Bu çalışma Doğa Bilimleri ve (MP NSERC, 401848-2011) Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir. MP Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) bir kariyer ödülünü aldı. LE FRQ-S (FRQ-S 14D 29441) bir doktora burs alıcı oldu. Biz teknik yardım için Marie-Josée Wallman teşekkür ederim.

Etik Beyanı: hayvanların yer aldığı tüm protokoller Comité de Koruma des Animaux de l&#39;Université Laval tarafından onaylandı ve Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı (Ed 2.) Hayvan Bakımı Kılavuzu Kanada Konseyi çerçevesinde yapılmıştır. Burada açıklanan protokol yaklaşık 800 g yetişkin hayvanlar için optimize edildi. sabitleştirici hacimleri hayvanın büyüklüğüne göre ayarlanmalıdır. Transkardiyak perfüzyon için Çözümler hazırlanması 1. <ol><li> aşağıdaki aşamalara göre bir 50 mM sodyum fosfat-tamponlu salin (PBS) çözeltisi 1 L&#39;lik hazırlayın. perfüzyon önce en çok 24 saattir çözeltisi hazırlayın ve kullanılana kadar 4 ° C &#39;de devam edin. <ol><li> 1 L&#39;lik bir şişeye damıtılmış suyun 800 mL ölçün. Dibazik susuz sodyum fosfat 5.87 g ekleme (Na2 HPO 4), monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 1.20 g (NaH2 4 · H2O) ve 9 grsodyum klorür (NaCI). çözülmeye karıştırınız. </li><li> 5 N NaOH eklenerek pH 7.4&#39;e ayarlanmıştır. 1 L&#39;lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle DİKKAT: NaOH aşındırıcı kimyasal bileşiktir. Uygun Kişisel Koruyucu Ekipman Wear (PPE;. Laboratuvar mont, eldiven, koruyucu gözlük, vs). </li></ol></li><li> aşağıdaki adımlara uygun olarak% 4 paraformaldehit (PFA) 2 L hazırlayın. Bu çözelti, ameliyattan önce en fazla 24 saat hazırlandı ve kullanılana kadar 4 ° C &#39;de tutulması gerekmektedir. <ol><li> 2 L&#39;lik bir kap içerisinde damıtılmış su, 1.5 L ölçülür. Dibazik susuz sodyum fosfat 23.48 g (Na2 HPO 4) ve monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 4.80 g ekleme (NaH2 4 · H2O). çözülmeye karıştırınız. 2 L&#39;lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle </li><li> 55 ° C - sıcaklık yaklaşık 45 ulaşıncaya kadar bir havalandırma başlık altında çözelti ısıtılır. 60 ° C&#39;ye kadar ısıtın vermeyin. </li><li>Yavaş yavaş çözeltiye PFA 80 g ekleyin ve tümüyle çözülene kadar karıştırın (yaklaşık 30-60 dakika). 60 ° C&#39;nin altında tutmaya sıcaklığının kontrolü tutun. DİKKAT: PFA olarak toz formunda çok uçucudur. Gözler veya deri ile teması halinde çok zehirlidir ve solunum veya sindirim durumunda tehlikelidir. PPE Aşınma ve bir havalandırma başlık altında dikkatli bir şekilde kullanın. </li><li> 4 ° C ve filtreye çözeltiyi soğutun. 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> aşağıdaki adımlara uygun olarak 0.1 M fosfat tampon (PB) içinde% 3 akrolein 1 L hazırlayın. PB solüsyon, perfüzyon en fazla 24 saat hazırlanmalıdır. DİKKAT: Acrolein teneffüs ve acil hasar meydana getirebilmektedir son derece toksiktir. Eğer deri yoluyla absorbe Ayrıca aşındırıcı ve son derece toksiktir. Bu kanserojen ve mutajen olduğunu. Uygun PPE giyin ve bir havalandırma başlık altında kullanın. <ol><li> damıtılmış suyun 800 mL ölçün. Dibazik susuz sodyum fosfat 8.66 g ekleme (Na2 </alt&gt; HPO 4) ve monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 5.38 g (NaH2 4 · H2O). Bütün tuzlar eriyene kadar karıştırın. 4 ° C&#39;de çözüm tutun 1 L&#39;lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle. </li><li> Ameliyat öncesi 1 L&#39;lik bir cam kaba PB çözeltisinden 900 mL kadar transferi ve bir havalandırma başlık altında% 97 akrolein çözeltisi 30.94 ml. 1 L ilave edin ve karıştırın toplam hacme ulaşmak için PB solüsyonu ekleyin. çözüm Filtre ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li></ol> 2. transcardiac Perfüzyon ve Beyin Diseksiyon <ol><li> bütün cerrahi prosedür sırasında buz üzerinde çözüm tutun. (50 mM PBS) ve bir hava hortumu kalana kadar pompayı dönüm kullanılacak ilk çözelti içinde tüp yerleştirilmesi pompayı hazırlayın. bir makak maymunu transkardiyak perfüzyon için, bir 21 G iğne kullanımı ve çıkış yaklaşık 80 mL / dak ayarlayın. </li><li> bir karışımı içeren bir intramüsküler enjeksiyon ile anestezi hayvanketamin (20 mg / kg), ksilazin (4 mg / kg) ve asepromazin (/ kg, 0.5 mg) Ture. izofluran (% 3) sedasyon altında hayvan bakımı. </li><li> Bir havalandırma masaya hayvanın uzuvları takın. </li><li> bir neşter ile, koltukaltı cilt kadar kaldırın. Karın kasları kesin. dikkatle hayati organlara kaçınarak yanal kaburga kesmek için ağır cerrahi makas kullanın. </li><li> Cerrahi makas ile diyafram kesip kalp açığa çıkarmak için göğüs kafesi yükseltmek. diyafram kesildiğinde kalp dakika içinde dayak durdurulmayacağından, hızla