Bu araştırma NIH 1R01HL140239-01 tarafından AMC'ye finanse edildi. Drexel Üniversitesi Hücre Görüntüleme Merkezi'ne teşekkür ederiz.

1. Meme Epitel Hücre Büyümesi ve Assay Medya
<ol><li>MCF10A meme epitel hücreleri NOT: Tümörojenik olmayan ölümsüzleştirilmiş meme epitel hücre hattı fibrokistik hastalığı olan bir hastadan türetilmiştir43. Hücreler östrojen reseptörü ifade etmez.<ol>
<li>20 μg/mL epidermal büyüme faktörü (EGF) hazırlamak için, 200 μg/mL EGF yapmak için 500 μL steril dH2O'da 100 μg lyophilized EGF çözün. 20 μg/mL EGF stok çözeltisi yapmak için dH 2 O'da 4,5 mL steril%0,1 BSA'ya 500 μL 200 μg/mL EGF ekleyin. Mağaza 12 aya kadar -20 °C'de 20 μg/mL EGF aliquots hazırladı.</li>
		<li>500 μg/mL hidrokortizon hazırlamak için, 1 mg hidrokortizon 1 mL mutlak etanol (200 kanıt) seyreltin. 500 μg/mL hidrokortizon stok çözeltisi yapmak için bu karışıma 1 mL steril DMEM F:12 ekleyin. Hydrocortisone stok aliquots'u -80 °C'de 12 aya kadar saklayın.</li>
		<li>10 μg/mL kolera toksini hazırlamak için, 1 mg/mL kolera toksin stok çözeltisi yapmak için 1 mg steril dH 2 O'da1mg kolera toksini lyophilized tozunu çözün. Kolera toksin stok aliquotlarını -80 °C'de 12 aya kadar saklayın.</li>
		<li>Growth Medium'u hazırlamak için 500 μL EGF (20 μg/mL), 500 μL hidrokortizon (500 μg/mL), 5 μL kolera toksini (1 mg/mL), 500 μL sığır insülini (10 mg/mL), 10 mL penisilin ve streptomisin ekleyin, ve 20 ng/mL EGF'lik son konsantrasyon için 500 mL DMEM F:12'ye 25 mL at serumu, 500 ng/mL hidrokortizon, 10 ng/mL kolera toksini, 10 ng/mL sığır insülini, %2 v/v penisilin ve streptomisinin ve %5 v/v at serumu. Biyobaskı işleminde sterilitenin azalmasını hesaba katmak için antibiyotik konsantrasyonu% 2'ye yükseltildi; bununla birlikte, antibiyotik konsantrasyonu% 1'e düşürülebilir.</li>
		<li>Assay Medium'u hazırlamak için 500 μL hidrokortizon (500 μg/mL), 5 μL kolera toksini (1 mg/mL), 500 μL sığır insülini (10 mg/mL), 10 mL penisilin ve streptomisin ekleyin, ve 500 mL hidrokortizon, 10 ng/mL kolera toksini, 10 ng/mL sığır insülini, %2 v/v penisilin ve streptomisin ve %5 v/v at serumu için 500 mL'ye 25 mL at serumu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDA-MB-231 NOT: Üç negatif (östrojen reseptörü, progesteron reseptörü ve epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 eksikliği) meme kanseri epitel hücre hattı metastatik meme adenokarsinomlu bir kadın hastanın plevral efüzyonundan oluşturulur44. Hücreler agresif, invaziv ve kötü farklılaşmış bir meme kanserini temsil eder.<ol>
<li>Growth and Assay Medium'ı hazırlamak için 50 mL fetal sığır serumu, 10 mL penisilin ve streptomisine ve 500 mL DMEM'e 25 mL at serumu ekleyerek son konsantrasyon için %10 v/v fetal sığır serumu, %2 v/v penisilin ve streptomisinin ve %5 v/v at serumu ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Meme Epitel Hücre Kültürü
<ol><li>10 mL MCF10A veya MDA-MB-231 büyüme ortamına sahip 10 cm (P100) doku kültürü çanasında tohum 500.000 MCF10A veya MDA-MB-231 hücresi. MCF10A ve MDA-MB-231 hücreleri 48 saat içinde %90 birliğe ulaşır.</li>
	<li>Meme epitel hücrelerini geçirmek için, önce 10 mL sıcak PBS ile hücreleri yıkayın.</li>
