Name: culture of adult transgenic zebrafish retinal explants for live-cell imaging by multiphoton microscopy
Uploaded: 2017-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy at JoVE.com

우리는 윌리엄 아처와 노트르담 통합 이미징 시설에서 제공하는 지원을 주셔서 감사합니다. 특별 감사는 지속적인 도움과 자신의 관심과 제브라 피쉬의 축산에 대한 Freimann 생명 과학 기술자로 보내집니다. 본 연구는 DRH에 NIH 국립 안과 연구소 (R01-EY018417, R01-EY024519)과 Zebrafish의 연구 센터, 노트르담 대학교, 노트르담, IN에서 보조금에 의해 지원되었다.

참고 : 제브라 피쉬가 발생하고 Freimann 생명 과학 센터의 노트르담 Zebrafish의 시설에서 유지 하였다. 이 논문에 기술 된 방법은 노트르담 동물 관리 및 사용위원회의 대학 승인 및 비전 및 안과 연구 협회에 의해 비전 연구에 동물의 사용을 위해 문을 준수하고 있습니다. 1. 솔루션 <ol><li> 조직 문화 후드 및 장비 / 조직 문화 후드로 전송되는 시약을 소독하기 위해 70 % 에탄올을 준비합니다. </li><li> (500 2- 페녹시 에탄올 1) 시스템의 물 1 L에 2- 페녹시 에탄올 2 mL를 넣고. </li><li> 0.1 밀리미터의 NaHCO3, pH가 8.0을 준비합니다. 멸균 조직 문화 후드에서 솔루션을 소독하기 위해 10 ML의 주사기와 0.2 μm의 기공 크기의 주사기 필터를 사용합니다. 참고 : NaHCO3을 효율적으로 fluorodishes의 커버 슬립 표면을 가로 질러 세포와 조직 접착제를 확산시키는 데 사용된다 () 3.2 단계. </li><li> 준비 1.0 M CaCl2를 1.0 M의 MgCl 2. 멸균 조직 배양 후드에서 10 ㎖ 시린지 및 0.2 ㎛의 세공 크기의 주사기 필터로 멸균. </li><li> Hank&#39;s 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 준비하려면, 1 mM의 각각의 최종 농도에서 페놀 레드없이 칼슘 / 마그네슘 2+없이 1 배 HBSS에의 MgCl 2 CaCl2를 살균 및 멸균을 추가합니다. 무균 환경에서 작업 할 수 있습니다. </li><li> 50 % 페놀 레드없이 1 배 최소 필수 중간 (MEM), 25 % 염화칼슘 2의 MgCl 2를 포함하는 HBSS는 (섹션 1.4 참조), 25 % 말 혈청 (HS), 10 단위 / mL의 페니실린, 10를 혼합 배지를 준비하려면 μg의 / ML의 스트렙토 마이신. 무균 환경에서 작업 할 수 있습니다. 참고 :함으로써 노이즈 비율로 신호에 영향을 미치는, autofluoresces으로 페놀 레드를 포함하는 매체를 피하십시오. (23) </li><li> 페놀 레드없이 1 배 MEM 1 % 저 융점 아가로 오스의 10 ㎖를 준비합니다. 아가로 오스 / 1 배 MEM은 전자 레인지,를 사용하여 용융AVE. 유체의 증발에 의한 이온 농도를 변경됩니다 반복 재가열로 아가로 오스 (예를 들어, 10 ㎖)의 작은 볼륨을 준비합니다. </li><li> 배양에 앞서, 오토 클레이브를 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브 살균. </li></ol> 2. 라이트 피해 패러다임 <ol><li> 어두운 적응 <ol><li> 이 장소 - 3의 Tg [GFAP를 : nGFP] 6에서 mi2004의 제브라 피쉬 (또는 관심의 다른 형질 전환 제브라 피쉬) - 14 일에 대한 빛의없는 환경으로 시대의 14개월. 더욱 상세 내용은 참고 2, 6, 24, 25을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 2,800 룩스 2, 6, 24, 25의 광을 방출이 형광 램프 사이의 시스템 물에 3 어두운 적응 형질 전환 제브라 피쉬 - 2를 포함하는 탱크를 배치합니다. </l난&gt; <li> 35 시간 동안 일정한 강렬한 빛에 제브라 피쉬를 노출. 33 °의 C - 광 노광시, 수온 (31) 사이에 유지되는 것을 보장. </li></ol> 배양 3. 준비 (망막 분리의 날) <ol><li> 70 % 에탄올을 사용하여, 조직 배양 후드 성분 살균 / 조직 배양 후드로 옮기고되는 도구 (예를 들어, MEM 및 HBSS, 피펫, 멸균 피펫 팁 등을 포함하는 플라스.). </li><li> fluorodishes의 준비 <ol><li> 세포 및 조직 접착제와 각각의 망막을위한 코트 하나 fluorodish는 (재료의 표 참조). </li><li> 70 μg / ML의 최종 농도 0.1 mM의 NaHCO3을의 세포 및 조직 접착제를 희석 각 fluorodish 50 μL를 추가하고, 200 μL 피펫 팁으로 fluorodish의 중심을 가로 질러 용액을 확산 (약 1-1.2 cm 직경 ). </li><li> RT에서 3 시간 - 1 코팅 fluorodishes을 품어(또는, 4 ° C에서 O / N을 품어). </li><li> 솔루션을 제거하고 각 세척을위한 1 배 MEM 500 μL와 배를 씻어. 