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM w/o phenol red, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>5100-038</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum, heat-inactivated</td><td>ThermoScientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>VWR</td><td>16777-164</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure low melting point agarose</td><td>ThermoScientific</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>ethanol, absolute</td><td>ThermoScientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>2-phenoxyethanol</td><td>Sigma</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>refractive index liquid&amp;nbsp;</td><td>Cargille Lab</td><td>1803Y</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser</td><td>Nikon</td><td></td><td>equivalent system will work</td></tr><tr><td>40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes</td><td>Okolab</td><td></td><td>equivalent system will work</td></tr><tr><td>NIS analysis software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

culture of adult transgenic zebrafish retinal explants for live-cell imaging by multiphoton microscopy

Bir endojen rejenerasyon programı nöronal hasar ve ölümünden sonra (Danio rerio) retina yetişkin zebrafish Müller glia tarafından başlatılır. Müller glia hücre döngüsünü tekrar girin ve hücre bölünmeleri daha sonraki mermi geçmesi ve kayıp nöronal hücre tiplerine ayırt nöronal progenitör hücreler üretmek. Hem Müller glia ve nöronal progenitör hücre çekirdekleri kendi DNA&#39;sını çoğaltmak ve Interkinetic olarak tanımlanan bir süreç içinde retinanın, yani sırasıyla, bazal İç Nükleer Katmanı (INL) ve (onl) Dış Nükleer Katman arasında göç ayrı yerlerde mitoz geçiren nükleer Göç (INM). INM ağırlıklı gelişmekte olan retinada incelenmiştir. detaylı Zebra balığı retina rejenere erişkin INM dinamiklerini incelemek için, floresan etiketli Müller glia / nöronal progenitör hücrelerin canlı hücre görüntüleme gereklidir. Burada, biz izole etmek için koşullar ve kültür dorsal retina sağlamakTg dan [GFAP: nGFP] 35 saat süreyle sürekli yoğun ışığa maruz bırakıldı mi2004 zebra balığı. Biz de bu retina kültürleri sürekli olarak GFAP göç davranışlarını izlemek için multiphoton mikroskopi kullanılarak en fazla 8 saat retina eksplant kalınlığı boyunca z-yığın görüntüleri elde, canlı hücre görüntüleme deneyleri gerçekleştirmek için geçerli olduğunu göstermektedir: nGFP pozitif hücreler . Ayrıca, apikal ve bazal INM hızını belirlemek için post-görüntüleme analizi gerçekleştirmek ayrıntıları açıklar. Özetlemek gerekirse, biz nöronal rejenerasyon bir yetişkin modelinde INM dinamiklerini incelemek için koşulları oluşturmuştur. Bu, bu çok önemli hücresel sürecin anlayışımızı ilerletmek ve bize INM kontrol mekanizmaları belirlemek için izin verecektir.

Şekil 1 &#39;de şematik olarak tarif edilen prosedüre göre retina izolasyonu hafif zarar görmüş yetişkin Tg&#39;sinden yassılaştırılmış dorsal retinanın kültürlenmesini sağlar [GFAP: nGFP]% 5 CO en az 24 saatlik bir süre boyunca mi2004 zebra balığı 2 / hava ortamı. Bu düz monte retina eksplantlar derin doku seviyelerinde görüntü odak düzlemleri için kullanılabilir. Bir örnek olarak Müller gl...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy at JoVE.com

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

culture-adult-transgenic-zebrafish-retinal-explants-for-live-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K Görüntüleme.  University of Notre Dame.  Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar. 

Video: Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Gelişim Biyolojisi

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Biyoloji

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding diseases, and future therapies hinge on fundamental understandings about how different retinal cells function normally. Gaining such information with biochemical methods has proven difficult because contributions of particular cell types are diminished in the retinal cell milieu. Live retinal imaging can provide a view of numerous biological processes on a subcellular level, thanks to a growing number of genetically encoded fluorescent biosensors. However, this technique has thus far been limited to tadpoles and zebrafish larvae, the outermost retinal layers of isolated retinas, or lower resolution imaging of retinas in live animals. Here we present a method for generating live ex vivo retinal slices from adult zebrafish for live imaging via confocal microscopy. This preparation yields transverse slices with all retinal layers and most cell types visible for performing confocal imaging experiments using perfusion. Transgenic zebrafish expressing fluorescent proteins or biosensors in specific retinal cell types or organelles are used to extract single-cell information from an intact retina. Additionally, retinal slices can be loaded with fluorescent indicator dyes, adding to the method&#39;s versatility. This protocol was developed for imaging Ca2+ within zebrafish cone photoreceptors, but with proper markers it could be adapted to measure Ca2+ or metabolites in M&#252;ller cells, bipolar and horizontal cells, microglia, amacrine cells, or retinal ganglion cells. The retinal pigment epithelium is removed from slices so this method is not suitable for studying that cell type. With practice, it is possible to generate serial slices from one animal for multiple experiments. This adaptable technique provides a powerful tool for answering many questions about retinal cell biology, Ca2+, and energy homeostasis.

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Imaging retinal tissue can provide single-cell information that cannot be gathered from traditional biochemical methods. This protocol describes preparation of retinal slices from zebrafish for confocal imaging. Fluorescent genetically encoded sensors or indicator dyes allow visualization of numerous biological processes in distinct retinal cell types.

Ex Vivo deneyler görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden hazırlanması taze retina dilimleri

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Nörobilim

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

Nöronal Gelişim Sırasında ROS Canlı Hücre Görüntüleme

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...