	<li>Meme epitel hücrelerini yemeğe %0,05 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyerek ayırın. Yemeği 20-25 dakika boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Trypsin nötralize hücrelerine 5 mL MCF10A veya MDA-MB-231 Growth Medium ekleyin. Hücreleri yeniden gerçekleştirmek ve hücre kümelerini parçalamak için hücre ortamı karışımını yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu 15 mL konik tüpe ve 3 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüje ekleyin. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 5 mL MCF10A veya MDA-MB-231 Growth Medium'da yeniden ıslatın.</li>
	<li>MCF10A veya MDA-MB-231 Growth Medium ile birlikte 5 yeni 10 cm doku kültürü yemeklerinde 1 mL hücre süspansiyonu plakası. Bulaşıkları 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin. Hücreler 2-3 gün içinde tekrar geçişe hazır olacaktır. MCF10A hücreleri 35 numaralı geçişe kadar korunabilir, daha sonra morfolojik değişiklikler gösterirler. MDA-MB-231 hücreleri 24 numaralı geçişe kadar korunabilir, daha sonra morfolojik değişiklikler gösterirler.</li>
</ol>3. Meme Epitel Sferoid Oluşumu
<ol><li>Teste başlamadan önce 200 μL pipet uçlarını 30 dakika dondurun. Büyüme faktörü azaltılmış matris çözeltisini (örneğin Matrigel) (10 mg/mL) tüm süreç boyunca buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Yavaşça pipet 30 μL buz gibi matris çözeltisi, 8 kuyulu bir oda kaydırağının her kuyusuna buz gibi 200 μL pipet uçları kullanarak. Yanlardan başlayın ve pipet ucunu köşeler boyunca sürükleyin, her bir kuyunun eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için kuyunun ortasına son bir damla ekleyerek. Düzgün bir matris çözelti katmanı sağlamak için bu adım sırasında hava kabarcıklarından kaçının. Her kuyu için yeni pipet ipuçları kullanın.</li>
	<li>Matrix çözeltisini polimerize etmek için 15-20 dakika boyunca 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde kuluçka odası slaytları.</li>
	<li>200.000 hücre/mL'de MCF10A Assay Medium'da yeniden 200.000 hücre/mL veya yeniden 200.000 hücre/mL'de MDA-MB-231 Growth Medium'da 1-MB-231 hücrelerini yeniden kullanılabilir.</li>
	<li>MCF10A hücrelerini kullanıyorsanız, %2 matris çözeltisinin son konsantrasyonu için 5 mL Assay Medium'a 5 μL EGF (20 μg/mL) ve 100 μL matris çözeltisi ekleyerek taze MCF10A Küresel Büyüme Ortamı hazırlayın.</li>
	<li>Matris çözeltisi ile önceden kaplanmış oda slaydını inkübatörden çıkarın. Her kuyuya 50 μL MCF10A veya MDA-MB-231 hücre süspansiyonu (10.000 hücre) ekleyin. MCF10A hücreleri kullanıyorsanız, 450 μL MCF10A Küresel Büyüme Ortamı ekleyin. MDA-MB-231 hücreleri kullanıyorsanız, %2 matris çözeltisi (9 μL) ile önceden karıştırılmış 450 μL MDA-MB-231 Growth Medium ekleyin. Oda kaydıranı derhal 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Ortamı her 4 günde bir değiştirin. 200 μL pipet ucu kullanarak her kuyunun bir köşesinden dikkatlice pipet 200 μL eski ortam. Bu işlem sırasında, küresellerin bozulmamasını sağlamak için hazne kaydıranı 45 ° 'de eğin. 200 μL taze hazırlanmış MCF10A Küresel Büyüme Ortamı veya MDA-MB-231 Growth Medium daha önce% 2 matris çözeltisi ile karıştırılmış, sferoidlerin matris tabakasına bağlı kalmasını sağlamak için damlalar halinde köşedeki her kuyuya ekleyin. Ortamın sadece ~ % 50'si değiştirilir, böylece küreseller tarafından üretilen tüm sitokinler tamamen tükenmez. NOT: MCF10A meme epitel sferoidlerinin polarize ve içi boş merkezler oluşturması 8 güne kadar sürer. MDA-MB-231 meme epitel sferoidlerinin oluşması 5 güne kadar sürer ve içi boş merkezleri yoktur.</li>
</ol>4. Endotel Hücre Ağı Oluşumu
