우리는 윌리엄 아처와 노트르담 통합 이미징 시설에서 제공하는 지원을 주셔서 감사합니다. 특별 감사는 지속적인 도움과 자신의 관심과 제브라 피쉬의 축산에 대한 Freimann 생명 과학 기술자로 보내집니다. 본 연구는 DRH에 NIH 국립 안과 연구소 (R01-EY018417, R01-EY024519)과 Zebrafish의 연구 센터, 노트르담 대학교, 노트르담, IN에서 보조금에 의해 지원되었다.

참고 : 제브라 피쉬가 발생하고 Freimann 생명 과학 센터의 노트르담 Zebrafish의 시설에서 유지 하였다. 이 논문에 기술 된 방법은 노트르담 동물 관리 및 사용위원회의 대학 승인 및 비전 및 안과 연구 협회에 의해 비전 연구에 동물의 사용을 위해 문을 준수하고 있습니다. 1. 솔루션 <ol><li> 조직 문화 후드 및 장비 / 조직 문화 후드로 전송되는 시약을 소독하기 위해 70 % 에탄올을 준비합니다. </li><li> (500 2- 페녹시 에탄올 1) 시스템의 물 1 L에 2- 페녹시 에탄올 2 mL를 넣고. </li><li> 0.1 밀리미터의 NaHCO3, pH가 8.0을 준비합니다. 멸균 조직 문화 후드에서 솔루션을 소독하기 위해 10 ML의 주사기와 0.2 μm의 기공 크기의 주사기 필터를 사용합니다. 참고 : NaHCO3을 효율적으로 fluorodishes의 커버 슬립 표면을 가로 질러 세포와 조직 접착제를 확산시키는 데 사용된다 () 3.2 단계. </li><li> 준비 1.0 M CaCl2를 1.0 M의 MgCl 2. 멸균 조직 배양 후드에서 10 ㎖ 시린지 및 0.2 ㎛의 세공 크기의 주사기 필터로 멸균. </li><li> Hank&#39;s 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 준비하려면, 1 mM의 각각의 최종 농도에서 페놀 레드없이 칼슘 / 마그네슘 2+없이 1 배 HBSS에의 MgCl 2 CaCl2를 살균 및 멸균을 추가합니다. 무균 환경에서 작업 할 수 있습니다. </li><li> 50 % 페놀 레드없이 1 배 최소 필수 중간 (MEM), 25 % 염화칼슘 2의 MgCl 2를 포함하는 HBSS는 (섹션 1.4 참조), 25 % 말 혈청 (HS), 10 단위 / mL의 페니실린, 10를 혼합 배지를 준비하려면 μg의 / ML의 스트렙토 마이신. 무균 환경에서 작업 할 수 있습니다. 참고 :함으로써 노이즈 비율로 신호에 영향을 미치는, autofluoresces으로 페놀 레드를 포함하는 매체를 피하십시오. (23) </li><li> 페놀 레드없이 1 배 MEM 1 % 저 융점 아가로 오스의 10 ㎖를 준비합니다. 아가로 오스 / 1 배 MEM은 전자 레인지,를 사용하여 용융AVE. 유체의 증발에 의한 이온 농도를 변경됩니다 반복 재가열로 아가로 오스 (예를 들어, 10 ㎖)의 작은 볼륨을 준비합니다. </li><li> 배양에 앞서, 오토 클레이브를 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브 살균. </li></ol> 2. 라이트 피해 패러다임 <ol><li> 어두운 적응 <ol><li> 이 장소 - 3의 Tg [GFAP를 : nGFP] 6에서 mi2004의 제브라 피쉬 (또는 관심의 다른 형질 전환 제브라 피쉬) - 14 일에 대한 빛의없는 환경으로 시대의 14개월. 더욱 상세 내용은 참고 2, 6, 24, 25을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 2,800 룩스 2, 6, 24, 25의 광을 방출이 형광 램프 사이의 시스템 물에 3 어두운 적응 형질 전환 제브라 피쉬 - 2를 포함하는 탱크를 배치합니다. </l난&gt; <li> 35 시간 동안 일정한 강렬한 빛에 제브라 피쉬를 노출. 33 °의 C - 광 노광시, 수온 (31) 사이에 유지되는 것을 보장. </li></ol> 배양 3. 준비 (망막 분리의 날) <ol><li> 70 % 에탄올을 사용하여, 조직 배양 후드 성분 살균 / 조직 배양 후드로 옮기고되는 도구 (예를 들어, MEM 및 HBSS, 피펫, 멸균 피펫 팁 등을 포함하는 플라스.). </li><li> fluorodishes의 준비 <ol><li> 세포 및 조직 접착제와 각각의 망막을위한 코트 하나 fluorodish는 (재료의 표 참조). </li><li> 70 μg / ML의 최종 농도 0.1 mM의 NaHCO3을의 세포 및 조직 접착제를 희석 각 fluorodish 50 μL를 추가하고, 200 μL 피펫 팁으로 fluorodish의 중심을 가로 질러 용액을 확산 (약 1-1.2 cm 직경 ). </li><li> RT에서 3 시간 - 1 코팅 fluorodishes을 품어(또는, 4 ° C에서 O / N을 품어). </li><li> 솔루션을 제거하고 각 세척을위한 1 배 MEM 500 μL와 배를 씻어. 