devam edin. </li><li> Bir neşter bıçağı ile perikard çıkarın ve sol ventrikül içine iğne takın. bir neşter ile, dikkatlice sağ atriyuma küçük eksizyonu olun. Hızlı bir şekilde 72 ml / dakika pompayı çalıştırmak ve iğneyi yerinde tutun. Mümkünse, kalp daha düşük düzeyde başını sahip olmak için hayvan yatırın. NOT: İğneyi eklerken interventriküler septumu delmek için dikkatli olun. <ol><li> rinsakciğer kadar PBS yaklaşık 300 mL &#39;si ile, e Kan, beyaz ve kan sağ atriyum gelir. </li></ol></li><li> hızlı, pompa durdurma% 3 akrolein çözeltisine hortumu / tüp transferi ve tekrar pompayı çalıştırın. Kalp atışını durduktan sonra yavaş yavaş 80 ml / dk pompalama hızını artırmak. akrolein çözeltisi yaklaşık 500 ml serpmek. </li><li> hızlı, pompayı durdurun% 4 PFA çözüm hortumu aktarmak ve tekrar pompayı başlatın. Bu adım, PFA, yaklaşık 1 L gerektirir. NOT: ön ayaklar bükülmezdir ve boyun sert olduğu zaman tespit tamamlanır. </li><li> kafasını kesip dikkatlice kafatasının dışında beyin teşrih. cerrahi aletlerle beyin zarar vermemeye özen gösterin. Beyin, uçuk (kan eser) ve katı (Şekil 1A) olduğu zaman perfüzyon en uygunudur. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 saat süresince% 4 PFA içinde sağlam beyin bırakın. </li><li> Seri olarak bir soğutma vibratome (4 ° C) ile beyin kesilmişve 50 um kalınlıkta bölümler halinde istenilen düzlemde PBS (0.1 M) (Şekil 1B) bunları toplamak. NOT: Bu adım, istenen protokole göre birçok yönden yapılabilir. Yarıküreleri kesme, ya da muhafaza bütün vibratome önce ayrılabilir. Beyin vibratome platformu için çok büyükse, daha küçük bloklar halinde kesilebilir. Bu aşamadan sonra, bölümler% 40 PB (50 mM),% 30 gliserol ve% 30 etilen glikol yapılmış bir antifriz solüsyonu içinde -30 ° C de, uzun bir süre boyunca saklanabilir. </li></ol> 3. İmünohistokimya Ön gömme (Şekil 1C) <ol><li> aşağıdaki gibi Tris-tamponlu salin içinde bir 4 L&#39;lik bir stok çözeltisi (TBS, 50 mM, pH 7.6) hazırlayın. <ol><li> , 4 L&#39;lik bir beher içinde damıtılmış su 2L ölçün trihidroksimetil aminometan ve 24.23 g ekleyin (THAM C 4H 11 NO 3) ve bir karıştırma çözülmesi için. </li><li> 1 N HCI, yaklaşık 148 mL &#39;si ile 7.6 arasında pH ayarlayın. asit cauti ile eklenmelidirile 7.6 altındaki bir pH değerine ulaşılana önlemek için. Toplam hacim olmalıdır 4 L DİKKAT: HCl aşındırıcı etkisi. Uygun PPE giyin. </li></ol></li><li> ilgi alanı ihtiva eden (aşama 2.11) bölümleri seçin EM imünohistokimya için işlenecek. </li><li> antifriz solüsyonu durulama, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde serbest yüzen bölümler 3x (0.1 M, pH 7.4) yıkanır. </li><li> PBS içinde seyreltilmiş NaBH4 bir% 0.5 çözelti hazırlayın. <ol><li> NaBH4 0.05 g tartın ve 10 ml PBS içinde seyreltin. Kapatma. Kullanımdan hemen önce bu çözelti hazırlayın. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika için taze hazırlanmış NaBH4 çözeltisi bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın. Kapatma. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle PBS içinde yıkama 3x, reaksiyon gazının hiçbiri kadar kuvvetli bir şekilde sallanan kalır. </li><li> % 2 göre normal serum ve PBS içinde sulandırılmış% 0.5 soğuk balık jelatininin EM için bloke edici bir çözelti hazırlayın. NOT: Miktar shouliçin hesaplanır d Aşağıdaki üç adım için yeterli olması. ikincil antikor barındıran aynı hayvan türlerinden oluşan bir serum kullanın. bu yöntemler, önemli ölçüde doku kalitesini tehlikeye antijen alma yöntemleri ya da Triton az miktarda ilave kullanımını önlemek, (antikorlar penetrasyonunu artırmak için). </li><li> Oda sıcaklığında 1 st için bloke edici çözelti içinde bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın. </li><li> bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş primer antikor çözeltisi hazırlayın. Not: Primer antikor konsantrasyonu, genel olarak LM immünohistokimya ile aynıdır, ancak bazı birincil antikorlar akrolein çalışmayabilir olarak, daha önce farklı bir antikor konsantrasyonları ile testler düşünün. (-% 2 0.1) ve transkardiyak perfüzyon için% 4 PFA ve benzer sonuçlar elde Eğer öyleyse, o glutaraldehit bir karışımını kullanmak da mümkündür. inkübasyon süresinin ve sıcaklığın yanı sıra duruma getirin. </li><li> Primer antikor solüsyonu içinde bölümleri inkübegece boyunca hafifçe çalkalanarak ilave edilir. önceden test edilmiş inkübasyon süresi ve sıcaklığı kullanın. </li><li> hafif sallama ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde bölümleri 3 kez yıkanır. </li><li> bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş biyotinlenmiş sekonder antikor 1000 çözeltisi: Bir 1 hazırlayın. NOT: ikincil