Biz ilk tespit ve altın nano tanecikleri spektroskopi bağlamında 2004 yılında iSCAT sundu. Takip eden 10 yıl içinde bu tekniği virüsler ve küçük proteinler gibi biyolojik nano partiküllerin tespiti ve takibi için daha da geliştirdik. Tekniğin özü, herhangi bir maddi nesne, ne kadar küçük olursa olsun, sonlu bir yok oluş kesiti olmasıdır.
Bu tekniğin en büyük avantajı etiketsiz algılamadır. Bu, eğer yeterince hassassak, tek hücrelerden salgılanan proteinler veya ekzozomlar gibi hemen hemen her şeyi tespit edebileceğimiz anlamına gelir. Dikkat edilmesi gereken konu, saçılma arka planının nasıl ele alınılabildiğini.
Bir iSCAT mikroskobun büyük bir avantajı tamamen ev inşa edilebilir ve mevcut bir ticari mikroskop eklenebilir. Bu kolayca floresan gibi diğer optik teknikler ile kombine edilebilir anlamına gelir, ve bu birçok grup da şimdi iSCAT ve ilgili teknikler istihdam nedenlerinden biridir. Burada luz hücrelerini bireysel ve salgılayıcı proteinlerin tespitini göstermek için bir model sistemi olarak kullanıyoruz.
Ancak, bu yöntem moleküler düzeyde hemen hemen herhangi bir biyolojik süreci araştırmak için de uygulanabilir. Kararlı bir mikroskop elde etmek için, sönümlü optik tablo ve örnek aşaması için sert bir masif blok ile başlayın. Yüksek sayısal diyafram hedefi ve yanal numune çevirisinin yanı sıra hedef için odak konumunun değiştirilmesine olanak tanıyan bir çeviri birimi içeren bir mikroskop örnek aşaması oluşturun.
45 derece dikey bağlantı aynası ve 50 santimetre odak uzaklığı tekli lens kullanarak bir diyot lazerin ışığını dalga boyunda 445 nanometreden hedefin arka odak düzlemine odaklayın. Bu geniş alan merceği, iSCAT aydınlatma kaynağı olacak objektif ileri odak, bir collimated Kiriş oluşturur. Hedefe bir daldırma yağı damlatın ve mikroskop aşamasının örnek düzlemine bir cam kapak kaydırın.
Bu, görüntüleme hedefi ne kadar aşağı yansıyan bir ışınla sonuçlanır. Görüntüleme yolunu kurmak için, olay ışınına göre 45 derecelik açıyla ve geniş alan merceğinden yaklaşık 10 santimetre sonra bir anti-yansıma kaplı ışın bölücüse tanıtılıyorum. Yansıma önleyici kaplamanın lazer kaynağına doğru işaret ettiğinden emin olun.
Kalın bir ışın bölücü lazer artık objektif düz giremeyebilir böylece önemli ışın deplasman tanıtacak olarak dikkat edin. Gerekirse, lazer ışını yolunu ışın bölücüden önce yeniden hizalayın ve amaç boyunca doğru yayılmayı sağlayın. Örnek düzlem ve kamera parfocal olduğundan emin olmak için, olay ışın yolu geniş alan lens beş santimetre sonra bir pozisyonda 45 santimetre negatif odak uzaklığı ile içbükey lens yerleştirerek başlayın.
Bu, hedefin arka diyafram girişine harmanlanmış bir ışın la sonuçlanır. İnterferometrenin yansıtıcı koluna yerleştirilen ekranla, kaba odak pozisyonunu bulmak için hedefi dikey yönde hareket ettirin. Ekrana çarpan ışın harmanlandığında amaç odaktadır.
Kaba odaklama tamamlandığında hem negatif odak uzaklığı merceği hem de ekranı çıkarın. Dağınık ışığı odaklamak ve yansıyan ışığı harmanlamak için ikinci bir 50 santimetre odak uzaklığı singlet lens ekleyin. Lensin, iletilen lazer ışınının tekrar harmanlanmış olması için hedefin arka odak düzleminden 50 santimetre uzaklıkta olduğundan emin olun.
iSCAT kurulum tertibatını tamamlamak için CMOS kamerayı 50 santimetrelik odak uzaklığı merceğinden 50 santimetre uzağa yerleştirin ve ışını doğrudan çipin ortasına yerleştirin. Ek görüntüleme kanalları kurmak için, bir LED ışık kaynağının çıkışını uzun bir çalışma mesafesi hedefine çift olarak getirin. LED çıkışının numuneye odaklanmasına ve yanal olarak konumlandırılmasını sağlayan mekanik bileşenleri numune haznesinin üzerine yerleştirin.
Üst hedefi yanal olarak hareket ettirin, böylece üst geniş alan hedefi ve alt iSCAT hedefi eşitsel dir. Bu, bir ekranın alt hedefe yerleştirilerek ve ekrana iletilen LED ışığının yoğunluğunun maksimize edilmesiyle belirlenir. Şimdi, iSCAT lazer yolundan iletilen LED ışığı bölmek için 550 nanometrelik kısalık dikroik ayna yerleştirin.
Bu ışını %8 yansıtıcı, yüzde 92'si transmissive, ışın bölücü ile iki kanala bölün. Yüzde 92 yol floresan kanalıdır ve yüzde sekiz yol brightfield görüntüleme için kullanılır. Beş santimetre odak uzaklığı akromatik çift lens kullanarak brightfield kanalını CMOS kameraya yansıtın.