망막 외식가 장착 될 때까지 건조에서 코팅 fluorodishes을 방지하기 위해, MEM에서 그들을 유지합니다. </li></ol></li><li> 단계 1.6에 설명 된대로 배지를 준비합니다. 배양액을 1 주일까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 망막의 Explants 4. 분리 및 배양 참고 : 아래에 설명 된 프로토콜은 주로 설명 광 손상 패러다임에 의해 병변 된 망막 영역이다 지느러미 망막의 분리입니다. 따라서, 손상에 의한 증식과 interkinetic 핵 마이그레이션 관련 이벤트는 지느러미 망막에 발생합니다. 그러나 상기 분리 방법은 연구 / 조사 질문의 특정 요구 사항에 따른 망막 영역을 생성하도록 조정될 수있다. <ol><li> 하나의 광 손상 형질 전환 제브라 피쉬 a를 안락사1 타 시간 : 500 2- 페녹시 에탄올. </li><li> 1,000 μL 피펫으로 한 fluorodish에서 MEM을 제거 유체 유적의 박막 있도록. </li><li> 마른 종이 타월에 제브라 피쉬 이동 뒤몽 포셉 (핀셋 # 5, 45 ° 각도)의 곡선 쌍의 눈을 제거하고 fluorodish에 그것을 전송할 수 있습니다. </li><li> 시신경과 눈 뒤쪽 표시되도록 입체 현미경을 사용하여, (도 1D)에 fluorodish의 커버 슬립 상에 동공과 눈의 방향. </li><li> 맥퍼슨 - Vannas 가위 한 쌍의 눈 뒤쪽에 가까운 절단, 시신경을 제거합니다. 또한, 안구의 외측에 감 결합 조직을 제거한다. </li><li> 사상 판을 통해 하나의 가위 블레이드 피어싱과 코와 눈의 시간적 양쪽을 따라 절단하여 광학 줄기에서 절개를하는 동안 # 5 포셉 한 쌍의 비강 및 시간 측면 사이의 눈을 잡고 (그림 1E 참조 , 분할 리네브라스카). </li><li> 망막의 등 쪽과, 지느러미 망막에서 복부를 별도의 조직을 당겨 다른 쌍을 유지 # 5 포셉 두 쌍을 사용. 참고 : 공막이 위를 향하면서 렌즈와 신경절 세포 층이 coverslip에 직면 있도록 지느러미 망막의 방향을하는 것이 좋습니다. </li><li> # 5 포셉 (그림 1H, I)의 두 번째 쌍의 망막에 연결되어있는 렌즈를 누른 상태에서, # 5 포셉 한 쌍의 지느러미 망막에서 공막을 제거합니다. </li><li> 렌즈를 제거하려면, 맥퍼슨 - Vannas 가위를 사용하여 망막 (그림 1I, J)을 손상시키지 않고 렌즈 뒤에 잘라. 경우에 따라 렌즈는 단계 4.7에서 분리합니다. 이 경우, # 5 포셉의 두 번째 쌍의 절단 가장자리에있는 망막을 잡고 집게로 조심스럽게 공막를 제거합니다. </li><li> 망막에 손상을주지 않고 렌즈를 제거하는 동안 유리체를 제거합니다. 커버 슬립 대향 신경절 세포 층 망막 평평fluorodish의 (그림 1L, M). </li><li> 1 % 저 융점 아가로 오스 10 μL와 망막 둘러싸고 아가로 오스가 고형화하자. </li><li> 심지어 약간의 상승이 조직에 깊이 집중하는 능력에 영향을 미칠 수있는 액체 아가로 오스가 망막을 들어 올리지 않는 것을보십시오. 리프팅이 관찰되는 경우, 아가로 오스를 제거하는 피펫을 사용합니다. 더 추가하기 전에 잔류 아가로 오스 세트를 보자. </li><li> 전체 fluorodish을 충당하기 위해 1 % 저 융점 아가로 오스를 추가하기 전에 여러 번 단계를 반복 4.12. 아가로 오스가 확정되면, 1.5 mL의 배지를 추가합니다. </li><li> 망막 분리 조작에 의해 발생하는 응력을 회복 할 수 있도록 약 12 시간 동안 32 ° C로 설정 5 % CO 2 / 공기 환경에서 망막 이식편 배양을 유지한다. 빛 처리 제브라 같은 온도에서 망막을 유지하도록 32 ° C의 온도를 설정한다 (단계 2.3 참조). </li></ol> 5. 다중 광자 현미경 (재료의 표 참조)하는 40X 아포 장거리 침수 목표 (1.15 NA)가 장착 된 광자 현미경, 검류계 스캐너와에 최적화 된 네 35mm 배양 접시에 대한 삽입을 포함 환경 챔버. 이미지는 비 descanned 검출기 (R-NDD)을 획득 하였다. <ol><li> 촬상에 앞서, 5 % CO 2 / 공기 분위기를 달성하는 환경 챔버를 평형. 빈 배양 접시가 방으로 가스의 누출을 방지하기 위해 홀더에 삽입되어 있는지 확인합니다. </li><li> 현미경 시스템을 켭니다. </li><li> 환경 챔버가 평형되면, 40X 아포 장거리 침수 목적 (NA 1.15)에 굴절률 액체를 추가 할 수 있습니다. 주 : 물과 유사한 광학 특성을 갖는 굴절률 액체 장기 촬상 중에 물의 증발을 방지하기 위해 사용된다. </li><li> 장소 독감챔버에 망막 외식과 orodishes. 브라이트 라이트를 사용하여 빛의 경로로 시료를 놓고 초점면에 지느러미 망막의 midregion을 가지고. </li><li> GFAP에 초점을 GFP의 epifluorescent 빛을 사용 nGFP는 뮐러 아교 세포의 핵 (그림 2A, C)를 양성. 참고 : nGFP 양성 핵하거나 희미 형광됩니다 외식 평면 또는 아가로 오스 이식편에서 축적 장착하지 않는 경우가 GFAP에 집중하기 어려울 것이다. <ol><li> 같은 망막 이식편 내에서 다른 지역으로 이동하는 초점 문제를 극복 여부를 확인합니다. 