EJV Amerika Crohn &amp; Kolit Vakfı (CCFA) bir burs ile desteklenmektedir. JRM CCFA, Kanser Araştırma Enstitüsü (CRI), Howard H. Goodman&#39;ın (MGH), Massachusetts Yaşam Bilimleri Merkezi (MLSC) ve NIH Müdürü Yeni Yenilikçisi Ödülü hibe tarafından desteklenmektedir.

1. gut-homing ve kontrol T hücrelerinin ex vivo nesil (bkz. Şekil 1) <ol><li> Vahşi tip farelerin dalak bir ezme splenositlerin izole edin. 5 &#39;400 x g. hücreler PBS içinde süspansiyon ve santrifüj yeniden süspanse Süpernatantı ve kırmızı kan hücreleri, 2-3 dakika için ACK lizis tamponu 4 ml hücre pelletini resuspending lyse. Bundan sonra, 5 ml PBS ekleyin. 400 xg&#39;de 5 &#39;Santrifüj ve supernatant çıkarın. </li><li> 1 toplam splenositlerin süspanse edin x 10 6 / mL IMDM +% 10 FBS + 50 mM 2-merkaptoetanol + penisilin / streptomisin (tam IMDM). RA (ya da, Am80 ya da Am580 olarak sentetik RAR-agonistleri) 100-200 nM 3 final konsantrasyon ile desteklenmiş bir tanesi iki grup, hücrelerin ayırın . RA varlığı veya RAR-agonistler aktive T hücreleri a4b7and CCR9 upregüle ve RA olmaksızın aktive T hücreleri, T hücreleri kontrol olacak iken, gut-tropik T hücreleri haline gelecektir. </li><li> 1.5-2.0 ml hücre süspansiyonu her bir kuyu için önceden anti-CD3 (10 mg / ml) ve anti-CD28 (10 mg / ml) ile kaplı bir 24 plaka ekleyin ve 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 (plaka kaplama için 500 ml / anti-CD3 artı 37 az 2 saat, PBS ve inkübe anti-CD28 eklemek ° C ve daha sonra iki kez 2 ml PBS ile yıkama ). </li><li> T hücre aşırı uyarılma önlemek için, 2-3 gün sonra, yeni bir kaplanmamış 24 plaka içine hücre süspansiyonları transfer. Ek 2-3 gün inkübe edin. Hücre yoğunluğu ve çoğalması bağlı medya taze tam IMDM medyanın yarısını değiştirmek için gerekli olabilir, bu durumda asit (sarı), haline gelebilir. 4-5 gün sonra (gün 0 sayılarak) hücrelerinin Hasat. </li><li> Tipik nihai verim x 10 6 efektör T hücreleri / iyi 1-2. Bu nedenle, her gut-tropik T hücreleri ve kontrol T hücreleri 9-12 kuyuların bir durum başına 10-20 x 10 6 T hücreleri ile sonuna kadar en az kaplama olmalıdır . </li></ol> 2. Gut-homing reseptörleri aktive T hücreleri Analizi Kültür 4-5 gün sonra biz kontrolü T hücreleri, bu reseptörlere 4 çok düşük düzeylerde ifade gerektiğinden, RA veya RAR agonistlerin varlığında aktive T hücreleri üzerindeki gut-homing reseptörleri a4b7and CCR9 yüksek bir ifade dikkat etmelisiniz . Flow sitometri (FACS) analizi. <ol><li> 300 gr az 5 dakika, 0.2-0.5 x10 6 hücre ve santrifüj arasında toplayın 4 ° C </li><li> 15 dakika 4 ° C karanlıkta için anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) ve anti-CD8-PercP ile inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan sonra, g 4 ° C 300 5 dakika santrifüj Yıkayın ve tekrar süspansiyon hücreleri tampon boyama ve FACS tarafından analiz. </li></ol> 3. T hücre, KAKE ve CMTMR hücre izci ile etiketleme <ol><li> 37 tüm çözümler tutun ° C başlamadan önce. PBS ile iki kez yıkayın gut-tropik T hücreleri (a4b7 Yüksek CCR9 Yüksek) ve