<ol><li>İnsan Göbek Damarı Endotel Hücresi (HUVEC) Kültürü<ol>
<li>İnsülin büyüme faktörü, fibroblast büyüme faktörü, vasküler endotel büyüme faktörü, askorbik asit, epidermal büyüme faktörü içeren tek bir Endotel Büyüme Orta-2 kitinin içeriğini ekleyin, heparin ve gentamisin-amfoterisin B, 50 mL fetal sığır serumu, 5 mL penisilin-streptomisin ve 5 mL 200 mM glutamin ila 500 mL Endotel Bazal Orta-2 (EBM-2) ile birlikte komple Endotel Büyüme Ortamı (EGM-2) oluşturur.</li>
		<li>10 mL EGM-2'de 10 cm doku kültürü çanasında 500.000 endotel hücresi tohumu. Hücreleri 37 °C, %5 CO2 inkübatöre % 80 izdiliğe ulaşana kadar (yaklaşık 48 saat) yerleştirin.</li>
		<li>Hücreleri geçirmek için endotel hücrelerini 10 mL sıcak PBS ile yıkayın. HUVEC'i 10 cm'lik doku kültürü çanağını %0,05 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyerek ayırın. Hücreleri faz kontrastı mikroskopisi ile yakından izleyin. Hücreler toplandığında hazırdır, ancak çanağa bağlı kalırlar.</li>
		<li>Trypsin'i dikkatlice yemekten çıkar. Yemeğe 8 mL EGM-2 ekleyin. EGM-2'yi tüm bulaşık yüzeyi üzerinde yukarı ve aşağı pipetle yıkayarak bulaşıktan hücreleri yıkayın.</li>
		<li>Alternatif olarak, tripsin nötralize hücrelerine 5 mL EGM-2 ekleyin. Hücreleri yeniden gerçekleştirmek ve hücre kümelerini parçalamak için hücre ortamı karışımını yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonu 15 mL konik tüpe ve 3 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüje ekleyin. Süpernatantı dikkatlice emiş ve hücre peletini 10 mL EGM-2'de yeniden kullanın.</li>
		<li>10 cm'lik doku kültürü çanaklarına 9 mL EGM-2'ye 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Bulaşıkları 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin. Ortamın 2/3'ü her 2 günde bir taze EGM-2 ile değiştirin. Hücreler 3-5 gün içinde geçişe hazır olacaktır. HUVEC, 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Endotel Hücresi (HUVEC) Ağ Oluşumu</li>
	<li>Teste başlamadan önce 200 μL pipet uçlarını 30 dakika dondurun. Büyüme faktörü azaltılmış matris çözeltisini (10 mg/mL) tüm süreç boyunca buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Yavaşça pipet 30 μL buz gibi matris çözeltisi, 8 kuyulu bir oda kaydırağının her kuyusuna buz gibi 200 μL pipet uçları kullanarak. Yanlardan başlayın ve pipet ucunu köşeler boyunca sürükleyin, her bir kuyunun eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için kuyunun ortasına son bir damla ekleyerek. Düzgün bir matris çözelti katmanı sağlamak için bu adım sırasında hava kabarcıklarından kaçının. Her kuyu için yeni pipet ipuçları kullanın.</li>
	<li>Kuluçka odası Matrigel'i polimerize etmek için15-20 dakika boyunca 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde kayar.<ol>
<li>10 cm'lik bir HUVEC çanağa 10 μL kırmızı hücreli izleyici (1:1000) 37 °C'de 30 dakika, %5 CO2 inkübatör için önceden lekeleyin.</li>
		<li>Endotel hücrelerini 10 mL sıcak PBS ile yıkayın. HUVEC'i 10 cm'lik doku kültürü çanağını %0,05 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyerek ayırın. Hücreleri tamamen ayırmak için kabı 5 dakika boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatöre yerleştirin.</li>
		<li>Tripsin nötralize etmek için yemeğe 5 mL EGM-2 ekleyin. Hücre süspansiyonu 25 mL konik bir tüpe aktarın. 5 dakika boyunca 1.200 x g'da Santrifüj HUVEC. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini serumsuz EBM-2'nin 5 mL'sinde yeniden boşaltın.</li>