antikor birincil bir antikor üretmek için kullanılan konakçı türlerine karşı yükseltilmelidir. </li><li> Oda sıcaklığında 1.5 saat için ikincil antikor çözeltisinin bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın. </li><li> en az 60 dakika önce ikincil antikor inkübasyonun sonunda bir avidin-biyotin-peroksidaz (ABC) çözeltisi hazırlayın. <ol><li> A ve B solüsyonlarının 8.80 uL / ​​mL ölçmek ve PBS içinde seyreltilmesi, kalibre edilmiş bir pipet kullanın. </li><li> avidin ve biyotin molekülleri arasındaki bağlanma tamamlaması izin vermek için oda sıcaklığında en az 60 dakika boyunca hafif sallayın. </li></ol></li><li> İkincil antikor çözeltisi içinde inkübe edildikten sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde 3 kez yıkanır. </li><li> böylece ABC bölümleri inkübeOda sıcaklığında 1 saat boyunca Devriminin. hafifçe sallayın. </li><li> hafif sallama ile oda sıcaklığında 10 dakika süre ile TBS içinde bir kez PBS ile iki kez yıkanır. </li><li> TBS içinde seyreltilmiş% 0.005 H2O 2% 0.05 3,3&#39;-diaminobenzidin (DAB), taze bir çözelti hazırlayın. <ol><li> DAB 12.5 mg tartılır ve soğuk TBS 25 mL seyreltik. Işıktan koruyunuz. DİKKAT: Solunması DAB tozu çok uçucu ve zararlıdır. Bu karsinojenik ve teratojenik olduğunu. seyreltilmiş Dolayısıyla, hamile veya emziren kadınlar bile, bu ürünü manipüle olmamalıdır. işlenirken bir N95 maskesi kullanın ve PPE giyerler. </li><li> Çözelti süzülür ve kullanımdan hemen önce,% 30 H2O 2 4.5 uL ekleyin. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika ila 7 DAB çözeltisi bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın. NOT: kahverengi çökelti arka plan boyama yüksek düzeyde önlemek için çok karanlık olmamalıdır. İnkübasyon süresi buna göre optimize edilmelidir. </li><li> hızla iki kez yıkayarak reaksiyonu durdurunSoğuk TBS içinde, daha sonra iki kez oda sıcaklığında, soğuk TBS içinde 10 dakika kadar hafif bir sallama ile PB iki kez 10 dakika, ardından. Not: PB (olup PBS) kullanımı, osmiyum ve form kristalleri ile tepkimeye gibi, NaCI izlerini ortadan kaldırmak için kritiktir. </li></ol> Elektron Mikroskobik Gözlem 4. Osmification ve katıştırma <ol><li> PB içerisinde seyreltilmiş,% 1 ozmiyum tetroksit çözeltisi (OsO 4) hazırlanması. Işıktan koruyunuz. DİKKAT: Osmiyum çok zehirlidir ve deri, gözler ve ağız ile temas etmemelidir ve teneffüs edilmemelidir. Şayet yutulursa ölüme neden olabilir. Sadece bir havalandırma başlık altında ve uygun KKD ile kullanılmalıdır. </li><li> (Çalkalama olmaksızın) havalandırma başlık altında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca OsO 4 çözelti içinde bölümleri inkübe ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kapak. Tamamen OsO 4 çözümü eklemeden önce bölümleri dümdüz. NOT: bölümler çok karanlık ve ri halinegid ve bu adımda aşağıdaki dikkatle manipüle edilmelidir. </li><li> osmification sırasında su geçirmez bir epoksi reçinesi hazırlayın. <ol><li> büyük bir plastik bardağa epoksi reçine karışımı (epoksi reçinesi 20 g, sertleştirici 20 g, hızlandırıcı 0.6 g ve plastikleştirici 0.4 g) her bir bileşenin uygun miktarlarını ekleyin. homojen kahverengi bir renk elde edilene kadar ağaç dalını ya da plastik bir pipet ile karıştırılır. NOT: Her bileşenin kesin oranını kullanmak için kritik öneme sahiptir. </li><li> Uygun boyutlarda alüminyum bardak eşit miktarlarda transfer, bölümlerin sayısına bağlı olarak işlenecek. o dinlenmeye bırakın. </li></ol></li><li> osmificated bölümler düşük hızlı sallanarak, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PB 3 kez yıkanır. </li><li> 2 dakika her biri için derecelendirilmiştir etanol aşağıdaki dizi bölümleri kurutmak:% 35 etanol içinde 2 kez; 1 saat 50 içinde, her biri 70, 80, 90, ve% 95 etanol; ve% 100 etanol içinde 3 kat. </li><li> dehydrati tamamlamak için cam şişe için bölümleri aktarınpropilen oksit içinde 2 dakika boyunca bölümlerini 3 kez inkübe edilerek süreci. DİKKAT: Propilen oksit çok uçucu ve toksik organik çözücüdür. Bu temas etmesi halinde veya solunması veya yutulması gözlere veya deride ciddi hasara neden olabilir. Bu bir sınıf 2 kanserojen madde olarak sınıflandırılmıştır. Sadece bir havalandırma başlık altında ve KKD ile kullanılmalıdır. Ayrıca son derece yanıcı ve uzak herhangi bir ısı kaynağından tutulmalıdır. Not: propilen oksit, organik bir çözücü madde ve plastik ile uyumlu olduğu Bu aşamadan önce, bölümler dikkatle cam şişelere transfer edilmelidir. Bu noktada, bölümler çok kırılgandır ve özenle manipüle edilmelidir. Bölümler, alternatif olarak 4.5 aşamasından önce cam şişelere transfer edilebilir. </li><li> dikkatle Transferi bölümleri, alüminyum bardak birer