그렇지 않으면 다른 망막 이식편로 이동합니다. </li></ol></li><li> 이미지 수집 소프트웨어에서 &#39;A1 MP GUI&#39;는 &#39;TiPad&#39;에서 &#39;A1 컴팩트 GUI&#39;와 &#39;ND 취득&#39;창을 엽니 다. 광자 이미징의 경우, &#39;IR NDD&#39;옵션이 &#39;A1 컴팩트 GUI&#39;에서 선택되어 있는지 확인합니다. </li><li> &#39;settin에서g &#39;필드는, 1 차 다이크로 익 미러 IR-DM을 선택하고 GFP의 형광을 취득 50분의 525 대역 통과 필터를 선택합니다. </li><li> &#39;A1MP GUI&#39;라고 표시된 창에서 IR 레이저에 전환합니다. 레이저가 준비하는 것은 몇 분 정도 소요됩니다. GFP의 형광을 자극하고 &#39;A1 MP GUI&#39;창에서 &#39;자동 정렬&#39;버튼을 클릭하여 레이저를 정렬 910 nm의 파장을 설정합니다. </li><li> 객실 및 장비 등은 광전자 증 배관의 과다 노출을 방지하기 위해 &#39;A1 MP GUI&#39;에 셔터를 열기 전에 꺼 또는 포함되어 있는지 확인합니다. 소음을 줄이기 위해, 어두운 환경에서 현미경 집. </li><li> 두개의 줌, 4.8 μS / 화소의 화소 보압 시간 300 X 300 픽셀의 시야의 이미지를 획득. 대략 &#39;A1MP GUI&#39;와 &#39;A1 컴팩트 GUI&#39;창에서 이득에서 &#39;수집 영역&#39;을 변경하여 레이저 출력을 설정합니다. </li><li> 는 z 스택 설정 <ol><li> ND 획득 &#39;창&#39;을 내 Z &#39;서브 윈도우&#39;는의 Z - 스택의 상단에 초점면을 설정 신경절 세포 층에 초점을 맞 춥니 다. 일부 GFAP : nGFP 양성 세포는 일반적으로 망막 (도 2A, D)의 기부 제한을 식별하는 데 도움 신경절 세포 층에 위치한다. </li><li> ONL의 수준을 통해 초점면을 이동 (그림 2A, B), 희미하게 표시 GFAP의 존재에 의해 특징되는 다음 INL (그림 2A, C)에서의 대응에 라운드 및 확대 상대적 nGFP 양성 세포를 . </li><li> 는 z-스택의 하위로이 비행기를 설정합니다. 전체 ONL (그림 2A, B) 이미징 될 것입니다 있는지 확인합니다. </li><li> 이미징 기간 동안 다시 조정 필요 초점면의 변화를 경험하는 경우 &#39;홈&#39;위치로 지정하는 &#39;Z&#39;서브 윈도우의 중간 위치를 두 번 클릭합니다. 로 변경 &#39;대칭 모드 정의&#39;와 &#39;상대&#39;을 클릭합니다. </li><li> 1 ㎛ 0.7 사이의 Z-단계의 크기를 설정합니다. </li></ol></li><li> Z 강도 보정 : <ol><li> 때문에 빛의 산란에 픽셀 강도의 손실을 보상하기 위해 Z-강도 보정을 적용 할 때 조직의 깊은 층에있는 영상. </li><li> 보정을 설정하려면 &#39;Z-강도 보정&#39;창을 엽니 다. &#39;Z-스택 범위&#39;, &#39;ND에서&#39;선택을 설정합니다. </li><li> 게인 (A1 컴팩트 GUI합니다 ( &#39;A1MP GUI&#39;에서 &#39;수집 영역&#39;) 레이저 강도를 (이 경우, 신경절 세포 층에 해당)가 &#39;Z-강도 보정&#39;창 하단의 초점면을 클릭하고 설정 ). </li><li> 이후 선택한 초점면의 &#39;Z-강도 보정&#39;창에서 &#39;장치 설정&#39;아래에 표시되는 설정을 확인하는 &#39;Z-강도 보정&#39;창에서 &#39;Z 값&#39;옆에있는 화살표를 클릭합니다. </li><li> 중간 A의 과정을 반복레이저 전력 이득을 증가시키는 ND 상부면. 필요할 경우 추가의 초점 평면을 첨가 할 수있다. 4 - 그림 2에 실험에 대한 구체적인 레이저 및 게인 설정은 표 1을 참조하십시오. </li><li> &#39;A1 MP GUI&#39;창에서 &#39;인수 영역&#39;을 설정합니다. (15)보다 큰 인수 영역과 photobleaching에 우회하는 영상의 시작에 이득보다 높은 126을 선택 피하고 소음 증가했다. 참고 : 레이저 및 광전자 증 배관 튜브 광표백을 피하면서 설정 한 현미경 최적의 촬영 조건을 얻기 위해 현미경 시스템, 테스트 레이저 및 게인 설정 사이에 차이가있다. </li><li> &#39;Z-강도 보정&#39;창에서 &#39;상대 강도 보정&#39;을 선택합니다. </li></ol></li><li> &#39;ND 인수&#39;창에서 &#39;시계열&#39;서브 윈도우에서 8 시간에 시간과 &#39;지체없이&#39;로 간격을 설정합니다. 그런 다음, t에서 &#39;실행 Z-수정&#39;을 클릭해야합니다&#39;ND 획득&#39;창 버튼에서 그는 &#39;Z-스택&#39;하위 창은 3-D의 시계열을 획득한다. </li><li> 이미지 수집의 기간에 걸쳐 29 °의 C - (27)의 온도에서 망막 외식을 유지한다. </li><li> 화상 획득 기간 동안, 필요할 경우, 포스트 영상 분석을위한 이미지 품질을 유지하기 위해 전력 레벨 이득을 재조정. 5.11.4 - 조정에 대한 단계 5.11.2를 수행합니다. </li><li> 초점면 이동하는 경우, 일시 중지하거나 실행을 중지하고 단계를 다시 5.11를 수행합니다. 