망막 외식가 장착 될 때까지 건조에서 코팅 fluorodishes을 방지하기 위해, MEM에서 그들을 유지합니다. </li></ol></li><li> 단계 1.6에 설명 된대로 배지를 준비합니다. 배양액을 1 주일까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 망막의 Explants 4. 분리 및 배양 참고 : 아래에 설명 된 프로토콜은 주로 설명 광 손상 패러다임에 의해 병변 된 망막 영역이다 지느러미 망막의 분리입니다. 따라서, 손상에 의한 증식과 interkinetic 핵 마이그레이션 관련 이벤트는 지느러미 망막에 발생합니다. 그러나 상기 분리 방법은 연구 / 조사 질문의 특정 요구 사항에 따른 망막 영역을 생성하도록 조정될 수있다. <ol><li> 하나의 광 손상 형질 전환 제브라 피쉬 a를 안락사1 타 시간 : 500 2- 페녹시 에탄올. </li><li> 1,000 μL 피펫으로 한 fluorodish에서 MEM을 제거 유체 유적의 박막 있도록. </li><li> 마른 종이 타월에 제브라 피쉬 이동 뒤몽 포셉 (핀셋 # 5, 45 ° 각도)의 곡선 쌍의 눈을 제거하고 fluorodish에 그것을 전송할 수 있습니다. </li><li> 시신경과 눈 뒤쪽 표시되도록 입체 현미경을 사용하여, (도 1D)에 fluorodish의 커버 슬립 상에 동공과 눈의 방향. </li><li> 맥퍼슨 - Vannas 가위 한 쌍의 눈 뒤쪽에 가까운 절단, 시신경을 제거합니다. 또한, 안구의 외측에 감 결합 조직을 제거한다. </li><li> 사상 판을 통해 하나의 가위 블레이드 피어싱과 코와 눈의 시간적 양쪽을 따라 절단하여 광학 줄기에서 절개를하는 동안 # 5 포셉 한 쌍의 비강 및 시간 측면 사이의 눈을 잡고 (그림 1E 참조 , 분할 리네브라스카). </li><li> 망막의 등 쪽과, 지느러미 망막에서 복부를 별도의 조직을 당겨 다른 쌍을 유지 # 5 포셉 두 쌍을 사용. 참고 : 공막이 위를 향하면서 렌즈와 신경절 세포 층이 coverslip에 직면 있도록 지느러미 망막의 방향을하는 것이 좋습니다. </li><li> # 5 포셉 (그림 1H, I)의 두 번째 쌍의 망막에 연결되어있는 렌즈를 누른 상태에서, # 5 포셉 한 쌍의 지느러미 망막에서 공막을 제거합니다. </li><li> 렌즈를 제거하려면, 맥퍼슨 - Vannas 가위를 사용하여 망막 (그림 1I, J)을 손상시키지 않고 렌즈 뒤에 잘라. 경우에 따라 렌즈는 단계 4.7에서 분리합니다. 이 경우, # 5 포셉의 두 번째 쌍의 절단 가장자리에있는 망막을 잡고 집게로 조심스럽게 공막를 제거합니다. </li><li> 망막에 손상을주지 않고 렌즈를 제거하는 동안 유리체를 제거합니다. 커버 슬립 대향 신경절 세포 층 망막 평평fluorodish의 (그림 1L, M). </li><li> 1 % 저 융점 아가로 오스 10 μL와 망막 둘러싸고 아가로 오스가 고형화하자. </li><li> 심지어 약간의 상승이 조직에 깊이 집중하는 능력에 영향을 미칠 수있는 액체 아가로 오스가 망막을 들어 올리지 않는 것을보십시오. 리프팅이 관찰되는 경우, 아가로 오스를 제거하는 피펫을 사용합니다. 더 추가하기 전에 잔류 아가로 오스 세트를 보자. </li><li> 전체 fluorodish을 충당하기 위해 1 % 저 융점 아가로 오스를 추가하기 전에 여러 번 단계를 반복 4.12. 아가로 오스가 확정되면, 1.5 mL의 배지를 추가합니다. </li><li> 망막 분리 조작에 의해 발생하는 응력을 회복 할 수 있도록 약 12 시간 동안 32 ° C로 설정 5 % CO 2 / 공기 환경에서 망막 이식편 배양을 유지한다. 빛 처리 제브라 같은 온도에서 망막을 유지하도록 32 ° C의 온도를 설정한다 (단계 2.3 참조). </li></ol> 5. 다중 광자 현미경 (재료의 표 참조)하는 40X 아포 장거리 침수 목표 (1.15 NA)가 장착 된 광자 현미경, 검류계 스캐너와에 최적화 된 네 35mm 배양 접시에 대한 삽입을 포함 환경 챔버. 이미지는 비 descanned 검출기 (R-NDD)을 획득 하였다. <ol><li> 촬상에 앞서, 5 % CO 2 / 공기 분위기를 달성하는 환경 챔버를 평형. 빈 배양 접시가 방으로 가스의 누출을 방지하기 위해 홀더에 삽입되어 있는지 확인합니다. </li><li> 현미경 시스템을 켭니다. </li><li> 환경 챔버가 평형되면, 40X 아포 장거리 침수 목적 (NA 1.15)에 굴절률 액체를 추가 할 수 있습니다. 