birer ve mümkün olduğunca hava ile temasını engellemek. Düz gömmek önceden karıştırılmış olan su itici, epoksi reçinesi bölümleri ve VENTIN altında gece boyunca inkübeOda sıcaklığında g başlık. NOT: Bu adımda, bölümler tamamen susuz ve çok kırılgandır ve özenle manipüle edilmelidir. </li><li> mineral yağ kullanılarak, yağlanmış plastik lamelleri ile birlikte yağ kaplı cam slaytlar hazırlar. </li><li> en 12-15 dakika boyunca 60 ° C de, alüminyum bardak inkübe edilerek reçine yumuşatın. Dikkatle cam slayt yağlanmış tarafında bölümleri düzleştirmek. yağlanmış lamel yerleştirin ve dikkatlice kalan havayı dışarı itmek. </li><li> 48 saat boyunca 60 ° C &#39;de slaytlar inkübe edin. NOT: Reçine çok zor olacağından, 48 saat inkübasyon süresi aşmayacak şekilde Bu kritik öneme sahiptir. </li><li> plastik lamel çıkarın. </li></ol> Geçirimli Elektron Mikroskobu kullanılarak Ultra ince Kesit ve Gözlem 5. Numune Hazırlama <ol><li> Ilgi bölgeyi bulmak için dürbün kullanın ve bir neşter ile yaklaşık 1 mm 2 küçük dörtgen bir parça kesti. </li><li> bir reçine bloğun uç dosya ve qu tutkaladrangular bir parçanın üzerine (Şekil 1C). Tutkal, en azından 1 saat ya da kesit önce gece boyunca kurumaya bırakın. </li><li> Bir ultramikrotom kullanılarak, 80 um-kalınlıkta bölümler (Şekil 1D) içine dörtgen parça kesin. <ol><li> kademeli düz kenarlara sahip bir yamuk oluşturmak için reçine bloğun her tarafı kesilmiş, keskin bir tıraş bıçağı kullanılarak, dikey konumda bir ultramikrotom güverte reçine blok yerleştirin ve. </li><li> yatay konumda üst koyun ve trapezoidin uzun kenarı aşağı doğru bakan kadar blok döndürmek. </li><li> dörtgen parçanın yüzeyini kesmek için bir elmas kırpma aracı veya bir cam bıçak kullanın. ultramikrotom / s, 1 mm, 300 mikron kalınlığında kesitler kesilmiş olarak ayarlayın. dikey olarak dört köşeli bir parça olarak paralel ve yaklaşık olarak 1 ° &#39;lik bir çok küçük bir yatay açı göstermek için bıçak ayarlayın. NOT: Bu açı hemen hemen b yüzeyine paralel kullanıcı doku yaklaşım sağlayacakimmunolabeled elemanlar bulunabilir olasılığı daha yüksek olduğu, kilitleyin. Elmas kırparak aracıyla bu parametreleri kullanırken, reçine parlak beyaz rengi görüntüler. Doku kesiliyor olduğunda, mor ya da yeşilimsi bir renge dönüşür. </li><li> ksilen içinde uçlu emici kağıt bir parça ile üzerinden geçen bölümler arasında pürüzsüz, 80 um kalınlığında kesitler kesmek için damıtılmış su ile dolu bir tekne ile donatılmış bir Ultra 45 ° elmas bıçak kullanarak ve formvar kaplı nikel yuvası ızgaralar ya da seri bölümlerini toplamak çıplak 150 örgü bakır ızgaralar (Şekil 1 E). </li></ol></li><li> bir ızgara, muhafaza kutusu ızgaraları yerleştirin. </li><li> kurşun sitrat ile ızgaralar leke. <ol><li> 1 filtre kurşun sitrat stok çözeltisi çözeltisi ve filtre edilmiş, damıtılmış su: 5 ml şırınga ve bir 1 hazırlanması için bir 0.2 um şırınga filtresi kullanın. Işıktan koruyun. NOT: kurşun sitrat stok çözeltisi katı DEPOS oluşumunu önlemek için her ay taze yapılmalıdıronun. Stok tarifi için malzeme bir fiş bakınız. ızgaraları birçok dizi lekeli gerekiyorsa o sütlü hale Buna ek olarak, seyreltilmiş çözelti değiştirin. </li><li> çözelti ile temas halinde bölümü ile seyreltilmiş bir çözelti damla üzerine her bir ızgara yerleştirin. 3 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> ızgara tutmak için küçük cımbız kullanarak ve damıtık su içeren iki kap içinde durulayın. </li><li> hafifçe emici kağıt kullanarak fazla su çıkarın. bir ızgara kutusuna ızgaraları saklayın. (Şekil 1F TEM) Transmisyon Elektron Mikroskobu ile bölümleri incelenerek 30 dakika önce bekleyin. </li></ol></li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu makalede, insan-olmayan primatlar ve EM örnek incelenmesi için uygun ön gömme immünohistokimya ile transkardiyak perfüzyon için güvenilir bir protokol mevcut. Örneğin CEMOVIS gibi tipik cryo-EM, beyin yapısı ile ilgili iyi bir koruma sağlar, ancak, aynı zamanda, immünohistokimya 12 kullanımını sınırlar. Kriyo-değiştirme ve Tokuyaso tekniği de dahil olmak üzere başka teknikler, immünohistokimya gömme sonrası sağlar, ancak bu teknikler, işlem sırasında gerekli ola...