참고 : &#39;상대 Z-보정&#39;단계 5.12.7에서 선택되었다 단계 5.11.4이 수행 된 경우 광범위한 광표백가 발생하지 않는 한, 전력 및 이득 수준을 재조정 할 필요는 없습니다. </li></ol> 속도 6. 분석 <ol><li> 이미지에 &#39;관심 지역&#39;을 설정, 시간의 압축을 풉니 다. &#39;시간 측정&#39;도구를 사용하여 스프레드 시트에 시간 값을 내보낼 수 있습니다. </li><li> 디를 포함하는 영역을 자르기이용하므로의 GFAP : nGFP 양성 핵. </li><li> 그 다음에 분할 핵 기저 INL 관련하여 이전의 거리를 측정하기 위해 기준 포인트를 설정하기 위해 INM을받지 않은 적어도 하나의 핵을 포함되도록 자른 영역을 선택한다. 참고 : 기초 INL에 남아 핵를 선택하려면,이 시계열의 3 차원 재구성을 준비하는 데 도움이됩니다. </li><li> GFAP 경우 대안 : nGFP 양성 세포의 획득주기에 걸쳐 ONL 관찰되어 기준점을 식별하기 위해 기저 INL에 ONL 핵에서 스패닝 고정 길이의 수직 라인을 사용한다. </li><li> &#39;쇼 조각보기&#39;기능을 사용하여 직교 돌기를 생성합니다. 그 후, &#39;최대 강도 투사&#39;에서 &#39;조각&#39;의 모드를 변경합니다. </li><li> 직교 최대 투사의 &#39;XY&#39;보기를 끄십시오. 이주중인 / 분할 핵, 가장 볼 수있는 방향에 따라LSO는 &#39;xz&#39;- 또는&#39;yz&#39;보기 중 하나를 끕니다. </li><li> 마우스 오른쪽 버튼으로 남아있는 이미지를 클릭이보기에서 새 문서 만들기 &#39;함수&#39;XZ &#39;또는&#39;를 함께 yz&#39; 이미지 시리즈 &#39;를 추출합니다. 필요한 경우, 이미지를 회전. </li><li> &#39;수동 측정&#39;기능을 사용하여, 기초의 INL 유지 및 INM받지 않는 핵의 하부 레벨에서는 이미지의 수평 라인을 그릴 (= 기준점,도 4a를 - E 적색 가로줄). </li><li> 기준선 및 분석 소프트웨어의 &#39;선 측정&#39;도구 (- E도 4a 참조)를 사용하여 시계열에 대한 이주 핵의 기점 사이의 거리를 측정한다. </li><li> 핵막가 고장 나면 그것은 전체 셀에 GFP의 확산 다음으로 식별되면, 소마의 기초 위치를 측정한다. </li><li> 스프레드 시트 소프트웨어를 사용하면, 거리에게 플레이 플롯cleus (그림 4 층) 전달 된 시간에 대해 마이그레이션. <ol><li> 발생 (V a)는, 그래프의 거리가 핵 봉투 고장 전의 기간 동안 여행 혀끝의 이동 속도 (그림 4 세대)를 결정합니다. </li><li> 차트에서 데이터 계열을 선택, 마우스를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 해당 기능 &#39;Y = MX + C&#39;를 포함하는 선형 회귀 곡선을 삽입합니다. 함수의 기울기 &#39;m&#39;은 속도를 나타내고, V A (도 4G). </li><li> 반복 기저 이동 속도, V의 B (그림 4H)을 결정하기 위해 빠른 기초 마이그레이션의 첫 단계에 대한 6.11.1과 6.11.2 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+of+chick+retinal+development+in+relation+to+gap+junctional+communication.">Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication.</a> J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).</li><li>Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+maintains+the+quiescent+progenitor+cell+state+of+postnatal+retinal+Muller+glia.">SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia.</a> Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).</li><li>Nickerson, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+and+analysis+of+postnatal+mouse+retinal+development.">Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development.</a> BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).</li><li>Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+photoreceptor+types+in+zebrafish+are+generated+by+symmetric+terminal+divisions+of+dedicated+precursors.">Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+adult+rat+retinal+explant+model+for+screening+of+potential+retinal+ganglion+cell+neuroprotective+therapies.">Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).</li><li>Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. 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M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3+defines+three+populations+of+Muller+glia+and+is+required+for+initiating+maximal+muller+glia+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+retina.">Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina.</a> J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).</li><li>Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Muller+glial+dependent+neuronal+regeneration+in+the+damaged+adult+zebrafish+retina.">Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).</li><li>Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+IL-6+family+cytokines+synergize+to+stimulate+Muller+glia+reprogramming+and+retina+regeneration.">Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration.</a> Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).</li><li>Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+is+necessary+and+sufficient+for+Muller+glia+dedifferentiation+and+retina+regeneration.">HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration.</a> Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).</li><li>Lenkowski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+regeneration+in+adult+zebrafish+requires+regulation+of+TGFbeta+signaling.">Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling.</a> Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).</li><li>Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+position+and+morphology+of+committed+precursor+cells+in+the+zebrafish+retina+adapt+to+architectural+changes+upon+tissue+maturation.">Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation.</a> Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).</li><li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitor+of+phagocytosis,+O-phospho-L-serine,+suppresses+Muller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina.">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).</li><li>Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+dynamic+imaging+of+retinal+microglia+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+living+photoreceptors+contributes+to+inherited+retinal+degeneration.">Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration.</a> EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).</li><li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo.">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li><li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord.">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

