EJV Amerika Crohn &amp; Kolit Vakfı (CCFA) bir burs ile desteklenmektedir. JRM CCFA, Kanser Araştırma Enstitüsü (CRI), Howard H. Goodman&#39;ın (MGH), Massachusetts Yaşam Bilimleri Merkezi (MLSC) ve NIH Müdürü Yeni Yenilikçisi Ödülü hibe tarafından desteklenmektedir.

1. gut-homing ve kontrol T hücrelerinin ex vivo nesil (bkz. Şekil 1) <ol><li> Vahşi tip farelerin dalak bir ezme splenositlerin izole edin. 5 &#39;400 x g. hücreler PBS içinde süspansiyon ve santrifüj yeniden süspanse Süpernatantı ve kırmızı kan hücreleri, 2-3 dakika için ACK lizis tamponu 4 ml hücre pelletini resuspending lyse. Bundan sonra, 5 ml PBS ekleyin. 400 xg&#39;de 5 &#39;Santrifüj ve supernatant çıkarın. </li><li> 1 toplam splenositlerin süspanse edin x 10 6 / mL IMDM +% 10 FBS + 50 mM 2-merkaptoetanol + penisilin / streptomisin (tam IMDM). RA (ya da, Am80 ya da Am580 olarak sentetik RAR-agonistleri) 100-200 nM 3 final konsantrasyon ile desteklenmiş bir tanesi iki grup, hücrelerin ayırın . RA varlığı veya RAR-agonistler aktive T hücreleri a4b7and CCR9 upregüle ve RA olmaksızın aktive T hücreleri, T hücreleri kontrol olacak iken, gut-tropik T hücreleri haline gelecektir. </li><li> 1.5-2.0 ml hücre süspansiyonu her bir kuyu için önceden anti-CD3 (10 mg / ml) ve anti-CD28 (10 mg / ml) ile kaplı bir 24 plaka ekleyin ve 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 (plaka kaplama için 500 ml / anti-CD3 artı 37 az 2 saat, PBS ve inkübe anti-CD28 eklemek ° C ve daha sonra iki kez 2 ml PBS ile yıkama ). </li><li> T hücre aşırı uyarılma önlemek için, 2-3 gün sonra, yeni bir kaplanmamış 24 plaka içine hücre süspansiyonları transfer. Ek 2-3 gün inkübe edin. Hücre yoğunluğu ve çoğalması bağlı medya taze tam IMDM medyanın yarısını değiştirmek için gerekli olabilir, bu durumda asit (sarı), haline gelebilir. 4-5 gün sonra (gün 0 sayılarak) hücrelerinin Hasat. </li><li> Tipik nihai verim x 10 6 efektör T hücreleri / iyi 1-2. Bu nedenle, her gut-tropik T hücreleri ve kontrol T hücreleri 9-12 kuyuların bir durum başına 10-20 x 10 6 T hücreleri ile sonuna kadar en az kaplama olmalıdır . </li></ol> 2. Gut-homing reseptörleri aktive T hücreleri Analizi Kültür 4-5 gün sonra biz kontrolü T hücreleri, bu reseptörlere 4 çok düşük düzeylerde ifade gerektiğinden, RA veya RAR agonistlerin varlığında aktive T hücreleri üzerindeki gut-homing reseptörleri a4b7and CCR9 yüksek bir ifade dikkat etmelisiniz . Flow sitometri (FACS) analizi. <ol><li> 300 gr az 5 dakika, 0.2-0.5 x10 6 hücre ve santrifüj arasında toplayın 4 ° C </li><li> 15 dakika 4 ° C karanlıkta için anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) ve anti-CD8-PercP ile inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan sonra, g 4 ° C 300 5 dakika santrifüj Yıkayın ve tekrar süspansiyon hücreleri tampon boyama ve FACS tarafından analiz. </li></ol> 3. T hücre, KAKE ve CMTMR hücre izci ile etiketleme <ol><li> 37 tüm çözümler tutun ° C başlamadan önce. PBS ile iki kez yıkayın gut-tropik T hücreleri (a4b7 Yüksek CCR9 Yüksek) ve