Wir schätzen die Unterstützung durch William Archer und der Notre Dame Integrated Imaging Facility. Besonderer Dank für ihre kontinuierliche Unterstützung und ihre Pflege und Haltung der Zebrabärbling den Freimann Life Sciences Techniker gerichtet. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Eye Institute of NIH DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) und dem Zentrum für Zebrabärblinge Forschung, University of Notre Dame, Notre Dame, IN unterstützt.

Hinweis: Zebrabärblinge wurden angehoben und in der Notre Dame Zebrabärbling Anlage im Freimann Life Sciences-Center erhalten. Die Verfahren in diesem Manuskript beschrieben werden von der University of Notre Dame Animal Care und Use Committee und sind in Übereinstimmung mit der Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Forschung Vision von der Association for Research in Vision and Ophthalmology genehmigt. 1. Lösungen <ol><li> Bereiten Sie 70% Ethanol, um die Gewebekultur Haube zu sterilisieren und alle Geräte / Reagenzien, die in die Gewebekultur Haube übertragen werden. </li><li> 2 mL 2-Phenoxyethanol auf 1 L des Systems Wasser (1: 500 2-Phenoxyethanol). </li><li> Bereiten 0,1 mM NaHCO 3, pH 8,0. Verwenden einer 10 ml-Spritze und einer 0,2 &amp; mgr; m Porengröße Spritzenfilter die Lösung in eine sterilisierte Gewebekulturhaube zu sterilisieren. HINWEIS: NaHCO 3 verwendet effizient die Zell- und Gewebeklebstoff auf der Deckfläche zu verteilen von fluorodishes (sieheSchritt 3.2). </li><li> Bereiten 1,0 M CaCl 2 und 1,0 M MgCl 2. Sterilisieren mit einer 10 ml-Spritze und 0,2 &amp; mgr; m Porengröße Spritzenfilter in einem sterilisierten Gewebekulturhaube. </li><li> Hank&#39;s ausgewogene Salzlösung (HBSS), fügen Sie sterile CaCl 2 und sterile MgCl 2 bis 1x HBSS ohne Ca 2+ / Mg 2+, ohne Phenolrot bei einer Endkonzentration von 1 mM jeder vorzubereiten. Die Arbeit in einer sterilen Umgebung. </li><li> Um Kulturmedium herzustellen, mischen 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM) ohne Phenolrot, 25% HBSS enthaltend CaCl 2 und MgCl 2 (siehe Abschnitt 1.4), 25% Pferdeserum (HS), 10 Einheiten / ml Penicillin und 10 ug / ml Streptomycin. Die Arbeit in einer sterilen Umgebung. HINWEIS: Vermeiden Medium, das Phenol-Rot, wie es autofluoresces, wodurch Signal-Rausch-Verhältnis zu beeinflussen. 23 </li><li> Bereiten Sie 10 ml 1% niedrigschmelzender Agarose in 1x MEM ohne Phenolrot. Melt Agarose / 1x MEM mit einem microwave. Bereiten kleine Volumina von Agarose (zB 10 ml) als sich wiederholende Nacherwärmung wird lonenkonzentrationen aufgrund von Flüssigkeitsverdampfung verändern. </li><li> Vor der Kultivierung sterilisieren 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen im Autoklaven. </li></ol> 2. Licht-Schaden Paradigm <ol><li> Dark-Anpassung <ol><li> Legen Sie 2 - 3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 Zebrabärbling (oder einer anderen transgenen Zebrafisch von Interesse) mit einem 6 - 14 Monate alt , in einer Umgebung frei von Licht für 14 d. Für weitere Detail Bezug nehmend auf 2, 6, 24, 25. </li></ol></li><li> Positionieren Sie den Tank mit 2 - 3 dunkeladaptierten transgenen Zebrafisch in System Wasser zwischen zwei Leuchtstofflampen , die Licht von 2.800 Lux emittieren 2, 6, 24, 25. </li&gt; <li> Expose Zebrabärblingen konstant intensives Licht für 35 h. Während der Belichtung, sicherzustellen, daß die Wassertemperatur zwischen 31 aufrechterhalten wird - 33 ° C. </li></ol> 3. Vorbereitung für Anzucht (Am Tag der Retinal Isolation) <ol><li> Mit 70% Ethanol, sterilisieren die Gewebekultur Haube und die Komponenten / Werkzeuge, die in die Gewebekultur Haube übertragen werden (zB Flaschen mit MEM und HBSS, Pipetten, sterile Pipettenspitzen, usw.). </li><li> Herstellung von fluorodishes <ol><li> Mantel ein fluorodish für jede Netzhaut mit Zell- und Gewebekleber (siehe Tabelle der