Konfokal ve iki foton mikroskopi dahil Işık mikroskopisi, 2, diğer şeylerin 1 arasında vivo nöronal süreçlerde okuyan için etkin bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Işık Mikroskobik (LM) seviyesinde tipik uzamsal çözünürlük gibi aşırı ultraviyole ve yumuşak X-ışını mikroskopi için farklı ışık kaynaklarını kullanarak yaklaşık 200 nm, son zamanlardaki teknolojik ilerlemeler olmasına rağmen, özellikle bir, yaklaşık 10 nm uzaysal çözünürlük 3, bu çözünürlük artmıştır , 4, 5. Görüntülemede Diğer teknolojik gelişmeler histoloji ile manyetik rezonans görüntüleme birleştirildi ve in vivo olarak miyelin kılıfının sadece Elektron Mikroskobik (EM) seviyesi 6, 7, geleneksel olarak ölçülebildiği bir parametre kalınlığının ölçülmesi için yeni bir yöntem sağlamaktır içerir. AlthouGH LM seviyesinde bu gelişmeler, örneğin, sinaptik temasların olarak yaşayan işlemleri, yapıları detaylı bir görünümünü ve karakterizasyon incelenmesi için mükemmel bir araç sağlar, 0.5 nm ulaşabilir çözünürlüğe sahip EM ile elde edilebilir. Bununla birlikte, EM seviyesinde gözlem hücre mimarisini korumak amacıyla, kimyasal tespit ve dehidrasyon işlemleri ile, bazı açılardan, ölü ve değiştirilmiş olduğu numuneler gerektirir. Bu nedenle, yüksek çözünürlükte biyolojik örneklerinin incelenmesi bağlı radyasyon elektron ışını hasar, düşük kontrast, membranların yapısal sapma, ya da 8, 9, 10 gömme aşağıdaki dehidrasyon ve epoksi oluşabilir eserler da varlığına zor olabilir. Yapısal analiz için kendi doğal biçiminde numuneler koruma &quot;Vitrifiye Kısımların Krio-EM&quot; kullanılarak veya CEMOVIS bir kesit bir yaklaşım ile elde edilebilirhızlı dondurma ve camsı buz numune yerleştirme ve bir kriyojenik sıcaklık 11, 12 EM bölümü altında incelenmesi ile. Onlar hala sağlam ve tam sulu iken Bu prosedür böylece dehidrasyon nedeniyle eserler ortadan kaldırarak 13 işlediğinde, numunelerin incelenmesi için izin verir. Bununla birlikte, bu yöntem, önemli ek harcamalar, çok düşük sıcaklıklarda, bu gözlem olanak sağlamak amacıyla, kriyo-ultramikrotom için ilave cihazlar, hem de standart EM ek aygıtları kapsamaktadır. Buna ek olarak, CEMOVIS yaklaşım antikorlar genellikle oda sıcaklığında inkübe edilmesi gerekir, çünkü teknikleri ile immün kullanımını engeller. Seçenek olarak ise, kriyo-koruyucu kimyasal immerged ve inci ise cryo sabit Numuneler çözülür sırasında dondurularak ikame yaklaşım kullanılarak immünohistokimyasal prosedürlere ultrastrüktürel analiz birleştirmek mümkündürtr Böyle Lowicryls gibi özel reçineler, gömülü. Post-gömme immunolabeling sonra böyle materyal 12 üzerinde gerçekleştirilebilir. Ancak, dondurularak ikamesi ve cryo-sabitleme teknikleri zaman alıcıdır. Bunlar, ilave donanım takılmasını gerektirir ve düşük bir sıcaklıkta 14, 15 kullanımına rağmen, bir organik çözücü ve hücre mimarisini değiştirebilir kimyasal sabitleyici maruz kalması örnekleri gerektirir. Bu nedenle, özellikle akrolein LM ve EM DÜZEYİ, beyin dokusunun kimyasal sabitleme, her ikisi de tüm teknolojik ilerlemelere rağmen, EM 16 immünohistokimya birleştirmek için bir düşük maliyetli ve zaman tasarrufu sağlayan bir yöntem olmaya devam etmektedir. Son birkaç on yılda, birçok girişimde iyi doku korunmasını sağlayan aldehitlerin karışımı bulmak için yapılmıştır. 1960&#39;lardan önce, EM için kabul edilebilir sonuçlar vermiştir sadece kimyasal sabitleyici ozmiyum tetroksit oldu. Bununla birlikte, ozmiyum tetroksit beyin gibi organları düzeltmek için damar sistemi aracılığıyla kullanımını engelleyen, son derece zehirli ve pahalıdır. Akrolein hücresel yapıların 17 EM, gözlem için uygun hayvan doku koruması için güvenilir bir yöntem olarak 1950&#39;lerin sonlarında tanıtıldı. Bu daha derin doku nüfuz eder ve daldırma ile fiksasyonu için ve doku 17 minimum çekme sitoplazmik bileşenlerin iyi bir koruma sağlar, diğer aldehitler daha hızlı bir şekilde tepki verir. Bu tür enzimler ve diğer proteinleri 18 gibi moleküler bileşiklerin, canlı daha doğru bir lokalizasyonu ile, taze doku kullanıldığında Böyle bir özellik akrolein fiksasyon başka aldehitlerle üzerinde açık bir avantaj sağlar. Gerçekten de, bu etkin bir stabilitesine sahip olarak, Kurbağa ve kemirgenler de dahil olmak üzere pek çok türde, EM seviyesinde görselleştirme için fiksasyon kolay, verimli ve düşük maliyetli bir yöntem olarak yıl boyunca doğrulanmıştırzes peptidler ve proteinler, antijenitesini muhafaza eden ve 16, 18, 19, 20, 21 tespit maddesi bir aldehit ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman nispeten sağlam ultrastrüktürel sağlar. Kemirgenlerde akrolein tespit için protokoller o zamandan beri standardize edilmiş ve EM 16, 22 için çift immunolabeling uygulamak, özellikle Pickel grup tarafından, yoğun kullandık. Birkaç grupları insan olmayan primat beyin dokusunda 23 akrolein fiksasyonunu kullandık. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, verimli EM 24 immunolabeling uyumlu insan olmayan primatlarda akrolein ile kimyasal fiksasyonunu açıklayan tek yayınlanmış protokol vardır. Bu makalede, verimli kimyasal olarak uğultu düzeltmek için kolay ve güvenilir bir yöntem sağlamaktırile immün ve iletim EM inceleme öncesi gömme birlikte, potansiyel olarak uzun süreli korunması için izin akrolein bir primat beyinler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">S374-500</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O)</td>