kontrol T hücreleri (a4b7 / Düşük Neg CCR9 / Düşük Neg) serum kaldırmak için . T hücre konsantrasyonu 10-15 PBS içinde x 10 6 / mL ayarlayın. </li><li> Yavaşça girdap ve 20 dakika boyunca inkübe, sırasıyla, 5 mM ve 10 mM nihai konsantrasyonu gut-tropik T ve kontrolü T hücreleri ya KAKE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) veya CMTMR (klorometil benzoil-amino-tetramethylrhodamine) fluorophores ekle 37 ° C T hücre göç fluorophores potansiyel intrensek etkileri ekarte etmek için, aynı ya da ayrı bir deneyde labelings takas etmek için tavsiye edilir. </li><li> Inkübasyondan sonra, oda sıcaklığında 1-5 dakika FBS ve inkübe 1 hacim ile soğutun. Sulandırınız sıcak PBS ile 10 kat ve 300 g az 5 dakika santrifüj PBS ile tekrar süspansiyon ile tam IMDM iki kez yıkayın. </li><li> İdeal olarak, her T nüfusunun 10-20 x 10 6 hücre 1:1 oranında karıştırılır ve daha sonra 5 dakika süreyle 300 xg santrifüj edilmelidir . Son olarak, 200-250 ml sıcak PBS hücrelerin tekrar süspansiyon ve kuyruk damar yoluyla enjekte. </li><li> Tam giriş oranı (1 ideal yakın) hesaplamak için 5-10 ml enjekte edilen hücre süspansiyonu kaydetmek ve seyreltik ve 300 ml PBS ile FACS tarafından analiz. </li></ol> 4. Homing T hücre analizi Fareler çeşitli zaman noktalarında (1 saat sonrası birkaç gün T hücre enjeksiyonu arasında) analiz edilebilmesine rağmen, gut-tropik T hücreleri sahipliği, 12-24 saat sonrası enjeksiyon arasında en iyi belgelenmiştir. Daha uzun zaman noktalarında numaraları / oranları, son hücre gibi T hücre apoptoz ve doku T hücre çıkış olarak etkileyen diğer değişkenlerin potansiyel etkilerini artırabilir. Fareler, hücre ölümünü azaltmak için çeşitli dokulardan ötenazi, hücre süspansiyonları gecikmeksizin izole edilmelidir sonra, nihai verim ve sonuçları etkileyebilir. Ilgi dokular ince bağırsak, kalın barsak, dalak, lenf düğümleri, Peyer Kullanıcı yamaları, karaciğer, akciğer ve kan vardır. Eğeriyi niyetli gut-tropik T hücreleri enjekte T hücreleri, T hücreleri kontrol etmek için karşılaştırıldığında, ince bağırsak mukoza için ortalama 5-10 kat daha iyi (veya üstü) eve gerekir. Ancak, kan ve dalak gibi diğer dokularda, tercihli bir T hücre migrasyonu göstermezler. Bağırsak lamina propria ve intraepitelyal bölmesi lenfositler İzolasyon, daha önce 5 tarif edilmiştir. <ol><li> FACS boyama: Örnekler hücre sayısı 3.0 x 10 6 hücre / ml &#39;den yüksek bir yoğunlukta, toplanan bağlı olarak yeniden süspanse. Eğer congenic CD45.1 + veya Thy1.1 + fareler alıcıları olarak kullanılan, hücrelerin bazı soy işaretleyici (örneğin, TCRbchain, CD4, CD8 ile birlikte ilgili congenic işaretleyici (örneğin, CD45.2 veya Thy1.2) ile boyandı. , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> FACS analizi sırasında, hücreler congenic marker (örneğin CD45.1) ve daha sonra belirli soy belirteçleri (örneğin CD4/CD8) kapılı ve CMTMR ve KAKE pozitif hücreler arasındaki oranların analiz. </li><li> Veriler genellikle ilgili giriş oranı (aşağıya bakın) bölünmesiyle her doku oranı KAKE / CMTMR (veya CMTMR / KAKE) olarak hesaplanan Homing Endeksi (HI), olarak ifade edilir. Giriş oranı 1 çok yakın ise, doku oranları HI eşdeğer olacaktır. </li></ol> HI = KAKE doku / CMTMR doku: KAKE giriş / CMTMR girdi Kan aynı zamanda her iki T hücre popülasyonlarının eşit dolaşımda temsil veya diğer ilgili (örneğin, akciğerlerin / karaciğer tercihli yakalama veya azalmış canlılığı ile) bir T hücre popülasyonunun azalmış ise olmadığını belirlemek için analiz edilmelidir. Ikincisi akciğerlerde büyük ölçüde sıkışıp olabilir bu yana, naif ya da dinlenme bellek T hücrelerine karşı son zamanlarda aktif efektör T hücreleri karşılaştırırken bu durum meydana gelebilir. Kan HI 1 den önemli ölçüde farklı ise, bir dokularda kan HI HI normalize. Kan anestezi farelerin kalp ponksiyon (AVERTIN veya isofluorane önce ötanazi ile) yoluyla elde edilebilir ve FACS boyama için ACK tampon kullanmadan önce iki kez parçalanmış olmalıdır. Kan normalleşme = HI doku / HI Kan 5. Temsilcisi Sonuçlar Alıcı fareler (Thy1.1 +) euthanized18h yazılan hücre enjeksiyonu. Hücre süspansiyonları, dalak, periferik lenf düğümleri (PLN), mezenterik lenf düğümleri (MLN) ve ince bağırsakta lamina propia (LP) oluşturulmuştur. Thy1.2 ve CD8 hücreleri lekeli ve sonra nihayet CMTMR + hücreleri (gut-tropik T hücreleri) ve KAKE arasındaki oranı analiz edildi yaşayabilir Thy1.2 + CD8 + hücreler, yolluk FACS tarafından analiz edildi Bundan sonra + giriş oranı ile bölünen hücrelerden (kontrol T hücreleri). Sonuçları Şekil 2, gut-tropik ve kontrol T hücreleri, dalak (HI, kırmızı bir çizgi ile gösterilir 1&#39;e yakın) eşit girişli olduğu takdir edilebilir olduğu gösterildiği gibi gösterilebilir . Buna karşılık, gut-tropik T hücreleri, T hücreleri kontrol ile karşılaştırıldığında LP yaklaşık 10 kat daha verimli bir şekilde göç. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Diyagram gut-tropik ve tropik T hücreleri-gut olmayan üretim ve etiketleme gösteren T hücreleri vahşi tip farelerden izole ve anti-CD3/anti-CD28 100-200 nM varlığı ya da yokluğu ile aktive edilir - trans retinoik asit (RA). 4-5 gün sonra RA-tedavi T hücre bağırsak homing reseptörleri CCR9 ve a4b7 ifade kazanır. Daha sonra, gut-tropik ve kontrol T hücreleri farklı bir 1:1 oranında karıştırılır ve bir alıcı fare kuyruğu damar yoluyla enjekte, yıkanmış, KAKE veya CMTMR etiketlenir. Bazı etiketli hücrelerin KAKE / CMTMR giriş oranı (1&#39;e yakın olmalı) belirlemek için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: Örnek homing analiz Fare ilgi organları 12-18 saat sonrası T hücre enjeksiyonu ve tek hücre süspansiyonları elde edilen analiz etti. Hücreler, sonra da anti-Thy1.2 (congenic işaretleyici) artı anti-CD8 ve Thy1.2 lekeli + CD8 + T hücreleri CMTMR oranı analiz ve KAKE + + FACS tarafından her doku hücreleri . Sonra doku CMTMR / KAKE oranları homing indeksi (HI) elde etmek için Giriş CMTMR / KAKE oranına göre normalize edilir. Bu örnekte CMTMR + ve KAKE + hücrelerin sırasıyla gut-tropik ve kontrol efektör T hücreleri vardır.