kontrol T hücreleri (a4b7 / Düşük Neg CCR9 / Düşük Neg) serum kaldırmak için . T hücre konsantrasyonu 10-15 PBS içinde x 10 6 / mL ayarlayın. </li><li> Yavaşça girdap ve 20 dakika boyunca inkübe, sırasıyla, 5 mM ve 10 mM nihai konsantrasyonu gut-tropik T ve kontrolü T hücreleri ya KAKE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) veya CMTMR (klorometil benzoil-amino-tetramethylrhodamine) fluorophores ekle 37 ° C T hücre göç fluorophores potansiyel intrensek etkileri ekarte etmek için, aynı ya da ayrı bir deneyde labelings takas etmek için tavsiye edilir. </li><li> Inkübasyondan sonra, oda sıcaklığında 1-5 dakika FBS ve inkübe 1 hacim ile soğutun. Sulandırınız sıcak PBS ile 10 kat ve 300 g az 5 dakika santrifüj PBS ile tekrar süspansiyon ile tam IMDM iki kez yıkayın. </li><li> İdeal olarak, her T nüfusunun 10-20 x 10 6 hücre 1:1 oranında karıştırılır ve daha sonra 5 dakika süreyle 300 xg santrifüj edilmelidir . Son olarak, 200-250 ml sıcak PBS hücrelerin tekrar süspansiyon ve kuyruk damar yoluyla enjekte. </li><li> Tam giriş oranı (1 ideal yakın) hesaplamak için 5-10 ml enjekte edilen hücre süspansiyonu kaydetmek ve seyreltik ve 300 ml PBS ile FACS tarafından analiz. </li></ol> 4. Homing T hücre analizi Fareler çeşitli zaman noktalarında (1 saat sonrası birkaç gün T hücre enjeksiyonu arasında) analiz edilebilmesine rağmen, gut-tropik T hücreleri sahipliği, 12-24 saat sonrası enjeksiyon arasında en iyi belgelenmiştir. Daha uzun zaman noktalarında numaraları / oranları, son hücre gibi T hücre apoptoz ve doku T hücre çıkış olarak etkileyen diğer değişkenlerin potansiyel etkilerini artırabilir. Fareler, hücre ölümünü azaltmak için çeşitli dokulardan ötenazi, hücre süspansiyonları gecikmeksizin izole edilmelidir sonra, nihai verim ve sonuçları etkileyebilir. Ilgi dokular ince bağırsak, kalın barsak, dalak, lenf düğümleri, Peyer Kullanıcı yamaları, karaciğer, akciğer ve kan vardır. Eğeriyi niyetli gut-tropik T hücreleri enjekte T hücreleri, T hücreleri kontrol etmek için karşılaştırıldığında, ince bağırsak mukoza için ortalama 5-10 kat daha iyi (veya üstü) eve gerekir. Ancak, kan ve dalak gibi diğer dokularda, tercihli bir T hücre migrasyonu göstermezler. Bağırsak lamina propria ve intraepitelyal bölmesi lenfositler İzolasyon, daha önce 5 tarif edilmiştir. <ol><li> FACS boyama: Örnekler hücre sayısı 3.0 x 10 6 hücre / ml &#39;den yüksek bir yoğunlukta, toplanan bağlı olarak yeniden süspanse. Eğer congenic CD45.1 + veya Thy1.1 + fareler alıcıları olarak kullanılan, hücrelerin bazı soy işaretleyici (örneğin, TCRbchain, CD4, CD8 ile birlikte ilgili congenic işaretleyici (örneğin, CD45.2 veya Thy1.2) ile boyandı. , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> FACS analizi sırasında, hücreler congenic marker (örneğin CD45.1) ve daha sonra belirli soy belirteçleri (örneğin CD4/CD8) kapılı ve CMTMR ve KAKE pozitif hücreler arasındaki oranların analiz. </li><li> Veriler genellikle ilgili giriş oranı (aşağıya bakın) bölünmesiyle her doku oranı KAKE / CMTMR (veya CMTMR / KAKE) olarak hesaplanan Homing Endeksi (HI), olarak ifade edilir. Giriş oranı 1 çok yakın ise, doku oranları HI eşdeğer olacaktır. </li></ol> HI = KAKE doku / CMTMR doku: KAKE giriş / CMTMR girdi Kan aynı zamanda her iki T hücre popülasyonlarının eşit dolaşımda temsil veya diğer ilgili (örneğin, akciğerlerin / karaciğer tercihli yakalama veya azalmış canlılığı ile) bir T hücre popülasyonunun azalmış ise olmadığını belirlemek için analiz edilmelidir. Ikincisi akciğerlerde büyük ölçüde sıkışıp olabilir bu yana, naif ya da dinlenme bellek T hücrelerine karşı son zamanlarda aktif efektör T hücreleri karşılaştırırken bu durum meydana gelebilir. Kan HI 1 den önemli ölçüde farklı ise, bir dokularda kan HI HI normalize. Kan anestezi farelerin kalp ponksiyon (AVERTIN veya isofluorane önce ötanazi ile) yoluyla elde edilebilir ve FACS boyama için ACK tampon kullanmadan önce iki kez parçalanmış olmalıdır. Kan normalleşme = HI doku / HI Kan 5. Temsilcisi Sonuçlar Alıcı fareler (Thy1.1 +) euthanized18h yazılan hücre enjeksiyonu. Hücre süspansiyonları, dalak, periferik lenf düğümleri (PLN), mezenterik lenf düğümleri (MLN) ve ince bağırsakta lamina propia (LP) oluşturulmuştur. Thy1.2 ve CD8 hücreleri lekeli ve sonra nihayet CMTMR + hücreleri (gut-tropik T hücreleri) ve KAKE arasındaki oranı analiz edildi yaşayabilir Thy1.2 + CD8 + hücreler, yolluk FACS tarafından analiz edildi Bundan sonra + giriş oranı ile bölünen hücrelerden (kontrol T hücreleri). Sonuçları Şekil 2, gut-tropik ve kontrol T hücreleri, dalak (HI, kırmızı bir çizgi ile gösterilir 1&#39;e yakın) eşit girişli olduğu takdir edilebilir olduğu gösterildiği gibi gösterilebilir . Buna karşılık, gut-tropik T hücreleri, T hücreleri kontrol ile karşılaştırıldığında LP yaklaşık 10 kat daha verimli bir şekilde göç. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Diyagram gut-tropik ve tropik T hücreleri-gut olmayan üretim ve etiketleme gösteren T hücreleri vahşi tip farelerden izole ve anti-CD3/anti-CD28 100-200 nM varlığı ya da yokluğu ile aktive edilir - trans retinoik asit (RA). 4-5 gün sonra RA-tedavi T hücre bağırsak homing reseptörleri CCR9 ve a4b7 ifade kazanır. Daha sonra, gut-tropik ve kontrol T hücreleri farklı bir 1:1 oranında karıştırılır ve bir alıcı fare kuyruğu damar yoluyla enjekte, yıkanmış, KAKE veya CMTMR etiketlenir. Bazı etiketli hücrelerin KAKE / CMTMR giriş oranı (1&#39;e yakın olmalı) belirlemek için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: Örnek homing analiz Fare ilgi organları 12-18 saat sonrası T hücre enjeksiyonu ve tek hücre süspansiyonları elde edilen analiz etti. Hücreler, sonra da anti-Thy1.2 (congenic işaretleyici) artı anti-CD8 ve Thy1.2 lekeli + CD8 + T hücreleri CMTMR oranı analiz ve KAKE + + FACS tarafından her doku hücreleri . Sonra doku CMTMR / KAKE oranları homing indeksi (HI) elde etmek için Giriş CMTMR / KAKE oranına göre normalize edilir. Bu örnekte CMTMR + ve KAKE + hücrelerin sırasıyla gut-tropik ve kontrol efektör T hücreleri vardır.