Materialien). </li><li> Verdünne die Zell- und Gewebekleber in 0,1 mM NaHCO 3 zu einer Endkonzentration von 70 ug / ml, werden 50 &amp; mgr; l zu jedem fluorodish und verteilt die Lösung in der Mitte der fluorodish mit einer 200 &amp; mgr; l - Pipettenspitze (etwa 1-1,2 cm Durchmesser ). </li><li> Inkubieren der beschichteten fluorodishes mit 1 - 3 h bei RT; (Alternativ O / N bei 4 ° C inkubieren). </li><li> Entfernen Sie die Lösung und spülen Sie 3x mit 500 ul 1x MEM für jede Wäsche. Um zu vermeiden, um die beschichteten fluorodishes vor dem Austrocknen, halten sie in MEM bis retinalen Explantate montiert sind. </li></ol></li><li> Bereiten Kulturmedium, wie in Schritt 1.6 beschrieben. Das Kulturmedium kann für bis zu 1 Woche bei 4 ° C gelagert werden. </li></ol> 4. Isolierung und Kultivierung von Retinal Explantate HINWEIS: Das Protokoll ist unten beschrieben zur Isolierung der dorsalen Netzhaut, die das Netzhautregion, die überwiegend durch die beschriebene Licht-damage Paradigma läsionierten wird. Daher kann eine Beschädigung induzierte Proliferation und das zugehörige Ereignis von interkinetic Atommigration auftreten, in der dorsalen Retina. Netzhautregionen zu erhalten entsprechend den spezifischen Anforderungen der Forscher / Forschungsfrage kann jedoch die Isolierungsverfahren eingestellt werden. <ol><li> Euthanize ein lichtgeschädigter transgenen Zebrafisch einta Zeit in 1: 500 2-Phenoxyethanol. </li><li> Entfernen von einem MEM fluorodish mit einer 1,000 &amp; mgr; l-Pipette, so dass nur ein dünner Film von Flüssigkeit verbleibt. </li><li> Übertragen Sie die Zebrabärbling auf ein trockenes Papiertuch, entfernen Sie das Auge mit einem gebogenen Paar Dumont Zange (Zange # 5, 45 ° Winkel) und übertragen sie auf den fluorodish. </li><li> Mit Hilfe eines Stereomikroskops, richten das Auge mit der Pupille auf dem Deckglas des fluorodish so , dass die Rückseite des Auges mit dem Sehnerv sichtbar ist (Abbildung 1D). </li><li> Mit einem Paar McPherson-Vannas Schere entfernen Sie den Sehnerv, Schneiden nahe an der Rückseite des Auges. Außerdem entfernen Bindegewebe die Außenseite des Auges auskleiden. </li><li> Halten Sie das Auge zwischen den nasalen und temporalen Seite mit einem Paar # 5 Zange , während ein Schnitt an der Optik Stiel zu machen , indem sie mit einem Scherenblatt durch die Lamina cribrosa Lochen und Schneiden entlang sowohl der nasalen und temporalen Seiten des Auges (siehe Abbildung 1E , segmentierte line). </li><li> Die Verwendung von zwei Paaren von # 5 Zange, eine für die dorsale Seite der Netzhaut hält und das andere Paar die ventral von der dorsalen Retina zu trennen, um das Gewebe zu ziehen. HINWEIS: Es ist ratsam, die dorsal Netzhaut zu orientieren, so daß die Linse und die Ganglienzellschicht der Deck Gesicht während der Sklera nach oben zeigt. </li><li> Entfernen Sie die Sklera von der dorsalen Retina mit einem Paar von # 5 Zange, während die Linse hält , die mit einem zweiten Paar von # 5 Zange (Abbildung 1 H, I) an der Netzhaut verbunden ist. </li><li> Um das Objektiv zu entfernen, verwenden McPherson-Vannas Schere und hinter der Linse schneiden , ohne die Netzhaut zu beschädigen (1I, J). Manchmal löst sich die Linse in Schritt 4.7. In diesem Fall entfernen Sie die Sklera vorsichtig mit einer Pinzette durch die Netzhaut an einer Schnittkante mit einem zweiten Paar von # 5 Pinzette. </li><li> Entfernen Sie den Glaskörper, während die Linse zu entfernen, ohne die Netzhaut schädigen. Flatten die Netzhaut mit der Ganglienzellschicht mit Blick auf das Deckglasder fluorodish (Figur 1L, M). </li><li> Surround die Netzhaut mit 10 &amp; mgr; l von 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose und lassen Sie die Agarose erstarren. </li><li> Beobachten Sie, dass die flüssige Agarose nicht die Netzhaut abhebt als auch eine leichte Erhöhung der Fähigkeit