<ol>
	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

Homing deneyler herhangi bir doku toplam hücre popülasyonlarının göç hakkında çok değerli bilgiler sunmak olsa da, bu testlerin doğrudan endotel adezyonu analiz ve bu nedenle ayrımcılık akılda tutulması olmalıdır adımlı yapışma adım (lar) cascade (bağlama / haddeleme, aktivasyon veya yapışmasını) belirli bir homing reseptör davranmaktadır. Yapışma kaskad homing reseptörlerin belirli bir rolü tanımlamak için altın standart, bireysel floresan etiketli T hücreleri (veya hatta floresan i...

Hayvanlar: C57BL / 6 farelerde T hücre izolasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. Buna ek olarak, CD45.1 ve Thy1.1 congenic suşları Jackson Laboratuvarları (Bar Harbor, ME) ile mevcuttur. Kültür medya: IMDM (Iscove Kullanıcı Modifiye Dulbecco&#39;nun Kullanıcı Orta + L-Glutamine + HEPES) artı 10% ısı-inaktive 100 U / ml penisilin ile desteklenmiş FBS (fetal sığır serumu, düşük endotoksin, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 mg / ml streptomisin (HyClone Antibiyotikler, Waltham, MA), 0.5 mg / ml fungizone / amfoterisin B (Gibco) ve 50 mM b-mercaptoethanol. ACK Kırmızı Kan Hücresi Lizis tamponu (RBC, 10 mM KHCO 3, 150 mM NH 4 Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)), pH 7,2-7,4 ve oda sıcaklığında saklayın ayarlayabilirsiniz. PBS (Fosfat Tuzlu, Hyclone, Waltham, MA Tamponlu). Flow sitometri (FACS) medya (PBS veya IMDM +% 2 FBS + 5 mM EDTA). 2 mM Ca selektin-Fc kimeralar, medya kullanılarak boyama + + (FACS satın alma da dahil olmak üzere) tüm adımları kullanılmalıdır. Bu durumda IMDM tavsiye edilir. T hücre etiketleme ve evlatlık transferi: KAKE (carboxyfluorescein diasetat, succinimidyl ester), CMTMR - Molecular Probes ((5 (6 )-((( 4-klorometil) benzoil) amino) tetramethylrhodamine) ®, Invitrogen, Carlsbad, CA .) 1000 x stokları DMSO (5 mM KAKE, 20 mM CMTMR) ve -20 ° C&#39;de saklanan olmalıdır Poliklonal T hücre aktivasyonu: 24-iyi ya da 96-iyi tabak (doku kültürü tedavi, düz bir kapak ile alt polistiren, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) ° C ile 50 ml PBS, sırasıyla 37 az 2 saat süreyle inkübe , anti-CD3 artı anti-CD28 antikorları (10 mg / ml) içeren. Sonra, kültür plakaları PBS ile iki kez yıkanır ve T hücre kültürü için hemen kullanılabilir. Alternatif olarak, anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) ile kaplı Dynabeads plaka bağlı antikorlar yerine T hücre aktivasyonu için kullanılabilir. Flow sitometri (FACS) boyama: Poliklonal aktivasyon: CD3 (1452C11), CD28 (37,51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2) CD45.2 (104). Gut-homing reseptörleri: saflaştırılmış CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), izotip kontrolü (IgG2a k). Cilt homing reseptörleri: P-selektin-Fc (Saflaştırılmış Fare P-selektin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selektin-Fc (Rekombinant Fare E-Selectin/Fc Chimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) artı karşılık gelen ikincil reaktif keçi F (ab &#39;) 2 anti-insan IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). All-trans retinoik asit (Sigma, St Louis, MO) hazırlanması sırasında bir sarı ampul veya dolaylı bir ışık kaynağı kullanarak mutlak etanol veya DMSO yeniden süspanse. -80 Cam şişeleri saklayın alikotları ° C ve her zaman ışıktan korunmalıdır. Sentetik RAR-agonistler: Am80 (Wako Kimyasallar, Richmond, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