주 : 물과 유사한 광학 특성을 갖는 굴절률 액체 장기 촬상 중에 물의 증발을 방지하기 위해 사용된다. </li><li> 장소 독감챔버에 망막 외식과 orodishes. 브라이트 라이트를 사용하여 빛의 경로로 시료를 놓고 초점면에 지느러미 망막의 midregion을 가지고. </li><li> GFAP에 초점을 GFP의 epifluorescent 빛을 사용 nGFP는 뮐러 아교 세포의 핵 (그림 2A, C)를 양성. 참고 : nGFP 양성 핵하거나 희미 형광됩니다 외식 평면 또는 아가로 오스 이식편에서 축적 장착하지 않는 경우가 GFAP에 집중하기 어려울 것이다. <ol><li> 같은 망막 이식편 내에서 다른 지역으로 이동하는 초점 문제를 극복 여부를 확인합니다. 그렇지 않으면 다른 망막 이식편로 이동합니다. </li></ol></li><li> 이미지 수집 소프트웨어에서 &#39;A1 MP GUI&#39;는 &#39;TiPad&#39;에서 &#39;A1 컴팩트 GUI&#39;와 &#39;ND 취득&#39;창을 엽니 다. 광자 이미징의 경우, &#39;IR NDD&#39;옵션이 &#39;A1 컴팩트 GUI&#39;에서 선택되어 있는지 확인합니다. </li><li> &#39;settin에서g &#39;필드는, 1 차 다이크로 익 미러 IR-DM을 선택하고 GFP의 형광을 취득 50분의 525 대역 통과 필터를 선택합니다. </li><li> &#39;A1MP GUI&#39;라고 표시된 창에서 IR 레이저에 전환합니다. 레이저가 준비하는 것은 몇 분 정도 소요됩니다. GFP의 형광을 자극하고 &#39;A1 MP GUI&#39;창에서 &#39;자동 정렬&#39;버튼을 클릭하여 레이저를 정렬 910 nm의 파장을 설정합니다. </li><li> 객실 및 장비 등은 광전자 증 배관의 과다 노출을 방지하기 위해 &#39;A1 MP GUI&#39;에 셔터를 열기 전에 꺼 또는 포함되어 있는지 확인합니다. 소음을 줄이기 위해, 어두운 환경에서 현미경 집. </li><li> 두개의 줌, 4.8 μS / 화소의 화소 보압 시간 300 X 300 픽셀의 시야의 이미지를 획득. 대략 &#39;A1MP GUI&#39;와 &#39;A1 컴팩트 GUI&#39;창에서 이득에서 &#39;수집 영역&#39;을 변경하여 레이저 출력을 설정합니다. </li><li> 는 z 스택 설정 <ol><li> ND 획득 &#39;창&#39;을 내 Z &#39;서브 윈도우&#39;는의 Z - 스택의 상단에 초점면을 설정 신경절 세포 층에 초점을 맞 춥니 다. 일부 GFAP : nGFP 양성 세포는 일반적으로 망막 (도 2A, D)의 기부 제한을 식별하는 데 도움 신경절 세포 층에 위치한다. </li><li> ONL의 수준을 통해 초점면을 이동 (그림 2A, B), 희미하게 표시 GFAP의 존재에 의해 특징되는 다음 INL (그림 2A, C)에서의 대응에 라운드 및 확대 상대적 nGFP 양성 세포를 . </li><li> 는 z-스택의 하위로이 비행기를 설정합니다. 전체 ONL (그림 2A, B) 이미징 될 것입니다 있는지 확인합니다. </li><li> 이미징 기간 동안 다시 조정 필요 초점면의 변화를 경험하는 경우 &#39;홈&#39;위치로 지정하는 &#39;Z&#39;서브 윈도우의 중간 위치를 두 번 클릭합니다. 로 변경 &#39;대칭 모드 정의&#39;와 &#39;상대&#39;을 클릭합니다. </li><li> 1 ㎛ 0.7 사이의 Z-단계의 크기를 설정합니다. </li></ol></li><li> Z 강도 보정 : <ol><li> 때문에 빛의 산란에 픽셀 강도의 손실을 보상하기 위해 Z-강도 보정을 적용 할 때 조직의 깊은 층에있는 영상. </li><li> 보정을 설정하려면 &#39;Z-강도 보정&#39;창을 엽니 다. &#39;Z-스택 범위&#39;, &#39;ND에서&#39;선택을 설정합니다. </li><li> 게인 (A1 컴팩트 GUI합니다 ( &#39;A1MP GUI&#39;에서 &#39;수집 영역&#39;) 레이저 강도를 (이 경우, 신경절 세포 층에 해당)가 &#39;Z-강도 보정&#39;창 하단의 초점면을 클릭하고 설정 ). </li><li> 이후 선택한 초점면의 &#39;Z-강도 보정&#39;창에서 &#39;장치 설정&#39;아래에 표시되는 설정을 확인하는 &#39;Z-강도 보정&#39;창에서 &#39;Z 값&#39;옆에있는 화살표를 클릭합니다. </li><li> 중간 A의 과정을 반복레이저 전력 이득을 증가시키는 ND 상부면. 