beeinträchtigen könnten tief in das Gewebe zu fokussieren. Wenn Hebe beobachtet wird, verwenden Sie eine Pipette Agarose zu entfernen. Lassen Rest Agarose-Set, bevor Sie mehr hinzuzufügen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.12 mehrmals vor dem 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose Zugabe des gesamten fluorodish zu decken. Nach Erstarren der Agarose, 1,5 mL Kulturmedium. </li><li> Pflegen Sie die Netzhaut Explantation Kultur in einem 5% CO 2 / Umgebungsluft bei 32 ° C eingestellt für ca. 12 h die Netzhaut zu ermöglichen , von dem Stress , der durch die Isolationsverfahren entstanden zu erholen. Stellen Sie die Temperatur auf 32 ° C Netzhäuten bei der gleichen Temperatur wie Licht behandelt Zebrabärbling zu halten (siehe Schritt 2.3). </li></ol> 5. Multiphotonen-Mikroskopie Tabelle der Materialien), ein 40X Apo Fernwasser - Tauchziel (NA 1.15), ein Galvanometer - Scanner und eine komplett ausgestattete optimiert Klimakammer, die einen Einsatz für vier 35-mm-Petrischalen enthält. Die Bilder wurden mit einem nichtdescannte Detektor (R-NDD) erworben. <ol><li> Vor der Bildgebung, ins Gleichgewicht der Umweltkammer , die eine 5% CO 2 / Luftatmosphäre zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass leere Petrischalen in die Halterung eingesetzt werden Austritt von Gas in den Raum zu vermeiden. </li><li> Schalten Sie das Mikroskopiesystem. </li><li> Sobald die Klimakammer ins Gleichgewicht gebracht wird, fügen Brechungsindex Flüssigkeit auf die 40X Apo Fernwasser-Tauchziel (NA 1.15). HINWEIS: Der Brechungsindex Flüssigkeit mit optischen Eigenschaften ähnlich wie Wasser verwendet wird während der Langzeitabbildungsverdampfung von Wasser zu vermeiden. </li><li> Platz Grippeorodishes mit Retina-Explantate in die Kammer. Mit Hellfeld Licht, positionieren Sie die Probe in den Lichtweg und bringen den Mittelbereich der dorsalen Retina in der Fokusebene. </li><li> Verwenden GFP epifluoreszenten Licht auf GFAP zu konzentrieren: nGFP -Positive Müller Glia Kerne (2A, C). HINWEIS: Wenn Explantate nicht montiert sind flach oder Agarose unter der Explantation angesammelt hat , wird es schwierig sein , auf die GFAP zu konzentrieren: nGFP -positiver Kerne oder sie werden schwach fluoreszieren. <ol><li> Überprüfen Sie, ob innerhalb der gleichen Netzhaut Explantation zu einem anderen Bereich bewegt, wird die Fokussierung Problem überwinden. bewegen Andernfalls zu einem anderen Netzhaut Explantation. </li></ol></li><li> In der Bildaufnahme-Software, öffnen Sie die &quot;A1 MP GUI &#39;, die&#39; TiPad &#39;, die&#39; A1 Compact GUI&quot; und der &quot;ND Erwerb &#39;Fenster. Für Multi Bildgebung, sicherzustellen, dass die &quot;IR NDD &#39;Option im&#39; A1 Compact GUI &#39;gewählt wird. </li><li> In der &quot;setting &#39;Feld wählen IR-DM für die 1 dichroitischen Spiegel st und wählen Sie das Bandpassfilter 525/50 GFP - Fluoreszenz zu erwerben. </li><li> Schalten Sie den IR-Laser im Fenster mit der Bezeichnung &quot;A1MP GUI&quot;. Es dauert ein paar Minuten dauern, bis der Laser bereit zu sein. Stellen Sie die Wellenlänge auf 910 nm GFP-Fluoreszenz zu erregen und den Laser auszurichten, indem die &#39;Auto Ausrichtung &quot;Taste in der&quot; A1 MP GUI&#39; Fenster klicken. </li><li> Stellen Sie sicher, dass Raum und Ausrüstung Lichter ausgeschaltet sind oder abgedeckt, bevor Sie den Auslöser in der &quot;A1 MP GUI &#39;Öffnen Überbelichtung des Photovervielfacherröhre zu vermeiden. Um den Lärmpegel, beherbergen das Mikroskop in abgedunkelter Umgebung zu reduzieren. </li><li> Erwerben Bilder von einem Sichtfeld von 300 x 300 Pixel, bei einem Zoom von zwei und einer Pixel Verweilzeit von 4,8 &amp; mgr; s / Pixel. Etwa die Laserleistung Fenster durch Änderung der &quot;Erwerb Bereich&quot; in der &quot;A1MP GUI&quot; und die Verstärkung in der &#39;A1 Compact