			<td style="width:123px;">EM Science</td>
			<td style="width:119px;">SX0710-1</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-3</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydroxymethyl aminomethane (THAM)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">T370-500</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">HCl&#160;</td>
			<td style="width:123px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-3</td>
			<td style="width:177px;">1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:123px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0590-1</td>
			<td style="width:177px;">5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:177px;">4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrolein (90%)</td>
			<td style="width:123px;">sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">110221</td>
			<td style="width:177px;">3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Autopsy venting table</td>
			<td style="width:123px;">Mopec</td>
			<td style="width:119px;">CE400</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Electronic perfusion pump</td>
			<td style="width:123px;">cole parmer</td>
			<td style="width:119px;">masterflex L/S 7523-90</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle (perfusion)</td>
			<td style="width:123px;">terumo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NN-1838R</td>
			<td style="width:177px;">18G 1 1/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle</td>
			<td style="width:123px;">terumo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NN-2713R</td>
			<td style="width:177px;">21G 1/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;">20 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;">4 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;">0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:123px;">Feather&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; lance</td>
			<td style="width:119px;">201011&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; J9913</td>
			<td style="width:177px;">No.22 for surgery and&#160;&#160;&#160; No. 11 for EM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rongeurs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">VT 1200S</td>
			<td style="width:177px;">Calibrate blade before each use, when the device allows it</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vibratome razor blade</td>
			<td style="width:123px;">Gillette</td>
			<td style="width:119px;">GIN 642107</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">G33-4</td>
			<td style="width:177px;">30% dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">E178-4</td>
			<td style="width:177px;">30% dilution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Sodium borohydride (NaBH4)</td>
			<td style="width:123px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S-9125</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Normal horse serum</td>
			<td style="width:123px;">Jackson immunoResearch Laboratories</td>
			<td>008-000-121</td>
			<td style="width:177px;">2% dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cold-fish gelatin</td>
			<td style="width:123px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">900.033</td>
			<td style="width:177px;">0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primary antibody, SERT</td>
			<td style="width:123px;">Santa Cruz biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC-1458</td>
			<td style="width:177px;">1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primary antibody, ChAT</td>
			<td style="width:123px;">Chemicon (Millipore)</td>
			<td style="width:119px;">AB144P</td>
			<td style="width:177px;">1/25 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primary antibody, TH</td>
			<td style="width:123px;">ImmunoStar</td>
			<td style="width:119px;">22941</td>
			<td style="width:177px;">1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotinylated secondary antibody, goat</td>
			<td style="width:123px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BA-9500</td>
			<td style="width:177px;">1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotinylated secondary antibody, mouse</td>
			<td style="width:123px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BA-2000</td>
			<td style="width:177px;">1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectastain elite ABC kit</td>