손상된 성인 제브라 망막 주로 사용한 면역 세포 화학 방법을 5, 25, 26, 27, 28, 29, (30)의 재생을 관리하는 메커니즘을 조사 연구. 배양 망막 이식편에 조건을 설정하고, 이러한 INM 같은 현상 라이브 세포 이미징을 수행 우리 ?...

인간과 달리, 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 전시회 망막 뉴런 1, 2, 3, 4의 세포 사멸시 강력한 재생 응답. 종양 괴사 인자 α, 망막 신경 세포가 죽음으로부터 방출 된 시그널링 분자는 신경 세포로 분화하기 전에 증식 계속 신경 전구 세포를 5 증식 및 생산할 수있는 기저 내부 핵 층 망막 (INL)에 상주 뮐러 아교 세포를 유도 이 사망 종류 3,4-. 재생 응답의 증식기 동안 뮐러 아교 세포의 핵 및 유래 신경 전구 세포는 세포주기 (Interkinetic 핵 마이그레이션 INM) (6) 상에 반복적 이동성 패턴을 겪는다 </sup<html> &gt; 7. 기초 INL에 위치 핵이 발생하는 핵이 INL에 basally 반환하기 전에 그들이 나누는 외부 핵 계층 (ONL)에 이주하기 전에 자신의 DNA를 복제합니다. 라이브 세포 이미징 방식 나중에 사우어 8, 9, 10, 11, 12에 의해 해석을 확인하면서 처리는 먼저, 조직 학적 방법을 사용 neuroepithelial 개발 중에 기재 하였다. 두 조직 화학적 및 라이브 셀 촬상 접근법 INM 망막 9, 11, 12, 13을 포함 neuroepithelia 개발에 그 기능을 기본 메커니즘을 결정하는데 사용되어왔다. 그러나 망막을 재생 성인의 INM을 지배하는 메커니즘은 자세히 연구되지 않았다외부 참조 &quot;&gt; 6, 7. 라이브 셀 이미징은 성인 재생 망막에 INM을 제어하는 신호 전달 경로에 대한 지식을 향상 할 수있는 매우 중요한 방법이 될 것입니다. 최근까지, 망막 INM의 라이브 세포 이미징 라이브 제브라 배아 하나 또는 병아리 배아 또는 출생 후의 마우스 망막 이식편 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16에 한정되었다. 마우스, 래트 및 지브라 피쉬 포함한 다양한 종의 동물 성체의 망막 이식편은 다른 세포 생물학적 접근 17, 18, 19, 20을 위해 이용되었지만, 라이브 세포 이미징 실험 망막 하 이식편을 사용하여적이 시간의 기간을 브리핑하기 위해 제한된 몇 시간 (21, 22)를 통해 지속적으로 실행되지 않았다. 여기서 우리는 다 광자 현미경 (6)을 사용하여 라이브 세포 이미징 실험을 모니터링 INM을 수행하기 위해 문화 가벼운 손상 성인 zebrafish의 망막에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. INM 역학으로, 예를 들면 속도가 오히려 잠재적 면역 세포 화학을 이용하여 검출되지 않을 분열의 위치보다 더 영향을받을 수도 INM 제어 메커니즘을 조사 할 때 라이브 셀 촬상 방법은 면역 조직 화학적 방법에 비해 유리하다. 향후,이 방법은 또한 가능성이있다하는 등의 뮐러 아교 세포 또는 미세 아교 세포의 행동에 의해 광 수용체를 죽음의 식균 작용으로 망막 재생하는 동안 다른 동적 프로세스를 연구하기 위해 수정 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Dumont forceps #5</td><td>World precision instruments</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>Dumont forceps #5, 45&amp;deg; angle</td><td>World precision instruments</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas scissors</td><td>World precision instruments</td><td>501233</td><td></td></tr><tr><td>Fluordishes</td><td>World precision instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>SMZ-1B</td><td>similar type of dissection stereomicroscope will work</td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet class type A2</td><td>Labconco</td><td></td><td>equivalent type will work</td></tr><tr><td>tissue culture incubator</td><td>Thermoscientific</td><td>HEPA-class 100</td><td>equivalent type will work</td></tr><tr><td>Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO</td><td>Bulbtronics</td><td>31850</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m pore-size Acrodisc syringe filter</td><td>VWR</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-lok syringe</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>60 mL Luer-lok syringe</td><td>VWR</td><td>BD309653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>FischerScientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ThermoScientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>EMD Millipore</td><td>5980</td><td></td></tr><tr><td>HBSS w/o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, w/o phenol red, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM w/o phenol red, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>5100-038</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum, heat-inactivated</td><td>ThermoScientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>VWR</td><td>16777-164</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure low melting point agarose</td><td>ThermoScientific</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>ethanol, absolute</td><td>ThermoScientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>2-phenoxyethanol</td><td>Sigma</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>refractive index liquid&amp;nbsp;</td><td>Cargille Lab</td><td>1803Y</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser</td><td>Nikon</td><td></td><td>equivalent system will work</td></tr><tr><td>40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes</td><td>Okolab</td><td></td><td>equivalent system will work</td></tr><tr><td>NIS analysis software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

