Bu çalışmada mikroskobu Enstitüsü, dönüştürücü biyo-molekülleri, (TEFE-ITbM) Nagoya Üniversitesi yapıldı ve Japonya gelişmiş bitki bilim şebeke tarafından desteklenmesi. Bu eser bilim promosyon için hibe Japonya bilim ve teknoloji Ajansı (ERATO T.H. ve M.U. projeye) ve Japonya toplum tarafından desteklenmiştir: yenilikçi alanlar ('ları üzerinde bilimsel araştırma için bir Grant-in-Aid JP24113514, JP26113710, JP15H05962 ve JP15H05955 M.U. ve Nos için. JP16H06465, JP16H06464 ve JP16K21727-T.H için), bir Grant-in-Aid genç bilim adamları (B, Nos. JP24770045 ve JP26840093 M.U. için) ve bir Grant-in-Aid zorlu araştırmacı araştırma (No. M.U. için JP16K14753).

1. hazırlık In Vitro Ovule kültür orta <ol><li>yapmak sıvı ortamı içinde vitro ovule kültür için (&#34; N5T orta &#34;) 1 x Nitsch Bazal tuz karışımı, %5 (w/v) trehalose dihydrate, 0,05 içeren % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic asit (MES)-KOH (pH 5,8) ve 1 x Gamborg &#39; s vitamini çözüm.</li>
	<li>KOH ile 5.8 için pH ayarlama.</li>
	<li>Orta (121 ° C, 20 dk) veya bir 0,22-µm filtresi filtre tarafından ısıyla sterilize. 
	Not: Steril orta için 2-3 ay 4 ° C'de saklanabilir.</li>
</ol> 2. PDMS Micropillar dizi aygıtı hazırlanması <ol><li>kesme bıçağı, jilet veya cam parçası bir 35 mm cam alt çanak (14 mm φ) sığacak şekilde makas PDMS micropillar aygıt. 
	Not: PDMS aygıt inşaat tam prosedürü önceki kağıtları 8 , 9 ' anlatılan ve böylece detayları burada göz ardı edilir. Cam-alt yemekleri, 4-şey veya 96-şey tabak gibi daha küçük birimler ile-ebilmek var olmak kullanılmış için aygıtı olmayan kısa vadeli düşsel.</li>
	<li>Sterilize PDMS cihaz 15 dakika süreyle UV ışık altında üst tarafında</li>
	<li>Kare uç cımbız kullanarak tarafından PDMS aygıtı ve UV altında alt sterilize etmek 15 dk hafif devam.</li>
	<li>Steril PDMS aygıt bir 35 mm kültür kabına aktarmak ve cihazın tamamen orta (yaklaşık 5-7 mL) batırılmış kadar N5T orta ekleyin.</li>
	<li>Çanak vakum bir odaya koyun ve degas basıncı azaltmak. Cihazın havada medyum tarafından değiştirilene kadar gece 3 h için vakumlama devam. 
	Not: Cihaz hava kabarcıkları güçlü vakum altında tarafından müstakil.</li>
	<li>Kare uç cımbız ile tutarak yemek aygıtı almak ve ekstra orta alt ve yan üzerinde kaldırmak için kağıt havlu koyarsın. 
	Not: Bu ovule ekimi için kullanılır çünkü micropillar dizi (üst yüzey) medyada tamamen kaldırılmaması gerekir.</li>
	<li>Micropillar parçası olarak üst tarafı tutmak için sağlanması bir 76 mm x 26 mm slayt cam üzerine bu aygıtı ve 35 mm kültür çanak kapağı aşağıdaki ovule ayıklama sırasında kurumasını üzerinden orta önlemek için aygıtla kapak.</li>
</ol> 3. Silique diseksiyon ve Ovule çıkarma <ol><li>Sterilize iğne (0.40 mm G) ve iyi cımbız % 70 etanol ile silerek. İğne kolayca bir şırınga veya ahşap sopa ekleyerek ele.</li>
	<li>Bitki önümüzdeki kontrol ve deney için uygun siliques seçin. Yaklaşık 5 mm siliques zigotları içeren ve 8-10 mm siliques genç küresel embriyo içerir.</li>
	<li>Cımbız kullanarak siliques tüketim ve onları çift taraflı bant 76 x 26 mm slayt camına yerleştirin. Bir silique içeren hakkında 40-60 ovules ve 3-4 siliques (Yani, 120-240 ovules) bir aygıt için yeterlidir.</li>
	<li>Steril iğne ve bir stereomicroscope altında cımbız kullanarak içinde ovules görmek için silique (yumurtalık duvar) açın. Ovules hasar görmemiş sadece Over duvar kesti.</li>
	<li>(2,7 adımda hazırlanan) PDMS aygıtta N5T orta açılan silique transfer ve ovules orta iğne veya cımbız ile serbest.</li>
	<li>Ovules micropillar dizideki alanlarda içine itmek için PDMS cihazın üzerine küçük bir kapak bardak (18 x 18 mm) koymak.</li>
	<li>Cam yatay olarak ekstra orta kaldırmak için cımbız veya parmak kullanarak çekerek çıkar.</li>
	<li>PDMS aygıt ters çevirin, bir 35 mm cam alt çanak yerleştirin ve biraz cam sopa kare uç cımbız kullanarak basarak cihazın basın.</li>
	<li>Cam alt içine yavaşça dökün N5T orta çanağı PDMS cihazın tamamen ortamda batırılmış kadar orta şişe decanting ve parafin film ile çanak mühür. 
	Not: PDMS aygıtı geri dönüştürülmüş olabilir, ama çok eski aygıtları kolayca cam alttan ayrılır. Ayrıca, cihazın tamamen adım 2.5 degassed değil veya orta çok çabuk dökülür savrulabilir.</li>
</ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg" /> Resim 2: için numune hazırlama şematik yordam. 
Bu şematik akış adımları 3.5 4.1 karşılık gelir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
 4. time-lapse Imaging <ol><li>ters bir mikroskop 3.9 adımda hazırlanan cam alt çanak yerleştirin ve odaklanmak için uygun ovules seçin. 