필요할 경우 추가의 초점 평면을 첨가 할 수있다. 4 - 그림 2에 실험에 대한 구체적인 레이저 및 게인 설정은 표 1을 참조하십시오. </li><li> &#39;A1 MP GUI&#39;창에서 &#39;인수 영역&#39;을 설정합니다. (15)보다 큰 인수 영역과 photobleaching에 우회하는 영상의 시작에 이득보다 높은 126을 선택 피하고 소음 증가했다. 참고 : 레이저 및 광전자 증 배관 튜브 광표백을 피하면서 설정 한 현미경 최적의 촬영 조건을 얻기 위해 현미경 시스템, 테스트 레이저 및 게인 설정 사이에 차이가있다. </li><li> &#39;Z-강도 보정&#39;창에서 &#39;상대 강도 보정&#39;을 선택합니다. </li></ol></li><li> &#39;ND 인수&#39;창에서 &#39;시계열&#39;서브 윈도우에서 8 시간에 시간과 &#39;지체없이&#39;로 간격을 설정합니다. 그런 다음, t에서 &#39;실행 Z-수정&#39;을 클릭해야합니다&#39;ND 획득&#39;창 버튼에서 그는 &#39;Z-스택&#39;하위 창은 3-D의 시계열을 획득한다. </li><li> 이미지 수집의 기간에 걸쳐 29 °의 C - (27)의 온도에서 망막 외식을 유지한다. </li><li> 화상 획득 기간 동안, 필요할 경우, 포스트 영상 분석을위한 이미지 품질을 유지하기 위해 전력 레벨 이득을 재조정. 5.11.4 - 조정에 대한 단계 5.11.2를 수행합니다. </li><li> 초점면 이동하는 경우, 일시 중지하거나 실행을 중지하고 단계를 다시 5.11를 수행합니다. 참고 : &#39;상대 Z-보정&#39;단계 5.12.7에서 선택되었다 단계 5.11.4이 수행 된 경우 광범위한 광표백가 발생하지 않는 한, 전력 및 이득 수준을 재조정 할 필요는 없습니다. </li></ol> 속도 6. 분석 <ol><li> 이미지에 &#39;관심 지역&#39;을 설정, 시간의 압축을 풉니 다. &#39;시간 측정&#39;도구를 사용하여 스프레드 시트에 시간 값을 내보낼 수 있습니다. </li><li> 디를 포함하는 영역을 자르기이용하므로의 GFAP : nGFP 양성 핵. </li><li> 그 다음에 분할 핵 기저 INL 관련하여 이전의 거리를 측정하기 위해 기준 포인트를 설정하기 위해 INM을받지 않은 적어도 하나의 핵을 포함되도록 자른 영역을 선택한다. 참고 : 기초 INL에 남아 핵를 선택하려면,이 시계열의 3 차원 재구성을 준비하는 데 도움이됩니다. </li><li> GFAP 경우 대안 : nGFP 양성 세포의 획득주기에 걸쳐 ONL 관찰되어 기준점을 식별하기 위해 기저 INL에 ONL 핵에서 스패닝 고정 길이의 수직 라인을 사용한다. </li><li> &#39;쇼 조각보기&#39;기능을 사용하여 직교 돌기를 생성합니다. 그 후, &#39;최대 강도 투사&#39;에서 &#39;조각&#39;의 모드를 변경합니다. </li><li> 직교 최대 투사의 &#39;XY&#39;보기를 끄십시오. 이주중인 / 분할 핵, 가장 볼 수있는 방향에 따라LSO는 &#39;xz&#39;- 또는&#39;yz&#39;보기 중 하나를 끕니다. </li><li> 마우스 오른쪽 버튼으로 남아있는 이미지를 클릭이보기에서 새 문서 만들기 &#39;함수&#39;XZ &#39;또는&#39;를 함께 yz&#39; 이미지 시리즈 &#39;를 추출합니다. 필요한 경우, 이미지를 회전. </li><li> &#39;수동 측정&#39;기능을 사용하여, 기초의 INL 유지 및 INM받지 않는 핵의 하부 레벨에서는 이미지의 수평 라인을 그릴 (= 기준점,도 4a를 - E 적색 가로줄). </li><li> 기준선 및 분석 소프트웨어의 &#39;선 측정&#39;도구 (- E도 4a 참조)를 사용하여 시계열에 대한 이주 핵의 기점 사이의 거리를 측정한다. </li><li> 핵막가 고장 나면 그것은 전체 셀에 GFP의 확산 다음으로 식별되면, 소마의 기초 위치를 측정한다. </li><li> 스프레드 시트 소프트웨어를 사용하면, 거리에게 플레이 플롯cleus (그림 4 층) 전달 된 시간에 대해 마이그레이션. <ol><li> 발생 (V a)는, 그래프의 거리가 핵 봉투 고장 전의 기간 동안 여행 혀끝의 이동 속도 (그림 4 세대)를 결정합니다. </li><li> 차트에서 데이터 계열을 선택, 마우스를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 해당 기능 &#39;Y = MX + C&#39;를 포함하는 선형 회귀 곡선을 삽입합니다. 함수의 기울기 &#39;m&#39;은 속도를 나타내고, V A (도 4G). </li><li> 반복 기저 이동 속도, V의 B (그림 4H)을 결정하기 위해 빠른 기초 마이그레이션의 첫 단계에 대한 6.11.1과 6.11.2 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol>