<ol>
	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

Homing deneyler herhangi bir doku toplam hücre popülasyonlarının göç hakkında çok değerli bilgiler sunmak olsa da, bu testlerin doğrudan endotel adezyonu analiz ve bu nedenle ayrımcılık akılda tutulması olmalıdır adımlı yapışma adım (lar) cascade (bağlama / haddeleme, aktivasyon veya yapışmasını) belirli bir homing reseptör davranmaktadır. Yapışma kaskad homing reseptörlerin belirli bir rolü tanımlamak için altın standart, bireysel floresan etiketli T hücreleri (veya hatta floresan i...

Hayvanlar: C57BL / 6 farelerde T hücre izolasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. Buna ek olarak, CD45.1 ve Thy1.1 congenic suşları Jackson Laboratuvarları (Bar Harbor, ME) ile mevcuttur. Kültür medya: IMDM (Iscove Kullanıcı Modifiye Dulbecco&#39;nun Kullanıcı Orta + L-Glutamine + HEPES) artı 10% ısı-inaktive 100 U / ml penisilin ile desteklenmiş FBS (fetal sığır serumu, düşük endotoksin, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 mg / ml streptomisin (HyClone Antibiyotikler, Waltham, MA), 0.5 mg / ml fungizone / amfoterisin B (Gibco) ve 50 mM b-mercaptoethanol. ACK Kırmızı Kan Hücresi Lizis tamponu (RBC, 10 mM KHCO 3, 150 mM NH 4 Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)), pH 7,2-7,4 ve oda sıcaklığında saklayın ayarlayabilirsiniz. PBS (Fosfat Tuzlu, Hyclone, Waltham, MA Tamponlu). Flow sitometri (FACS) medya (PBS veya IMDM +% 2 FBS + 5 mM EDTA). 2 mM Ca selektin-Fc kimeralar, medya kullanılarak boyama + + (FACS satın alma da dahil olmak üzere) tüm adımları kullanılmalıdır. Bu durumda IMDM tavsiye edilir. T hücre etiketleme ve evlatlık transferi: KAKE (carboxyfluorescein diasetat, succinimidyl ester), CMTMR - Molecular Probes ((5 (6 )-((( 4-klorometil) benzoil) amino) tetramethylrhodamine) ®, Invitrogen, Carlsbad, CA .) 1000 x stokları DMSO (5 mM KAKE, 20 mM CMTMR) ve -20 ° C&#39;de saklanan olmalıdır Poliklonal T hücre aktivasyonu: 24-iyi ya da 96-iyi tabak (doku kültürü tedavi, düz bir kapak ile alt polistiren, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) ° C ile 50 ml PBS, sırasıyla 37 az 2 saat süreyle inkübe , anti-CD3 artı anti-CD28 antikorları (10 mg / ml) içeren. Sonra, kültür plakaları PBS ile iki kez yıkanır ve T hücre kültürü için hemen kullanılabilir. Alternatif olarak, anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) ile kaplı Dynabeads plaka bağlı antikorlar yerine T hücre aktivasyonu için kullanılabilir. Flow sitometri (FACS) boyama: Poliklonal aktivasyon: CD3 (1452C11), CD28 (37,51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2) CD45.2 (104). Gut-homing reseptörleri: saflaştırılmış CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), izotip kontrolü (IgG2a k). Cilt homing reseptörleri: P-selektin-Fc (Saflaştırılmış Fare P-selektin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selektin-Fc (Rekombinant Fare E-Selectin/Fc Chimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) artı karşılık gelen ikincil reaktif keçi F (ab &#39;) 2 anti-insan IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). All-trans retinoik asit (Sigma, St Louis, MO) hazırlanması sırasında bir sarı ampul veya dolaylı bir ışık kaynağı kullanarak mutlak etanol veya DMSO yeniden süspanse. -80 Cam şişeleri saklayın alikotları ° C ve her zaman ışıktan korunmalıdır. Sentetik RAR-agonistler: Am80 (Wako Kimyasallar, Richmond, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