culture of adult transgenic zebrafish retinal explants for live-cell imaging by multiphoton microscopy

내인성 재생 프로그램은 신경 손상과 죽음 다음 (다니오 레 리오) 망막 성인 제브라 피쉬에서 뮐러 아교 세포에 의해 시작된다. 뮐러 아교 세포의 세포주기를 재 입력하고 세포 분열의 다음 라운드를 받아야하고 손실 된 신경 세포 유형으로 분화 신경 전구 세포를 생성합니다. 두 뮐러 아교 세포 및 신경 전구 세포의 핵은 DNA 복제 및 Interkinetic으로 설명한 프로세스의 망막, 즉 그들이 각각 기부 내부 핵 층 (INL) 및 (ONL)에는 외부 핵 층 사이에 이전의 별개의 위치에 유사 분열 핵 마이그레이션 (INM). INM은 주로 개발 망막에서 연구되고있다. 자세히 zebrafish의 망막을 재생 성인의 INM의 역학을 조사하기 위해 형광 표지 뮐러 아교 세포 / 신경 전구 세포의 라이브 세포 이미징이 필요합니다. 여기, 우리는 분리하는 조건 및 문화 지느러미 망막을 제공의 Tg에서 [GFAP : nGFP] 35 시간 동안 일정한 강렬한 빛에 노출 된 mi2004의 제브라 피쉬. 우리는 이러한 망막 문화가 지속적으로 GFAP의 철새 동작을 모니터링하는 광자 현미경을 사용하여 최대 8 시간 동안 망막 절편의 두께에 걸쳐 Z - 스택 이미지를 획득, 라이브 세포 이미징 실험을 수행하는 실행 가능한 것을 보여 nGFP 양성 세포를 . 또, 정점 및 기저 INM의 속도를 결정하는 사후 영상 분석을 수행하는 내용을 설명한다. 요약하면, 우리는 신경 재생의 성인 모델에서 INM의 역학을 공부하는 조건을 설립했다. 이것은이 중요한 세포 과정에 대한 우리의 이해를 발전 우리가 INM을 제어하는 ​​메커니즘을 확인 할 수 있습니다.