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+and+analysis+of+postnatal+mouse+retinal+development.">Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development.</a> BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).</li><li>Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+photoreceptor+types+in+zebrafish+are+generated+by+symmetric+terminal+divisions+of+dedicated+precursors.">Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+adult+rat+retinal+explant+model+for+screening+of+potential+retinal+ganglion+cell+neuroprotective+therapies.">Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).</li><li>Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+retinal+whole+mounts.">In vitro imaging of retinal whole mounts.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li><li>Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Retinal+Ganglion+Cell+Dendritic+Field+Degeneration+Imaged+in+Organotypic+Retinal+Explant+Culture.">Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).</li><li>Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blue+light+on+photoreceptors+in+a+live+retinal+explant+system.">Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system.</a> Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).</li><li>Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+processes+by+long-term+live+imaging--historic+problems+and+current+solutions.">Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions.</a> J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).</li><li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish.">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).</li><li>Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repressing+notch+signaling+and+expressing+TNFalpha+are+sufficient+to+mimic+retinal+regeneration+by+inducing+Muller+glial+proliferation+to+generate+committed+progenitor+cells.">Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells.</a> J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).</li><li>Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3+defines+three+populations+of+Muller+glia+and+is+required+for+initiating+maximal+muller+glia+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+retina.">Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina.</a> J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).</li><li>Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Muller+glial+dependent+neuronal+regeneration+in+the+damaged+adult+zebrafish+retina.">Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).</li><li>Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+IL-6+family+cytokines+synergize+to+stimulate+Muller+glia+reprogramming+and+retina+regeneration.">Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration.</a> Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).</li><li>Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+is+necessary+and+sufficient+for+Muller+glia+dedifferentiation+and+retina+regeneration.">HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration.</a> Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).</li><li>Lenkowski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+regeneration+in+adult+zebrafish+requires+regulation+of+TGFbeta+signaling.">Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling.</a> Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).</li><li>Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+position+and+morphology+of+committed+precursor+cells+in+the+zebrafish+retina+adapt+to+architectural+changes+upon+tissue+maturation.">Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation.</a> Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).</li><li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitor+of+phagocytosis,+O-phospho-L-serine,+suppresses+Muller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina.">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).</li><li>Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+dynamic+imaging+of+retinal+microglia+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+living+photoreceptors+contributes+to+inherited+retinal+degeneration.">Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration.</a> EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).</li><li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo.">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li><li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord.">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