			<td style="width:123px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">PK6100</td>
			<td style="width:177px;">8.8 &#181;L/mL of A and B each</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">3&#39;3 diaminobenzidine (DAB)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5637</td>
			<td style="width:177px;">0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Peroxide (H2O2) 30%</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">H-323</td>
			<td style="width:177px;">0,005% dilution</td>
		</tr>
		<tr height="212">
			<td height="212" style="height:212px;width:216px;">Osmium tetroxide (OsO4)</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">2% 19152&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 4% 19150&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Durcupan water-repellent epoxy resin</td>
			<td style="width:123px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">A: M epoxy resin (44611)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; B: hardener 964 (44612)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; C: accelerator 960 (DY 060)&#160; (44613)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; D: plasticizer (44614)&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Polymerize 48h at 58 &#176;C before throwing in waste.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alumium cups</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">70048-01</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">commercial alcohols</td>
			<td style="width:119px;">1019C</td>
			<td style="width:177px;">Dilute in distilled water with appropriate concentration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Propylene oxide</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">20401</td>
			<td style="width:177px;">Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Non-coated medium glass slides</td>
			<td style="width:123px;">brain research laboratories</td>
			<td style="width:119px;">3875-FR</td>
			<td style="width:177px;">Grease surface with mineral oil</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Plastic film (Aclar embedding film)</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">50425-25</td>
			<td style="width:177px;">Grease surface with mineral oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:123px;">Leica UC7</td>
			<td style="width:119px;">EM UC7</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Diamond trimming tool (ultratrim)</td>
			<td style="width:123px;">Diatome&#160;</td>
			<td style="width:119px;">UT 1081</td>
			<td style="width:177px;">Can use glass knife alternatively</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra 45&#176; Diatome Diamond knife</td>
			<td style="width:123px;">Diatome&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MC13437</td>
			<td style="width:177px;">equipped with a boat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylenes</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5SK-4</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">150-mesh copper grids</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">G150-cu</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">grid-box</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">71138</td>
			<td style="width:177px;">Can store up to 100 grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:123px;">Anachemia</td>
			<td style="width:119px;">81983</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="336">
			<td height="336" style="height:336px;width:216px;">Lead nitrate</td>
			<td style="width:123px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-6258</td>
			<td style="width:177px;">Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe</td>
			<td style="width:123px;">terumo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SS-05L</td>
			<td style="width:177px;">5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:123px;">corning</td>
			<td style="width:119px;">431222</td>
			<td style="width:177px;">0.2 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Absorbing paper (bibulous paper)</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">70086-1</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:123px;">Laboratory film</td>
			<td style="width:119px;">PM-999</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M5904</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of non-human primate brain tissue for pre-embedding immunohistochemistry and electron microscopy