그림 1의 회로도에 설명 된 절차에 따라 망막의 분리는 가벼운 손상 성인의 Tg에서 평평 지느러미 망막의 배양을 할 수 있습니다 [GFAP : nGFP] 5 % CO 적어도 24 시간에 걸쳐 mi2004 제브라 피쉬 2 / 공기 환경을 제공합니다. 이러한 평면 장착 망막 이식편 깊은 조직 레벨에서의 이미지의 초점 평면에 사용될 수있다. 예는 뮐러 아교 ...

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Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

culture-adult-transgenic-zebrafish-retinal-explants-for-live-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K 조회수.  University of Notre Dame.  제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다. 

비디오: Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

연구

발생학

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

생물학

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding diseases, and future therapies hinge on fundamental understandings about how different retinal cells function normally. Gaining such information with biochemical methods has proven difficult because contributions of particular cell types are diminished in the retinal cell milieu. Live retinal imaging can provide a view of numerous biological processes on a subcellular level, thanks to a growing number of genetically encoded fluorescent biosensors. However, this technique has thus far been limited to tadpoles and zebrafish larvae, the outermost retinal layers of isolated retinas, or lower resolution imaging of retinas in live animals. Here we present a method for generating live ex vivo retinal slices from adult zebrafish for live imaging via confocal microscopy. This preparation yields transverse slices with all retinal layers and most cell types visible for performing confocal imaging experiments using perfusion. Transgenic zebrafish expressing fluorescent proteins or biosensors in specific retinal cell types or organelles are used to extract single-cell information from an intact retina. Additionally, retinal slices can be loaded with fluorescent indicator dyes, adding to the method&#39;s versatility. This protocol was developed for imaging Ca2+ within zebrafish cone photoreceptors, but with proper markers it could be adapted to measure Ca2+ or metabolites in M&#252;ller cells, bipolar and horizontal cells, microglia, amacrine cells, or retinal ganglion cells. The retinal pigment epithelium is removed from slices so this method is not suitable for studying that cell type. With practice, it is possible to generate serial slices from one animal for multiple experiments. This adaptable technique provides a powerful tool for answering many questions about retinal cell biology, Ca2+, and energy homeostasis.

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Imaging retinal tissue can provide single-cell information that cannot be gathered from traditional biochemical methods. This protocol describes preparation of retinal slices from zebrafish for confocal imaging. Fluorescent genetically encoded sensors or indicator dyes allow visualization of numerous biological processes in distinct retinal cell types.

Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

신경과학

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

신경 발달 도중 ROS 살아있는 세포 화상 진찰

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...