손상된 성인 제브라 망막 주로 사용한 면역 세포 화학 방법을 5, 25, 26, 27, 28, 29, (30)의 재생을 관리하는 메커니즘을 조사 연구. 배양 망막 이식편에 조건을 설정하고, 이러한 INM 같은 현상 라이브 세포 이미징을 수행 우리 ?...

인간과 달리, 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 전시회 망막 뉴런 1, 2, 3, 4의 세포 사멸시 강력한 재생 응답. 종양 괴사 인자 α, 망막 신경 세포가 죽음으로부터 방출 된 시그널링 분자는 신경 세포로 분화하기 전에 증식 계속 신경 전구 세포를 5 증식 및 생산할 수있는 기저 내부 핵 층 망막 (INL)에 상주 뮐러 아교 세포를 유도 이 사망 종류 3,4-. 재생 응답의 증식기 동안 뮐러 아교 세포의 핵 및 유래 신경 전구 세포는 세포주기 (Interkinetic 핵 마이그레이션 INM) (6) 상에 반복적 이동성 패턴을 겪는다 </sup<html> &gt; 7. 기초 INL에 위치 핵이 발생하는 핵이 INL에 basally 반환하기 전에 그들이 나누는 외부 핵 계층 (ONL)에 이주하기 전에 자신의 DNA를 복제합니다. 라이브 세포 이미징 방식 나중에 사우어 8, 9, 10, 11, 12에 의해 해석을 확인하면서 처리는 먼저, 조직 학적 방법을 사용 neuroepithelial 개발 중에 기재 하였다. 두 조직 화학적 및 라이브 셀 촬상 접근법 INM 망막 9, 11, 12, 13을 포함 neuroepithelia 개발에 그 기능을 기본 메커니즘을 결정하는데 사용되어왔다. 그러나 망막을 재생 성인의 INM을 지배하는 메커니즘은 자세히 연구되지 않았다외부 참조 &quot;&gt; 6, 7. 라이브 셀 이미징은 성인 재생 망막에 INM을 제어하는 신호 전달 경로에 대한 지식을 향상 할 수있는 매우 중요한 방법이 될 것입니다. 최근까지, 망막 INM의 라이브 세포 이미징 라이브 제브라 배아 하나 또는 병아리 배아 또는 출생 후의 마우스 망막 이식편 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16에 한정되었다. 마우스, 래트 및 지브라 피쉬 포함한 다양한 종의 동물 성체의 망막 이식편은 다른 세포 생물학적 접근 17, 18, 19, 20을 위해 이용되었지만, 라이브 세포 이미징 실험 망막 하 이식편을 사용하여적이 시간의 기간을 브리핑하기 위해 제한된 몇 시간 (21, 22)를 통해 지속적으로 실행되지 않았다. 여기서 우리는 다 광자 현미경 (6)을 사용하여 라이브 세포 이미징 실험을 모니터링 INM을 수행하기 위해 문화 가벼운 손상 성인 zebrafish의 망막에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. INM 역학으로, 예를 들면 속도가 오히려 잠재적 면역 세포 화학을 이용하여 검출되지 않을 분열의 위치보다 더 영향을받을 수도 INM 제어 메커니즘을 조사 할 때 라이브 셀 촬상 방법은 면역 조직 화학적 방법에 비해 유리하다. 향후,이 방법은 또한 가능성이있다하는 등의 뮐러 아교 세포 또는 미세 아교 세포의 행동에 의해 광 수용체를 죽음의 식균 작용으로 망막 재생하는 동안 다른 동적 프로세스를 연구하기 위해 수정 될 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="876">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:491px;">Dumont forceps size #5</td>
			<td style="width:201px;">World precision instruments</td>
			<td align="right" style="width:113px;">14098</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps size #5, 45&#176; angle</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td align="right">14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McPherson-Vannas scissors</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td align="right">501233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluordishes</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>SMZ-1B</td>
			<td>similar type of dissection stereomicroscope will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biological Safety Cabinet class type A2</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>equivalent type will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tissue culture incubator</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>HEPA-class 100</td>
			<td>equivalent type will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO</td>
			<td>Bulbtronics</td>
			<td align="right">31850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m pore-size Acrodisc syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">4192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml Luer-lok syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml Luer-lok syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaHCO3</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td align="right">5980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM w/o phenol red, Gibco</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>5100-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse serum, heat-inactivated</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>26050-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16777-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ethanol, absolute</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-phenoxyethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">77699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refractive index liquid&#160;</td>
			<td>Cargille Lab</td>
			<td>1803Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>equivalent system will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>equivalent system will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS analysis software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of adult transgenic zebrafish retinal explants for live-cell imaging by multiphoton microscopy