GUI&#39; eingerichtet. </li><li> Einrichten des Z-Stapel <ol><li> Konzentrieren Sie sich auf das Ganglion Zellschicht der oberen Brennebene des Z-Stapel zu setzen in der &#39;Z&#39;-Subwindow innerhalb des &quot;ND Erwerb&#39; Fenster. Einige GFAP: nGFP -positiven Zellen werden typischerweise in der Ganglienzellschicht befindet, welche die basale Grenze der Netzhaut (2A, D) zu identifizieren hilft. </li><li> Bewegen , um die Fokusebene durch die Ebene der ONL (2A, B), die durch die Gegenwart von schwach markierten GFAP gekennzeichnet ist: nGFP -positiven Zellen , die rund sind und vergrößert relativ zu ihren Gegenstücken in der INL (2A, C) . </li><li> Setzen Sie diese Ebene wie die Unterseite des z-Stack. Sicherzustellen , dass der gesamte ONL wird abgebildet (2A, B). </li><li> Wenn Fokusebene Verschiebungen auftreten, die erfordern, während der Abbildungsperiode neu eingestellt wird, doppelklicken Sie auf die mittlere Position in der &#39;z&#39; Subwindow es als die &quot;Heimat&quot; Position zuzuweisen. Wechseln Sie in &quot;symmetrischen Modus definiert &#39;und klicken Sie auf &quot;relative&quot;. </li><li> Stellen Sie die z-Schrittweite zwischen 0,7 bis 1 um. </li></ol></li><li> Z-Intensität Korrektur: <ol><li> Wenden Sie z-Intensität Korrekturen für den Verlust der Pixelintensität zu kompensieren aufgrund der Lichtstreuung bei der Abbildung in den tiefen Schichten des Gewebes. </li><li> So stellen Sie die Korrektur nach oben, öffnen Sie die &quot;z-Intensitätskorrektur &#39;Fenster. So stellen Sie die &#39;z-Stack-Bereich &quot;, wählen Sie&quot; Aus ND&#39;. </li><li> Klicken Sie auf den unteren Brennebene in der &quot;z-Intensitätskorrektur &#39;Fenster (in diesem Fall entspricht der Ganglion-Zellschicht) und stellen Sie die Laserintensität (&quot; Erwerb Bereich &quot;in der&quot; A1MP GUI) und die Verstärkung (A1 Compact GUI ). </li><li> Klicken Sie auf den Pfeil neben den &#39;z-Werte &quot;in der&quot; z-Intensitätskorrektur&#39; Fenster, um die Einstellungen zu bestätigen, die später unter dem Posten &quot;Geräteeinstellungen&quot; in der &quot;z-Intensitätskorrektur&quot; Fenster für die gewählte Brennebene sind. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für die Mitte einnd oberen Ebenen, die Erhöhung der Laserleistung und der Verstärkung. Weitere Fokusebenen können bei Bedarf hinzugefügt werden. Siehe Tabelle 1 für bestimmte Laser und Verstärkungseinstellungen für Experimente in den Figuren 2 bis 4. </li><li> Stellen Sie den &quot;Erwerb Bereich&quot; in der &quot;A1 MP GUI &#39;Fenster. Vermeiden einen Erfassungsbereich größer als 15 und einen Verstärkungsfaktor höher als 126 zu Beginn der Bildgebungs Auswahl zu umgehen Photobleaching und eine erhöhte Geräuschentwicklung. HINWEIS: Laser und Photomultiplier-Röhren unterscheiden zwischen Mikroskopiesysteme, Test Laser und Verstärkungseinstellungen optimale Abbildungsbedingungen für das Mikroskop, während Photobleichens Vermeidung einrichten zu erhalten. </li><li> Wählen Sie &quot;relative Intensitätskorrektur&quot; in der &quot;z-Intensitätskorrektur &#39;Fenster. </li></ol></li><li> In der &quot;Zeitreihen&quot; Subwindow im Fenster &quot;ND Erwerb&quot;, stellen Sie die Dauer bis 8 h und das Intervall auf &quot;ohne Verzögerung&quot;. Dann stellen Sie sicher, dass die &quot;Run z-Korrektur&quot; in t zu klickener &#39;z-Stapel &quot;Unterfenster im&quot; ND Erwerb &quot;Fenster, um die 3-D-Zeitreihen zu erwerben. </li><li> Pflegen retinalen Explantate bei einer Temperatur von 27 - 29 ° C während der gesamten Dauer der Bildaufnahme. </li><li> Während des gesamten Bildaufnahmeperiode, falls erforderlich, neu einzustellen, den Leistungspegel und Verstärkung, um die Bildqualität für die Post-Imaging-Analyse zu erhalten. Für Anpassungen führen Sie die Schritte 5.11.2 - 5.11.4. </li><li> Wenn die Fokusebene verschiebt, Pause oder