Beş santimetre odak uzaklığı akromatik doublet lens kullanarak floresan kanalını ayrı bir CMOS kameraya görüntüleyin. Ayrıca, uyarma ışığını engellemek için 600 nanometrelik uzun pas filtresi kullanın. Bilgisayarı ve yazılımı kurmak için tüm kameraları bir bilgisayara bağlayın.
Tam olarak monte edilmiş kurulumda, CMOS kameradaki iSCAT görüntüsünü gözlemleyin ve cam kapak üzerinde artık toz veya kir parçacığı bularak odakta olduğundan emin olun. Parçacığın görüntüsünün dairesel olarak simetrik bir nokta yayma fonksiyonu olduğunu doğrulayın. Lazer ışını mikroskop hedefine hafif bir açıyla girerse nokta yayma fonksiyonu dairesel bir şekle sahip olmayacaktır.
Bu hedefe düz bağlantı sağlamak için 45 derece ayna hafif ayarı ile düzeltilebilir. Brightfield ve floresan kanallarının kamera görüntülerini karşılaştırın. Floresan boncuk veya hücre örneğini görüntüleyerek her ikisinin de odakta olduğundan emin olun ve aynı alanı görüntüleyin.
iSCAT lazerin konumunun yaklaşık olarak görüntünün merkezinde olduğunu doğrulayın ve daha sonraki başvuru için konumunu not alın. Parlaklık alanının ve floresan kanalının konumunu ve görüş alanını değiştirmek için, kameraları odaklama lensleri ile ilgili olarak masaya taşıyın. Metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi deneme için hazırlanın.
Bu hücre ve mikroskopi orta hazırlanması yanı sıra mikroskop örnek cuvette içerir. Hücrelerin iSCAT lazer ışığına doğrudan maruz kalmasını önlemek için lazer ışınının tıkandığından emin olun. Hazırlanan hücre örneğinin yaklaşık üç mikrolitresini merkezden hafifçe numune nin içine enjekte edin.
Pipet ucuna hafifçe dokunun ve hücre çözeltisini yavaşça enjekte edin. Hücrelerin kapak kaymasına yerleşmesine izin verin. iSCAT lazerine yakın hücre sayısını kontrol edin.
Hücre sayısı çok düşükse, yeterli sayıda kullanılabilir olana kadar bu adımı yineleyin. Hücrelerin kapsamı çok yoğunsa, hücreleri kapak boyunca dağıtmak için yaklaşık 20 mikrolitre ek mikroskopi ortamı enjeksiyonu kullanın. Piezoelektrik çeviri aşamasını kullanarak, örneği yanal olarak bir hücreyi iSCAT görüş alanına yakın konumlandırmak için hareket ettirin.
445 nanometre lazer ışığına doğrudan maruz kalma hücre için zararlı olabilir gibi hücre iSCAT görüş alanına girmez emin olun. iSCAT lazer ışınının engelini kaldırın ve kapak yüzeyinin hala odakta olduğundan emin olun. Ortam ortamından sürüklenme ve akustik bağlantıyı en aza indirmek için izolasyon tablosunu içine akıtın.
iSCAT, brightfield ve floresan kameralarından görüntüler alarak ölçümü başlatın. Hücrenin canlılığını ve sistemin odak noktasını periyodik olarak kontrol edin. Burada, kamera görüntülerini görüntülemek için kendi kendine yazılmış mikroskop yazılımı kullanılır.
Burada, protein bağlamalarını görünür kılmak için ardışık çerçevelerin çekilmesi ile diferansiyel görüntüleme gerçek zamanlı olarak gerçekleştirilir. Bu, ham kamera görüntüsüyle birlikte ekranda görünen filtrelenmiş bir görüntüyle sonuçlanır. iSCAT ile yapılan hücresel salgı deneyinin temsili sonuçları burada gösterilmiştir.
Video iki dakika boyunca bir LAZ hücre salgıları gösterir. Soldaki diferansiyel iSCAT görüntüleri, tek proteinlerin coverglass'a emilimini görselleştirir. Sağdaki brightfield görüntüleri ve floresan kanalı hücre canlılığını izlemek için kullanılır.
Bu histogram, tespit edilen proteinleri ve kontrast aralığını iki dakikalık zaman dilimi içinde gösterir. Veriler, iSCAT video verilerinin her karesinde tek tek bağlama olayları analiz edilerek özel bir tepe arama algoritması kullanılarak toplanmıştır. ISCAT mikroskobu sadece biyosensing güçlü bir araç değil, aynı zamanda mikroskopi, gerçek zamanlı olarak nano nesnelerin etiketsiz algılama sağlar çünkü.
Özellikle proteinlerin difüzyonu ve taşınması gibi çeşitli işlemlere uygulanabilir. ISCAT, ışık saçılımına karşı mükemmel hassasiyeti nedeniyle görüş alanındaki herhangi bir protein iveya varlığı algılayabilir. Tabii ki, bu aynı zamanda tekniğin floresan birlikte getirdiği özgüllük yoksun olduğu anlamına gelir, ama bu sorunu aşmak için, bir ilgi belirli proteinleri tespit etmek için yüzey işlevselleştirme gibi ek yöntemler uygulayabilirsiniz.
Lazerlerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve mikroskobu monte ederken ve ayarlarken her zaman uygun göz korumasının takılması gerektiğini unutmayın. Sekretlerin gerçek zamanlı tespiti çok heyecan verici dir ve tıbbi tanıda büyük bir sıçramadır, şu anda çok daha uzun zaman gerektirir ve tek protein duyarlılığından çok uzaktır. Yöntemin performansını artırmak ve uygulamalarını genişletmek için hala bol yer vardır.
Bu yüzden bu video diğer gruplar bu heyecan verici çaba katılmak yardımcı umuyoruz.