		<li>Uygulanabilir hücreleri belirlemek için Trypan mavisini kullanarak hücreleri sayın. 1 x 106 hücre/mL çözümü oluşturun.</li>
		<li>200 μL serumsuz EBM-2 ile her kuyuya 100.000 HUVEC ekleyin. Daha fazla hücre eklenirse, tüp ağı yerine bir yüzey monolayer oluştururlar.</li>
		<li>HUVEC'i 37 °C, %5 CO2 inkübatörde kuluçkaya yatır. 6 saat sonra, faz kontrastı mikroskopisi ile HUVEC ağlarını görüntüleyin. Ağlar artık meme sferoidleri ile coculture için hazır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Önceden oluşturulmuş HUVEC Ağlarında Meme epitel sferoidlerinin biyobaskı
NOT: Biyofabrikasyon işlemi için çift nozül biyo-biriktirme sistemi kullanılmalıdır. Bu durumda, sistem, malzeme birikiminin mikron ölçekli uzamsal kontrolüne izin vermek için üç hareket koluna ve 10 mL şırıngadan biyoink biriktirmek için iki vida tahrikli motora sahipti. Sistem, biyobaskı sırasında steril bir ortamı korumak için yüksek verimli partikül hava filtrasyon sisteminin yanı sıra UV sterilizasyon yetenekleri ile işlevselleştirilmelidir. Biyobaskı, baskı işleminden önce bir saat boyunca UV sterilize edilir.
<ol><li>Daha önce açıklandığı gibi meme epitel sferoidleri ve HUVEC ağları oluşturun. Temsili faz kontrastı mikroskopi görüntülerinde sferoidleri sayarak her kuyudaki meme epitel sferoidlerinin sayısını tahmin edin.</li>
	<li>1000 μL pipet ucunun ucundan 0,5 cm kesin. Kesilmiş pipet ucunu kullanarak tüm sferoidleri 8 kuyulu hazneli kaydıramadan 50 mL'lik bir tüpe dikkatlice pipetleyin. Seçilen biyoinkteki sferoidleri 100 sferoid/100 μL'de resuspend. NOT: Daha yüksek küresel konsantrasyonlar küresel kümelenme ile sonuçlanabilir ve küresel ağlar ile endotel ağları arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesini önleyebilir.</li>
	<li>Büyük veya kümelenmiş küreselleri çıkarmak için küresel karışımı 70 μm hücreli bir süzgeçten geçirin.</li>
	<li>Havuzalanmış sferoidleri 10 mL steril bir şırıngaya yükleyin ve 25 kalibrelik steril bir iğne ile kaplayın. Şırınnayı biyo-biriktirme sistemine takın.</li>
	<li>Ortamı 8 kuyulu oda kaydırağını HUVEC ağlarının dışına aspire edin.</li>
	<li>100 μL meme epitel sferoidlerini 1 mL/dk akış hızında 6 kuyu huvec ağlarına ekstrüde edin. Huvec ağlarının 2 kuyularını kontrol olarak koruyun.</li>
	<li>HUVEC ağlarında basılmış MCF10A küreselleri kullanıyorsanız 400 μL MCF10A Küresel Büyüme Ortamı ekleyin veya HUVEC ağlarında basılmış MDA-MB-231 sferoidleri kullanıyorsanız daha önce % 2 matris çözeltisi ile karıştırılmış 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium ekleyin. huvec kontrol kuyularında ilgili küresel büyüme ortamı kullanılmalıdır.</li>
	<li>Medya değişikliği olmadan 24 - 96 saat boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatörde ortak kültürleri kuluçkaya yatırın. Ortak kültürler dört güne kadar orijinal ortamda canlı kalacak.</li>
</ol>6. Konfokal Mikroskopi
<ol><li>İmmünofluoresans ve PBS-Glisin Yıkama Tampon Hazırlama<ol>
<li>10x PBS'nin 500 mL'sinde 2,5 g sodyum azid, 5 g sığır serum albümini, 10 mL Triton X-100 ve 2,05 mL Ara-20 ekleyerek Immunofluorescence (IF) tampon 10x stok çözeltisi hazırlayın. pH'ı 7,4'e ayarlayın. Tortulaşmayı önlemek için stok çözeltisini bir yıla kadar 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>450 mL steril deiyonize suda 50 mL 10x IF tamponu seyrelterek çalışan bir IF tamponu oluşturun. Çalışma sokmasını oda sıcaklığında bir haftaya kadar saklayın.</li>