	Not: sahne, pozisyon ve yönde ovules farklı olduğundan, uygun ovules onların işaret Floresans kontrol ederek bulunabilir.</li>
	<li>Başlamak canlı görüntüleme üreticiye göre &#39; s yönergeleri mikroskop sistemi. 
	Not: Mikroskop ekipman ve parametreleri çeşitlidir ve böylece kullanıcılar için deneme amaçlı uygun uygun ayarları seçmeniz gerekir. Örneğin, Tablo 1 ' de bu el yazması kullanılan ayarları listelenir.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>ekipman/koyma</td> <td>şekil 3 (A) ve tamamlayıcı Videolar 1 ve 4</td> <td> Şekil 3 (B) ve tamamlayıcı Video 2</td> <td>tamamlayıcı Video 3</td></tr> <tr><td>mikroskop</td> <td>lazer tarama mikroskop (A1R MP) ters</td> <td>dönen disk confocal ters mikroskop (CSU-W1)</td> <td> Kutu-tip ters confocal mikroskop sistem istikrarlı kuluçka Odası (CV1000) ile</td></tr> <tr><td>lazer</td> <td>Ti:sapphire femtosecond pulse lazer</td> <td>488-nm ve 561-nm LD lazerler</td> <td>488-nm ve 561-nm LD lazer</td></tr> <tr><td>O bjective lens</td> <td>40 X su-daldırma objektif lens (NA = 1,15) daldırma orta ile</td> <td>60 X silikon yağı daldırma objektif lens (NA 1,30 =), bir Piezo odak sürücüde takılı</td> <td>40 X objektif lens (NA = 0,95)</td></tr> <tr><td>Algıla veya</td> <td>dış descanned sigara GaAsP Devresel_ödeme dedektörü</td> <td>EMCCD kamera</td> <td>EMCCD kamera</td></tr> <tr><td>Dichroic ayna</td> <td>DM495 ve DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>filtre</td> < td > bant geçiren Filtre; 534/30 nm ve 578/105 nm</td> <td>bant geçiren Filtre; 520/35 nm ve 593/46 nm</td> <td>bant geçiren Filtre; 520/50 nm ve 617/73 nm</td></tr> <tr><td>z ekseni boyunca dilim</td> <td>31 z-Baca'ya 1 µm aralıkları</td> <td>17 z-Baca'ya 3 µm Inter vals</td> <td>7 z-Baca'ya 5-µm aralıkları</td></tr> <tr><td>zaman aralığı</td> <td>20 dk</td> <td>5 dk</td> <td>10 min</td></tr></tbody></table> Tablo 1: Mikroskop sistemleri ve bu el yazması kullanılan ayarları. 
Parametreleri ve mikroskoplar çeşitlidir ve böylece her kullanıcı deney için uygun sistemi seçmelisiniz.
<ol start="3"> <li>elde edilen görüntü sırası kontrol ve .avi ya da .mov sunu için gibi genel film biçime dönüştürmek. 
	Not: belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı görüntüleri bir film biçimi olarak çıktı olamaz eğer mümkün .tif görüntüleri kaydetmek ve sonra onları ImageJ, açık kaynaklı bir program tarafından NIH görüntü dosya türünü değiştirmek için ilham açın. ImageJ adlı sağlanır: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ bir Z-s yapmak için de kullanılabilir.Film, maksimum yoğunluk projeksiyon gibi açıklandığı gibi tuck: https://imagej.net/Z-functions.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).</li><li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH.">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li><li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+(Oryza+sativa+L.).">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li><li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+double+fertilization+in+Nicotiana+tabacum+(L.):+the+role+of+cell+volume+in+cell+fusion.">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li><li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+double+fertilization+and+the+cell+cycle+in+male+and+female+gametes+of+tobacco.">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li><li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants.">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li><li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules.">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li><li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li><li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microcage+arrays+to+fix+plant+ovules+for+long-term+live+imaging+and+observation.">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li><li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote.">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li><li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana.">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu el yazması zigotları ve embriyo geliştirme canlı hücre görüntülemede etkilidir bir basit vitro ovule ekimi protokol tanıttı.
PDMS aygıt tasarım optimizasyonu embriyo sahne göre gerekebilir. Bir microcage dizi yönlendirmesini ayarlamak için ve ovules9konumunu düzeltmek için ilk geliştirilen cihaz olduğunu ve o zaman micropillar aygıt ovules daha verimli bir şekilde yakalamak için inşa edilmiş8. Ayrıca, micropil...