Altına almak üzere fonksiyon lenfositler, kan terk ve vücudun farklı dokulara göç etmek gerekir. Endotel hücreleri ve doku ekstravazasyonu Lenfosit yapışır lenfositler ve endotel hücreleri 1 2 görüntülenen kendi ligandlar (addressins) ifade farklı adezyon molekülleri tarafından kontrol edilen çok adımlı bir süreç (homing reseptörler). Bu adezyon reseptörlerinin fonksiyon kısmen çalışılan rağmen ex vivo, in vivo lenfosit yapışma ve göç sırasında fizyolojik alaka için nihai test rollerini değerlendirmek için. Intravital mikroskobu (IVM) ve homing deneyler: İki tamamlayıcı stratejiler, bu amaç için kullanılır olmuştur. IVM yapışma kaskad sırasında gerçek zamanlı olarak ve farklı dokularda spesifik adezyon reseptörleri kesin katkısını tanımlamak için gerekli olmasına rağmen, IVM, yoğun zaman alıcı ve emek, genellikle gelişmiş cerrahi tekniklerin geliştirilmesini gerektirir, homojen önceden izolasyon ihtiyacı hücre popülasyonlarının ve herhangi bir zamanda sadece bir doku / organ analizine izin verir. Buna karşılık, rekabetçi homing deneyler aynı fare göç iki (hatta daha fazla) hücre alt direkt ve eş zamanlı karşılaştırma izin verir ve onlar da birçok dokuların ve hücrelerin aynı deneyi bir yüksek sayıda analiz izin. Burada bir kontrol hücre popülasyonu ile karşılaştırıldığında belirli dokulara belirli bir hücre tipi avantajı / dezavantajı belirlemek için kullanılan klasik rekabetçi homing protokol açıklar. Bağırsak mukozasının dış çevre ile temas halinde büyük vücut yüzey, çünkü, gut-tropik karşı gut-tropik olmayan T hücreleri göçmen özelliklerini göstermek için seçti ve aynı zamanda iyi tanımlanmış göçmen gereksinimleri ile ekstra-lenfoid doku . Ayrıca son çalışma, vitamin A metabolit all-trans retinoik asit (RA) lenfositler gut-spesifik adezyon reseptörleri (integrin a4b7and kemokin reseptör CCR9) uyarılacak sorumlu başlıca moleküler mekanizma olduğunu belirlemiştir. Bu yüzden, kolayca sonunda, burada açıklanan rekabetçi homing deneylerde kullanılabilecek, sırasıyla, RA varlığı ya da yokluğu T hücreleri aktive ederek, gut-tropik ve lenfositler gut-tropik olmayan ex vivo çok sayıda üretebilirsiniz.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Rekabetçi homing deneyler, doğrudan tek bir fare iki farklı hücre popülasyonlarının göçmen özelliklerinin değerlendirilmesi için izin verir. Burada oluşturulan ex vivo gut-tropik karşı-gut olmayan tropik T hücreleri göç karşılaştırarak bu yordamı göstermektedir.

Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

competitive-homing-assays-to-study-gut-tropic-t-cell-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Rekabetçi homing deneyler, doğrudan tek bir fare iki farklı hücre popülasyonlarının göçmen özelliklerinin değerlendirilmesi için izin verir. Burada oluşturulan ex vivo gut-tropik karşı-gut olmayan tropik T hücreleri göç karşılaştırarak bu yordamı göstermektedir.