내인성 재생 프로그램은 신경 손상과 죽음 다음 (다니오 레 리오) 망막 성인 제브라 피쉬에서 뮐러 아교 세포에 의해 시작된다. 뮐러 아교 세포의 세포주기를 재 입력하고 세포 분열의 다음 라운드를 받아야하고 손실 된 신경 세포 유형으로 분화 신경 전구 세포를 생성합니다. 두 뮐러 아교 세포 및 신경 전구 세포의 핵은 DNA 복제 및 Interkinetic으로 설명한 프로세스의 망막, 즉 그들이 각각 기부 내부 핵 층 (INL) 및 (ONL)에는 외부 핵 층 사이에 이전의 별개의 위치에 유사 분열 핵 마이그레이션 (INM). INM은 주로 개발 망막에서 연구되고있다. 자세히 zebrafish의 망막을 재생 성인의 INM의 역학을 조사하기 위해 형광 표지 뮐러 아교 세포 / 신경 전구 세포의 라이브 세포 이미징이 필요합니다. 여기, 우리는 분리하는 조건 및 문화 지느러미 망막을 제공의 Tg에서 [GFAP : nGFP] 35 시간 동안 일정한 강렬한 빛에 노출 된 mi2004의 제브라 피쉬. 우리는 이러한 망막 문화가 지속적으로 GFAP의 철새 동작을 모니터링하는 광자 현미경을 사용하여 최대 8 시간 동안 망막 절편의 두께에 걸쳐 Z - 스택 이미지를 획득, 라이브 세포 이미징 실험을 수행하는 실행 가능한 것을 보여 nGFP 양성 세포를 . 또, 정점 및 기저 INM의 속도를 결정하는 사후 영상 분석을 수행하는 내용을 설명한다. 요약하면, 우리는 신경 재생의 성인 모델에서 INM의 역학을 공부하는 조건을 설립했다. 이것은이 중요한 세포 과정에 대한 우리의 이해를 발전 우리가 INM을 제어하는 ​​메커니즘을 확인 할 수 있습니다.