den Lauf zu stoppen und Schritt 5.11 erneut durchführen. HINWEIS: Wenn &quot;relative z-Korrektur&quot; in 5.12.7 Schritt gewählt wurde und Schritt 5.11.4 war es nicht notwendig, durchgeführt sollte Macht und Gewinn Ebenen, es sei denn, umfangreiche Photobleichens aufgetreten neu zu justieren. </li></ol> 6. Analyse der Geschwindigkeit <ol><li> Extrahieren Sie die Zeit, eine &quot;Region of Interest&quot; auf der Bildeinstellung. Verwenden Sie die &quot;Zeitmessung&quot; Werkzeug und exportieren Sie die Zeitwerte in eine Tabelle. </li><li> Crop eine Region, die eine di enthältViding GFAP: nGFP -positiver Kern. </li><li> Wählen die beschnittene Bereich, so dass sie mindestens einen Kern enthält, der nicht INM erfährt, um einen Referenzpunkt zu setzen, um anschließend die Abstände zu messen, die die Trennkern in Bezug auf die basale INL migriert. HINWEIS: einen Kern zu wählen, die in der basalen INL bleibt, hilft es, ein 3-D-Rekonstruktion der Zeitreihe vorzubereiten. </li><li> Alternativ kann , wenn ein GFAP: nGFP -positiver Zelle in der ONL im gesamten Erfassungszeitraum beobachtet wird, eine vertikale Linie mit fester Länge aus dem ONL Kern zu den basalen INL Spanning verwenden , um einen Bezugspunkt zu identifizieren. </li><li> Mit der Funktion &#39;show Scheiben Ansicht&#39;, erzeugen orthogonalen Projektionen. Anschließend ändern Sie den Modus von &quot;Scheibe&quot; auf &quot;Maximum Intensity Projection &#39;. </li><li> Drehen Sie den &#39;xy&#39; Ansicht der orthogonalen maximalen Projektion. Je nach Ausrichtung, bei der die wandernde / Dividieren Kern ist am besten sichtbar ist, einelso ausschalten entweder die &#39;xz&#39;- oder die &quot;yz&#39;-Ansicht. </li><li> Klicken Sie auf das restliche Bild mit der rechten Maustaste und extrahieren Sie die &#39;xz&#39; oder &#39;yz&#39;-Bild-Serie mit dem &quot;Neues Dokument erstellen aus dieser Sicht&#39; Funktion. Falls erforderlich, wird das Bild gedreht. </li><li> Mit Hilfe der &quot;manuellen Messung&quot; Funktion, ziehen Sie eine horizontale Linie quer über das Bild auf der untersten Ebene des Kerns , die in den basalen INL bleibt und unterliegen nicht INM (= Bezugspunkt; 4A - E, Linie rot horizontal). </li><li> Messen Sie den Abstand zwischen der Bezugslinie und der basalen Punkt des migrierenden Nukleus für die Zeitreihen der &quot;Line - Messung&quot; Werkzeug in der Analyse - Software (siehe Abbildung 4A - E). </li><li> Sobald die Kernhülle bricht, messen Sie die basale Stellung des Somas, wenn es nach der Diffusion von GFP in der gesamten Zelle identifizierbar ist. </li><li> ein Tabellenkalkulations-Software verwenden, zeichnen den Abstand a nuCleus migriert gegen die Zeit vergangen (4F). <ol><li> Zur Bestimmung der apikal Wanderungsgeschwindigkeit (v a), Graph die Abstände für die Zeit vor der Kernhülle Zusammenbruch gereist auftritt (4G). </li><li> Wählen Sie die Datenreihe im Diagramm mit der rechten Maustaste klicken und legen Sie eine lineare Regressionskurve einschließlich der &#39;y = mx + c&#39; entsprechende Funktion. Die Steigung &#39;m&#39; in der Funktion steht für die Geschwindigkeit v a (4G). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6.11.1 und 6.11.2 für die erste Phase der schnellen Migration basalen die basale Migrationsgeschwindigkeit, v b (4H) zu bestimmen. </li></ol></li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+adult+rat+retinal+explant+model+for+screening+of+potential+retinal+ganglion+cell+neuroprotective+therapies.">Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).</li><li>Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+retinal+whole+mounts.">In vitro imaging of retinal whole mounts.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li><li>Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Retinal+Ganglion+Cell+Dendritic+Field+Degeneration+Imaged+in+Organotypic+Retinal+Explant+Culture.">Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).