Bir organizmanın temel vücut planı tek hücreli bir zigot geliştirir. Çoğu çiçekli bitkilerde bir apikal ve ateş ve kök, sırasıyla1geliştirmek bir Bazal Hücre zygotic bölümü oluşturur. Bu nedenle, bitki vücut embriyogenez sırasında nasıl oluştuğunu anlamak önemlidir, ancak değil onlar derin çiçek geliştirmek çünkü doğrudan oturma zigotları ve embriyo dinamiklerini gözlemlemek için etkili bir araç olmuştur. Mısır ve pirinç, gibi birçok monocot türü bir vitro fertilizasyon yöntemi kurulan2,3olmuştur. Bu yöntemde, izole sperm ve yumurta hücreleri elektriksel olarak veya kimyasal olarak erimiş ve oluşturulan hücre bereketli bir bitki gelişebilir. Ancak, dicot bitkiler, uygun embriyolar, muhtemelen kadın ve erkek gamet4,5senkronize olmayan hücre döngüsü durumu nedeniyle üretebilir yok vitro fertilizasyon yöntemi yoktur. Buna ek olarak, embriyo çevreleyen doku (endosperm) embriyo gelişimi6' önemli rol oynar.
Bir modeli dicot tür, A. thaliana, vitro ekimi yöntemi embriyo ve endosperm7içeren tüm ovule üzerinde odaklanarak tarafından geliştirilmiştir. Bu sistem başarıyla embriyogenez çeşitli kimyasal reaktifler etkilerini çözümlemek için kullanılan, ancak düşük sağkalım oranı olduğundan zaman hata görüntüleme için uygun değildir. Bu nedenle, bir roman vitro ovule yetiştirme sistemi zigot sahne olarak erken başlamak ve yüksek oranı8bereketli bitkiler üretmek amacıyla geliştirilmiştir. Çeşitli denemeler sonra o Nitsch orta bulundu ve trehalose ovules8survival oranı önemli ölçüde geliştirilmiş. Buna ek olarak, bu büyür ve bu nedenle sık sık mikroskop gözlem alanı uzak taşır ovule genişletir çünkü PDMS aygıt ovule orta9' düzeltmek için geliştirilmiştir. PDMS aygıt bir zigot geliştirmeden kalp-sahne embriyo için izlemek yeterli için 3-4 gün, uzun vadeli görüntüleme etkin. Bu yöntemi kullanarak, zigot polarizasyon ve biçimlenme, sadece normal koşullar altında ama aynı zamanda kimyasal inhibitörleri varlığında veya çeşitli mutant arka planlar8,10 embriyo dinamiklerini görselleştirmek mümkün olur ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
Resim 1: Belirli floresan zigotları görselleştirmek ve Ovule aracılığıyla embriyolar için kullanılan veri işaretleyicilerini şematik diyagramı. Derin çiçek içinde oluşturulan ovule bir embriyo içine Arabidopsis zigot geliştirir. Bu vitro yetiştirme sisteminde zigot ve embriyo ile ovule gözlenir ve böylece diğer ovule dokularda ifade değil belirli floresan işaretçileri kullanmak önemlidir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table width="606">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Nitsch basal salt mixture</td>
			<td style="width:104px;">Duchefa</td>
			<td style="width:119px;">N0223</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">206-18455</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">MES</td>
			<td style="width:104px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">345-01625</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Gamborg&#8217;s vitamin solution</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">35-mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">D111300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430588</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">PDMS</td>
			<td style="width:104px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">76 &#215; 26 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">S1225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">18 &#215; 18 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">C018181</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">needle (gauge 0.40mm)</td>
			<td style="width:104px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-2719S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td style="width:104px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">444969-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">A1R MP</td>
			<td style="width:104px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="width:216px;height:84px;">CSU-W1</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">CV1000</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;">CV1000-SP84</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana

Çoğu çiçekli bitkiler, zigot ve embriyo anne dokuda derin gizlenir ve böylece uzun nasıl dinamik olarak geliştirmek bir gizem olmuştur; Örneğin, nasıl vücut eksen kurmak için zigot polarizes ve nasıl embriyo organ oluşumu sırasında çeşitli hücre kaderi belirtir. Bu el yazması bir vitro ovule kültür yöntemi zigotları ve embriyoların Arabidopsis thalianageliştirme canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek için açıklar. En iyi duruma getirilmiş ekimi orta zigotları veya erken embriyo bereketli bitkiler büyümek için izin verir. Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar dizi aygıtı ile birleştirerek, ovule aynı konumda sıvı ortamda tutulur. Bu fiksasyon bir mikroskop altında aynı ovule geç embriyo aşamasına zygotic bölümden birkaç gün gözlemlemek çok önemlidir. Elde edilen canlı hücre görüntüleme zigot polarizasyon, nükleer geçiş ve sitoiskeleti düzenlenmesi ve aynı zamanda hücre bölünmesi zamanlama ve hücre kader belirtimi embriyo desenlendirme sırasında gibi gerçek zamanlı dinamikleri izlemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu ovule yetiştirme sistemi çeşitli faktörlerin etkilerini embriyo gelişimini incelemek için önleyici tedaviler ile ve hücre-hücre iletişim rolü incelemek için lazer bozulma gibi optik manipülasyonlar ile birleştirilebilir.

Bu ovule yetiştirme sistemi kullanarak, bu yöntem zigot polarizasyon ve embriyo desenlendirme yaşam dinamikleri izleyebilirsiniz. Daha önce yoktu çünkü gerçek zamanlı davranışı anne dokuda derin gizli olan zigot ve embriyo, görselleştirmek için hiçbir teknik bir başarı 's. Şekil 3A ve tamamlayıcı Video 1 genç zigot içinde mikrotübüller (MTs) subapical bölge10enine bir halka olarak birikir gös...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Bu el yazması Arabidopsis zigotları ve embriyo canlı hücre görüntüleme sağlar bir vitro ovule yetiştirme yöntemini açıklar. Bu yöntem sırasında zigot polarizasyon hücre içi dinamikleri ve gelişmekte olan embriyo hücre kader belirtimi görselleştirmek için kullanılmaktadır.

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

in-vitro-ovule-cultivation-for-live-cell-imaging-zygote-polarization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

10.8K Görüntüleme.  Nagoya University. Bu el yazması Arabidopsis zigotları ve embriyo canlı hücre görüntüleme sağlar bir vitro ovule yetiştirme yöntemini açıklar. Bu yöntem sırasında zigot polarizasyon hücre içi dinamikleri ve gelişmekte olan embriyo hücre kader belirtimi görselleştirmek için kullanılmaktadır.

Video: In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Gelişim Biyolojisi

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Canlı Görüntüleme Olgun Myofibers İn Vitro Farklılaşma içinde

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

Kitle yalıtım ve Intramolluscan insan kan Fluke Schistosoma Mansoni aşamalarında Vitro ekimi

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

En düşük Invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...