ışık mikroskobu düzeyinde tüm teknolojik gelişmelere rağmen, elektron mikroskobu böyle sinaptik kişiler gibi nöronların, ultrastrüktürel ve morfolojik ayrıntılarını incelemek ve karakterize edilmesi sinirbilimindeki tek uygulama. elektron mikroskobu için, beyin dokusunun iyi koruma titiz kriyo-sabitleme yöntemleri ile elde edilebilir, ancak bu teknikler oldukça maliyetlidir ve tanımlanan nöronal sistemler arasında bağlantı anlamak önemlidir immunolabeling kullanımını sınırlar. Dondurularak ikame yöntemleri immunolabeling ile kriyo-tespitin bileşimini sağlamak için geliştirilmiştir. Ancak bu metodolojik yaklaşımların tekrarlanabilirlik genellikle masraflı donma cihazlarda dayanır. Üstelik bu teknikle güvenilir sonuçlar elde çok zaman alıcı ve beceri zorlu olduğunu. Bu nedenle, özellikle akrolein sabitleyici geleneksel kimyasal sabit beyin, elektron birleştirmek için bir zaman etkili ve düşük maliyetli bir yöntem olmaya devam etmektedirimmünhistokimya ile mikroskopi. Burada, primat beyin dokusunun korunması yol açar ve immünohistokimya ve transmisyon elektron mikroskobik inceleme öncesi gömme uyumlu kimyasal akrolein fiksasyonu ile güvenilir bir deney protokolü sağlar.

Bu bölümde, kimyasal olarak% 3 akrolein karışımı% 4 PFA ile sabitlenmiş immüno primat beyin dokusu, iletim EM seviyesinde, gözlem yapıldıktan sonra elde edildi temsili sonuçları sunulmaktadır. Nispeten sağlam miyelin kılıfının ve çift zarlar (Şekil 2A) düzgün görselleştirme ile gösterildiği gibi, yapısı ile ilgili iyi bir koruma elde etti. Mikro nöronal maddelerle birlikte, sinaptik iletişim bilgileri, kolayca (Şekil 2B) t...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy at JoVE.com

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Burada, kolay ve düşük maliyetli sağlar ve zaman tasarrufu sağlayan bir protokol kimyasal transmisyon elektron mikroskobu için immünohistokimya ön gömme uyumlu uzun süreli koruma sağlayan, akrolein sabitleyici ile primat beyin dokusunun düzeltmek için.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

preparation-non-human-primate-brain-tissue-for-pre-embedding

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K Görüntüleme.  Université Laval.  Burada, kolay ve düşük maliyetli sağlar ve zaman tasarrufu sağlayan bir protokol kimyasal transmisyon elektron mikroskobu için immünohistokimya ön gömme uyumlu uzun süreli koruma sağlayan, akrolein sabitleyici ile primat beyin dokusunun düzeltmek için. 

Video: Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Nörobilim

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Revealing Kompleksi Beyin Topografya Wholemount İmmünohistokimya

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of optogenetics, however, requires that safety and efficacy be demonstrated in animal models, ideally in non-human primates (NHPs), because of their neurological similarity to humans. The number of candidate vectors that are potentially useful for neuroscience and medicine is vast, and no high-throughput means to test these vectors yet exists. Thus, there is a need for techniques to make multiple spatially and volumetrically accurate injections of viral vectors into NHP brain that can be identified unambiguously through postmortem histology. Described herein is such a method. Injection cannulas are constructed from coupled polytetrafluoroethylene and stainless-steel tubes. These cannulas are autoclavable, disposable, and have low minimal-loading volumes, making them ideal for the injection of expensive, highly concentrated viral vector solutions. An inert, red-dyed mineral oil fills the dead space and forms a visible meniscus with the vector solution, allowing instantaneous and accurate measurement of injection rates and volumes. The oil is loaded into the rear of the cannula, reducing the risk of co-injection with the vector. Cannulas can be loaded in 10 min, and injections can be made in 20 min. This procedure is well suited for injections into awake or anesthetized animals. When used to deliver high-quality viral vectors, this procedure can produce robust expression of optogenetic proteins, allowing optical control of neural activity and behavior in NHPs.

As currently implemented, optogenetics in non-human primates requires injection of viral vectors into the brain. An optimal injection method should be reliable and, for many applications, capable of targeting individual sites of arbitrary depth that are readily and unambiguously identified in postmortem histology. An injection method with these properties is presented.

Anestezi Uygulanmış ve İnsan Dışı Primat Beyne Uyanan Optogenetik için AAV Vektörlerinin Enjeksiyonları

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...