</li><li>Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blue+light+on+photoreceptors+in+a+live+retinal+explant+system.">Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system.</a> Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).</li><li>Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+processes+by+long-term+live+imaging--historic+problems+and+current+solutions.">Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions.</a> J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).</li><li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish.">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).</li><li>Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repressing+notch+signaling+and+expressing+TNFalpha+are+sufficient+to+mimic+retinal+regeneration+by+inducing+Muller+glial+proliferation+to+generate+committed+progenitor+cells.">Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells.</a> J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).</li><li>Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3+defines+three+populations+of+Muller+glia+and+is+required+for+initiating+maximal+muller+glia+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+retina.">Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina.</a> J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).</li><li>Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Muller+glial+dependent+neuronal+regeneration+in+the+damaged+adult+zebrafish+retina.">Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).</li><li>Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+IL-6+family+cytokines+synergize+to+stimulate+Muller+glia+reprogramming+and+retina+regeneration.">Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration.</a> Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).</li><li>Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+is+necessary+and+sufficient+for+Muller+glia+dedifferentiation+and+retina+regeneration.">HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration.</a> Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).</li><li>Lenkowski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+regeneration+in+adult+zebrafish+requires+regulation+of+TGFbeta+signaling.">Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling.</a> Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).</li><li>Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+position+and+morphology+of+committed+precursor+cells+in+the+zebrafish+retina+adapt+to+architectural+changes+upon+tissue+maturation.">Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation.</a> Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).</li><li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitor+of+phagocytosis,+O-phospho-L-serine,+suppresses+Muller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina.">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).</li><li>Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+dynamic+imaging+of+retinal+microglia+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+living+photoreceptors+contributes+to+inherited+retinal+degeneration.">Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration.</a> EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).</li><li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo.">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li><li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord.">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Studien , die Mechanismen zu untersuchen Leitungs Regeneration des geschädigten erwachsenen Zebrabärbling Retina überwiegend eingesetzten immunzytochemische Methoden 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Festlegung der Bedingungen, die mit Retina-Explantate Kultur und Live-Cell-Imaging auf Phänome...