		<li>10x PBS'nin 500 mL'sine 37,5 g glisin ekleyerek 10x PBS-Glisin tampon stok çözeltisi hazırlayın. pH'ı 7,4'e ayarlayın. Tortulaşmayı önlemek için stok çözeltisini 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.</li>
		<li>450 mL steril deiyonize suda 50 mL 10x PBS-Glisin tamponunu seyrelterek çalışan bir PBS-Glisin çözeltisi oluşturun. Çalışma sokmasını 4 °C'de bir haftaya kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konfokal Mikroskopi ile Etiket Biyobaskı Örnekleri ve Görüntü<ol>
<li>Biyobaskıda 3D ortak kültürlerden ortapirat yapın ve sıcak PBS ile 3 kez durulayın. Biyobaskıda 3D ortak kültürleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca %4 paraformaldehit ile sabitlayın. Örnekleri 1x PBS-Glisin ile 20 dakika boyunca 3 kez durulayın.</li>
		<li>IF tamponu ile 90 dakika boyunca %10 keçi serumu (birincil blok) karıştırılmış örnekleri bloke edin, ardından IF tamponu artı %10 keçi serumu ve Affinipure Fab parçası (1:100, ikincil blok) ile 40 dakika.</li>
		<li>MCF10A sferoidleri kullanıyorsanız, örnekleri 4 °C'de bir gecede ikincil blokaj tamponunda integrin α6 (1:100) için birincil antikor ile etiketle, ardından ışıktan korunan oda sıcaklığında 1 saat boyunca Alexa Fluor 488 ikincil antikor (1:200) ve Hoescht 33342 (1:1000). MCF10A hücre hatları, küresel polarizasyon ve morfolojiyi göstermek için gerekli olan yüksek düzeyde integrin α6'yı ifade eder.</li>
		<li>Düşük integrin α6 seviyelerini ifade eden MDA-MB-231 sferoidleri kullanıyorsanız, numuneleri ışıktan korunan oda sıcaklığında 4 saat boyunca ikincil blokaj tamponunda Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) ve Hoescht 33342 (1:1000) ile etiketler. Phalloidin, aktüyon filament görselleştirmesini sağlar, böylece küresel amorf ve invaziv morfoloji değerlendirilebilir.</li>
		<li>Numuneleri 1X PBS glisin ile 3 kez 20 dakika yıkayın.</li>
		<li>Üreticinin aracını kullanarak hazne slaydını çıkararak numuneleri montaj için hazırlayın. Her kuyuya küçük bir damla antifade çözeltisi ekleyin. Her oda kaydırağının üzerine 22 mm x 60 mm'lik bir kapak kılıfı yerleştirin ve kenarları açık oje ile dikkatlice kapatın.</li>
		<li>5 μm adımda ~10 dilimden oluşan Z yığınları olarak konfokal mikroskop kullanan görüntü örnekleri. İsterseniz, hücre görüntüleme yazılımındaki Genişletilmiş Odak komutunu kullanarak Z düzlemlerini tek bir düzleme sıkıştırın.</li>
		<li>Görüntü J'yi kullanarak endotel ağlarına küresel yapışkanlığı ölçün. Yapışan küresellerin sayısı, uygun parçacık boyutuna ve daireselliğe sahip analiz eklentisi kullanılarak ölçülebilir. Görüntü alanına bağlı küresellerin sayısını normalleştirin.</li>
		<li>Tekrarlanabilirliği sağlamak için, ortak kültürlerin 4 x 4 karo görüntüsünde yapışan küresellerin sayısını ölçün. Küresel sayı istatistiksel olarak diğer deneylerden anlamlı olarak daha düşükse, deney tekrarlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, 3D mimarilerinde de endotel hücreleriyle ortak kültür için 3D mimarilerinde sferoidleri biyobaskılamak için türünün ilk örneğidir. Kritik protokol adımları meme epitel sferoidlerinin ve HUVEC ağlarının ilk oluşumunu içerir. Meme epitel sferoidlerinin beslenmesinde çok dikkatli olunmalıdır, çünkü matris çözeltisinden kolayca bozulurlar. Benzer şekilde, meme epitel sferoidleri matris çözeltisi dışında pipetlendiğinde ve ağlara karıştırıldığında dikkatli bir şekilde ted...