Altına almak üzere fonksiyon lenfositler, kan terk ve vücudun farklı dokulara göç etmek gerekir. Endotel hücreleri ve doku ekstravazasyonu Lenfosit yapışır lenfositler ve endotel hücreleri 1 2 görüntülenen kendi ligandlar (addressins) ifade farklı adezyon molekülleri tarafından kontrol edilen çok adımlı bir süreç (homing reseptörler). Bu adezyon reseptörlerinin fonksiyon kısmen çalışılan rağmen ex vivo, in vivo lenfosit yapışma ve göç sırasında fizyolojik alaka için nihai test rollerini değerlendirmek için. Intravital mikroskobu (IVM) ve homing deneyler: İki tamamlayıcı stratejiler, bu amaç için kullanılır olmuştur. IVM yapışma kaskad sırasında gerçek zamanlı olarak ve farklı dokularda spesifik adezyon reseptörleri kesin katkısını tanımlamak için gerekli olmasına rağmen, IVM, yoğun zaman alıcı ve emek, genellikle gelişmiş cerrahi tekniklerin geliştirilmesini gerektirir, homojen önceden izolasyon ihtiyacı hücre popülasyonlarının ve herhangi bir zamanda sadece bir doku / organ analizine izin verir. Buna karşılık, rekabetçi homing deneyler aynı fare göç iki (hatta daha fazla) hücre alt direkt ve eş zamanlı karşılaştırma izin verir ve onlar da birçok dokuların ve hücrelerin aynı deneyi bir yüksek sayıda analiz izin. Burada bir kontrol hücre popülasyonu ile karşılaştırıldığında belirli dokulara belirli bir hücre tipi avantajı / dezavantajı belirlemek için kullanılan klasik rekabetçi homing protokol açıklar. Bağırsak mukozasının dış çevre ile temas halinde büyük vücut yüzey, çünkü, gut-tropik karşı gut-tropik olmayan T hücreleri göçmen özelliklerini göstermek için seçti ve aynı zamanda iyi tanımlanmış göçmen gereksinimleri ile ekstra-lenfoid doku . Ayrıca son çalışma, vitamin A metabolit all-trans retinoik asit (RA) lenfositler gut-spesifik adezyon reseptörleri (integrin a4b7and kemokin reseptör CCR9) uyarılacak sorumlu başlıca moleküler mekanizma olduğunu belirlemiştir. Bu yüzden, kolayca sonunda, burada açıklanan rekabetçi homing deneylerde kullanılabilecek, sırasıyla, RA varlığı ya da yokluğu T hücreleri aktive ederek, gut-tropik ve lenfositler gut-tropik olmayan ex vivo çok sayıda üretebilirsiniz.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Rekabetçi homing deneyler, doğrudan tek bir fare iki farklı hücre popülasyonlarının göçmen özelliklerinin değerlendirilmesi için izin verir. Burada oluşturulan ex vivo gut-tropik karşı-gut olmayan tropik T hücreleri göç karşılaştırarak bu yordamı göstermektedir.

Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

competitive-homing-assays-to-study-gut-tropic-t-cell-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Rekabetçi homing deneyler, doğrudan tek bir fare iki farklı hücre popülasyonlarının göçmen özelliklerinin değerlendirilmesi için izin verir. Burada oluşturulan ex vivo gut-tropik karşı-gut olmayan tropik T hücreleri göç karşılaştırarak bu yordamı göstermektedir.

Video: Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Basil Calmette-Guerin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar Yönetim T hücresi kanser antijenleri Reseptör tanıma belirlemek için

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...