Im Gegensatz zu Menschen, Zebrabärbling (Danio rerio) zeigen eine robuste Regeneration Reaktion auf den Zelltod von retinalen Neuronen 1, 2, 3, 4. Tumor - Nekrose - Faktor α, ein Signalmolekül , das aus sterbenden retinalen Neuronen freigesetzt wird , induziert Müller Glia in der Basalschicht Inner Nuclear Wohnsitz (INL) der Netzhaut 5 zu proliferieren und neuronaler Vorläuferzellen erzeugen , die vor Differenzierung in die neuronale Zelle zur Proliferation fortzusetzen Typen , die 2 starben, 3, 4. Während der Proliferationsphase der Regenerierungsreaktion, die Kerne von Müller Glia und deren abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen durchlaufen eine sich wiederholende Migrationsmuster in Phase mit dem Zellzyklus (Interkinetic Nuclear Migration, INM) 6 </sup<html> &gt; 7. Nuclei positioniert in der basalen INL replizieren ihre DNA vor zu den Äußeren Kernschicht Migration (ONL), wo sie sich teilen, bevor die entstehenden Kerne basal zum INL zurückzukehren. Dieser Prozess wurde erstmals während neuroepithelial Entwicklung mit histologischen Methoden beschrieben, während Live-Cell - Imaging Ansätze bestätigt später die Interpretation von Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Beide histochemische und Live-Cell - Imaging Ansätze verwendet wurden Mechanismen zur Bestimmung zugrunde liegenden INM und seine Funktion bei der Entwicklung von Neuroepithels einschließlich der Netzhaut 9, 11, 12, 13. Jedoch haben die Mechanismen INM im erwachsenen Retina Regenerieren nicht sehr detailliert untersucht wordenxref &quot;&gt; 6, 7. Live-Cell - Imaging wird eine unschätzbare Ansatz sein , unsere Kenntnisse über die Signalwege zu fördern , die INM im erwachsenen regenerierende Retina steuern. Bis vor kurzem wurde der Abbildung lebender Zellen von INM in der Retina beschränkt auf entweder live Genaktivität oder Hühnerembryonen oder postnatale Maus retinalen Explantate 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Während der Netzhaut Explantate von erwachsenen Tieren aus einer Vielzahl von Arten , einschließlich Maus, Ratte und Zebrabärbling haben für verschiedene zellbiologische Ansätze 17, 18, 19, 20, Live-Cell - Imaging Experimente mit retinalen Explantate ha genutzt wordenve beschränkt Zeiträume zu kurz und nicht kontinuierlich über mehrere Stunden 21 ausgeführt worden ist , 22. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Kultur lichtgeschädigter erwachsenen Zebrafisch Retina Abbildung lebender Zellen Experimente Überwachung INM mit Multi-Photonen - Mikroskopie 6 durchzuführen. Live - Cell - Imaging-Ansätze sind vorteilhaft gegenüber immunhistochemischen Methoden , wenn die Mechanismen zu untersuchen INM Controlling, wie die Dynamik des INM, zum Beispiel Geschwindigkeiten betroffen sein könnten , anstatt die Lage der Mitose, die würde möglicherweise nicht mit Immunzytochemie nachgewiesen werden. In der Zukunft hat dieses Verfahren auch das Potential geändert werden zu studieren andere dynamische Vorgänge bei Netzhautregeneration, wie Phagozytose von Photorezeptoren durch Müller Glia oder das Verhalten von Mikroglia sterben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="876">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:491px;">Dumont forceps size #5</td>
			<td style="width:201px;">World precision instruments</td>
			<td align="right" style="width:113px;">14098</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps size #5, 45&#176; angle</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td align="right">14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McPherson-Vannas scissors</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td align="right">501233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluordishes</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>SMZ-1B</td>
			<td>similar type of dissection stereomicroscope will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biological Safety Cabinet class type A2</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>equivalent type will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tissue culture incubator</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>HEPA-class 100</td>
			<td>equivalent type will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO</td>
			<td>Bulbtronics</td>
			<td align="right">31850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m pore-size Acrodisc syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">4192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml Luer-lok syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml Luer-lok syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaHCO3</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td align="right">5980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM w/o phenol red, Gibco</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>5100-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse serum, heat-inactivated</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>26050-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16777-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ethanol, absolute</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-phenoxyethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">77699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refractive index liquid&#160;</td>