그림 1의 회로도에 설명 된 절차에 따라 망막의 분리는 가벼운 손상 성인의 Tg에서 평평 지느러미 망막의 배양을 할 수 있습니다 [GFAP : nGFP] 5 % CO 적어도 24 시간에 걸쳐 mi2004 제브라 피쉬 2 / 공기 환경을 제공합니다. 이러한 평면 장착 망막 이식편 깊은 조직 레벨에서의 이미지의 초점 평면에 사용될 수있다. 예는 뮐러 아교 ...

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Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

culture-adult-transgenic-zebrafish-retinal-explants-for-live-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K 조회수.  University of Notre Dame.  제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다. 

비디오: Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

연구

발생학

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental manipulations in ovo/in vivo makes the chicken embryonic retina a versatile and very efficient experimental model. Although the chicken retina is easy to target in ovo by intraocular injections or electroporation, the effective and exact concentration of the reagents within the retina may be difficult to fully control. This may be due to variations of the exact injection site, leakage from the eye or uneven diffusion of the substances. Furthermore, the frequency of malformations and mortality after invasive manipulations such as electroporation is rather high.
This protocol describes an ex ovo technique for culturing whole retinal explants from chicken embryos and provides a method for controlled exposure of the retina to reagents. The protocol describes how to dissect, experimentally manipulate, and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explants can be cultured for approximately 24 hr and be subjected to different manipulations such as electroporation. The major advantages are that the experiment is not dependent on the survival of the embryo and that the concentration of the introduced reagent can be varied and controlled in order to determine and optimize the effective concentration. Furthermore, the technique is rapid, cheap and together with its high experimental success rate, it ensures reproducible results. It should be emphasized that it serves as an excellent complement to experiments performed in ovo.

This protocol describes a method to dissect, experimentally manipulate and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explant cultures are useful when high success rate, efficacy and reproducibility are needed to test the effects of plasmids for electroporation and/or reagent substances, i.e., enzymatic inhibitors.

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from the whole brain or from either the telencephalic, tectal or cerebellar regions of the adult zebrafish brain. Additionally, we describe the procedure to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres.

성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...