3D in vitro vasküler tümör modelleri kanser büyümesi ve metastazının mekanistik çalışması için gerekli araçlardır. Özellikle meme kanseri için, Matrigel'de kültürlenen meme epitel hücreleri, in vivo meme acinus mimarisine daha yakından benzeyen polarize sferoidler halinde organize edilir1,2,3 ,4,5,6,7,8. 3D meme epitel hücre kültürü de hücre fonksiyonunu etkiler, 3D kültürler epidermal büyüme faktörü (EGF) reseptör modülasyonunda farklılıklar gösterir8,9; ErbB210dahil onkogen fonksiyonu; büyüme ve apoptoz sinyal11,12; ve kemoterapi direnci13,14. Vasküler endotel hücreleri benzer şekilde 3D ve geleneksel 2D kültür15 , 16 , 17,18'deçevresel uyaranlara farklı yanıt verir. Bununla birlikte, vasküler endotel ve meme epitel etkileşimlerinin anlaşılmasının çoğu, şartlandırılmış orta veya Transwell kesici uçlar kullanılarak 2D kültüründen veya iki hücre tipinin fiziksel olarak ayrıldığı 3D modellerden gelir19,20,21,22,23. Bu ortak kültür modelleri sınırlı fizyolojik içgörü sağlar, çünkü hem 3D kültür hem de hücre-hücre teması vasküler endotel için kritik öneme sahiptir - meme epitel hücre etkileşimleri24,25,26.
3D kanser modelleri, hidrojellerde veya mühendislik iskelelerinde asılı damla küresel oluşumu, biyobaskı, manyetik montaj ve kültür dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılarak üretilmiştir5,27,28,29. Daha yakın zamanda, kendi 3D yapılarında düzenlenmiş birden fazla hücre tipi ile 3D tümör modelleri oluşturulmuştur. Çip üzerindeki tümör platformunun bir örneğinde, kanser, endotel ve stromal hücreler bir matrise karıştırıldı ve daha sonra polidimetilsiloksiksan (PDMS) cihazındaki üç merkezi doku odasına enjekte edildi. Doku odaları, arter ve venule'yi temsil eden iki dış kanalla sınırlandı. 5-7 günlük kültürden sonra endotel hücreleri bir mikrovasküler ağ oluşturdu ve kanser hücreleri çoğalarak vaskülatın yakınında küçük tümörler oluşturdu. Bu platform daha sonra uyuşturucu ve ilaç kombinasyonlarını taramak için kullanıldı30. Belirli mekanik uyaranlara (örneğin, akciğerdeki mekanik zorlanma) sahip metastaz ve kanser türlerini incelemek için ek çip üzerinde tümör platformları oluşturulmuştur31,32. Bununla birlikte, bu platformlar genellikle ilgili 3D yapılarında hem vaskülat hem de kanser içermez.