			<td>Cargille Lab</td>
			<td>1803Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>equivalent system will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>equivalent system will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS analysis software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of adult transgenic zebrafish retinal explants for live-cell imaging by multiphoton microscopy

Ein endogenes Regenerationsprogramm wird von Müller Glia im erwachsenen Zebrafisch (Danio rerio) Retina folgende neuronaler Schädigung und Tod eingeleitet. Die Müller Gliazellen wieder in den Zellzyklus und neuronale Vorläuferzellen erzeugen, die den folgenden Runden von Zellteilungen durchlaufen und in die verlorene neuronalen Zelltypen differenzieren. Sowohl Müller Glia und neuronaler Vorläuferzellkernen replizieren ihre DNA und durchlaufen die Mitose in bestimmten Orten der Netzhaut, also wandern sie zwischen dem basalen Inner Kernschicht (INL) und der äußeren Körnerschicht (ONL) verbunden sind, in einem Verfahren , wie Interkinetic beschrieben Nuclear Migration (INM). INM hat überwiegend in der Entwicklung von Netzhaut untersucht worden. Um die Dynamik von INM im erwachsenen Regenerieren Zebrabärbling Retina im Detail, Live-Cell-Imaging von fluoreszenzmarkierten Müller Glia / neuronale Vorläuferzellen zu untersuchen ist nicht erforderlich. Hier stellen wir die Bedingungen zu isolieren und Kultur dorsalen Retinaevon Tg [GFAP: nGFP] mi2004 Zebrabärbling , die für 35 h konstant starkem Licht ausgesetzt waren. Wir zeigen auch , dass diese Netzhautkulturen sind tragfähige Lebendzell - Imaging - Experimente durchführen, kontinuierlich z-Stapel - Bildern über die Dicke der retinalen Explantation für bis zu 8 h unter Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie zu überwachen das Zugverhalten von GFAP Erwerb: nGFP -positiven Zellen . Darüber hinaus beschreiben wir die Details post-Bildanalyse auszuführen, um die Geschwindigkeit der apikalen und basalen INM zu bestimmen. Zusammengefasst haben wir Bedingungen, die Dynamik von INM in einem Erwachsenen-Modell der neuronalen Regeneration zu untersuchen. Das wird unser Verständnis dieser entscheidenden zellulären Prozess voranbringen und es uns ermöglichen, die Mechanismen zu bestimmen, die INM steuern.

Die Isolierung der Netzhaut nach dem Verfahren in der schematischen Darstellung in Figur 1 skizziert ermöglicht die Kultivierung eines abgeflachten dorsal Retina von lichtgeschädigter adult Tg [GFAP: nGFP] mi2004 Zebrabärbling über einen Zeitraum von mindestens 24 h in einer 5% CO 2 / Luft - Umgebung. Diese flachen montierten retinalen Explantate können Bildbrennebenen bei tiefen Gewebespiegel verwendet werden. Ein Beispiel ist Müller...

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Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

culture-adult-transgenic-zebrafish-retinal-explants-for-live-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K Aufrufe.  University of Notre Dame.  Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen. 

Serie: Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental manipulations in ovo/in vivo makes the chicken embryonic retina a versatile and very efficient experimental model. Although the chicken retina is easy to target in ovo by intraocular injections or electroporation, the effective and exact concentration of the reagents within the retina may be difficult to fully control. This may be due to variations of the exact injection site, leakage from the eye or uneven diffusion of the substances. Furthermore, the frequency of malformations and mortality after invasive manipulations such as electroporation is rather high.
This protocol describes an ex ovo technique for culturing whole retinal explants from chicken embryos and provides a method for controlled exposure of the retina to reagents. The protocol describes how to dissect, experimentally manipulate, and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explants can be cultured for approximately 24 hr and be subjected to different manipulations such as electroporation. The major advantages are that the experiment is not dependent on the survival of the embryo and that the concentration of the introduced reagent can be varied and controlled in order to determine and optimize the effective concentration. Furthermore, the technique is rapid, cheap and together with its high experimental success rate, it ensures reproducible results. It should be emphasized that it serves as an excellent complement to experiments performed in ovo.

This protocol describes a method to dissect, experimentally manipulate and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explant cultures are useful when high success rate, efficacy and reproducibility are needed to test the effects of plasmids for electroporation and/or reagent substances, i.e., enzymatic inhibitors.

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from the whole brain or from either the telencephalic, tectal or cerebellar regions of the adult zebrafish brain. Additionally, we describe the procedure to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres.

Isolierung und Kultur von Adult Zebrafisch brain-derived Neurosphären

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...