Biyofabrikasyon, hücre konumu üzerinde sıkı mekansal kontrol sağladığından, 3D in vitro vasküler tümör modellerinin ilerletmesinde büyük umut vaat ediyor. Son on yılda biyobaskı büyümesine rağmen, çok az çalışma özellikle tümörlere odaklanmaktadır33,34. Bir örnekte, in vitro serviks kanseri modeli oluşturmak için hela hücrelerinin jelatin/aljinat/fibrinojen hidrojelde 3D baskısı kullanılmıştır. Tümör hücreleri tek tek hücreler olarak biyobaskı yapıldı ve daha sonra daha yüksek çoğalma oranı, matris metalloproteinaz ekspresyözü ve 2D kültürdeki hücrelerden daha yüksek chemoresistance gösteren küreseller oluşturmasına izin verildi35. Bu çalışmalarda, diğerlerinde olduğu gibi36,37, ayrışmış hücre süspansiyonları biyobaskı verildi ve daha sonra hücre kültürlerine hücrelerin 3D bir yapı oluşturmasını sağlamak için gerekli mekanik ve biyokimyasal ipuçları sağlandı. Bununla birlikte, hücresel kendi kendine montaj günler veya haftalar sürebilir, karmaşık uzamsal ve zamansal çevresel ipuçları gerektirebilir veya iki hücre tipi birlikte kültürlendiğinde gerçekleşmeyebilir. Örneğin, meme epitel hücreleri 2D ortak kültürde endotel hücrelerinde hücre ölümüne neden oldu ve ayrışmış meme epitel hücreleri aljinat / jelatin hidrojellerinde biyobaskılandığında 3D sferoidler oluşturmadı38. Dissosiyatif meme epitel veya kanser hücreleri aljinat bazlı biyoinkslerde sadece dairesel PDMS kalıplarına yakalandığında sferoidler oluşturdu. Diğer durumlarda, sferoidler ultra düşük bağlanma dairesel kuyu plakalarında askıya alınmış damlacıklar kullanılarak oluşturulmuş ve daha sonra aljinat bazlı biyoinks39,40' a karıştırılmıştır.
Şimdi bu protokolde alternatif bir 3D doku biyomüslüm yöntemini tarif ediyoruz. Tohum ayrışmış hücreler yerine ve bu hücrelerin 3D yapıları oluşturmasını beklemek yerine, hemen kullanılabilecek bir tümör ortak kültür modeli oluşturmak için vasküler bir tüp ağında 3D tümör sferoidlerinin nasıl oluşturulacağını ve biyobaskı yapılacağını açıklıyoruz. Tümör sferoidleri in vitro olarak yetiştirilebilir veya insan dokularından (organoidler) türetilebilir. Benzer şekilde, vasküler tüpler yetiştirilebilir veya yağ dokusu mikrovasküler parçalarından elde edilebilir. Biyoinksler biyolojik olarak aktif olmayan aljinattan son derece biyolojik olarak aktif Matrigel41'ekadar değişebilir. Bu 3D tümör ortak kültür modeli çeşitli hücre yapıları ve biyoinks ile oluşturulabildiğinden, birden fazla hücre tipi, hücre dışı matrisler ve kemokin gradyanları15,42. Mevcut formülasyonunda, endotel ağları perfüzyona maruz kalamasa da, gelecekteki yinelemeler bu yöntemi mikrofluidler veya yonga üzerindeki sistemlerle entegre edebilir. Endotel ağlarına biyobaskı 3D meme epitel sferoidleri, ilaç testi ve kişiselleştirilmiş hassas tıp için insan meme modellerinin hızlı biyofabrikasyonuna olanak sağlar27.

<table><tbody><tr><td>37&amp;deg;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td><td>Sanyo</td><td>MCO-20AIC</td><td>Cell incubation</td></tr><tr><td>3D Bio printer</td><td>custom-made</td><td>None</td><td>Used for bioprinting</td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>53106-306</td><td>for seeding spheroids</td></tr><tr><td>25-gauge needle</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>Z192406-100EA</td><td>bioprinting syringe needle</td></tr><tr><td>Absolute ethanol (200 proof )</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>E7023-500ML</td><td>reconsitution of media components</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab&amp;prime;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115006020</td><td>secondary block - Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>A-11006</td><td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Bovine insulin</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>I-035-0.5ML</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>A2153-500G</td><td>Blocking agent -Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>352350</td><td>Remove large or clustered spheroids</td></tr><tr><td>CellTracker&amp;trade; Red CMTPX Dye</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>C34552</td><td>pre-stain for HUVEC tubes</td></tr><tr><td>Compact Centrifuge</td><td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td><td>Z206A</td><td>For cell centrifugations</td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>C8052-.5MG</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Conical tubes 15 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>62406-200</td><td>Collecting and resuspending cells</td></tr><tr><td>Countess II-FL Cell counter</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AMQAF1000</td><td>counting cells</td></tr><tr><td>Glass pipettes (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>76184-746</td><td>cell resuspension</td></tr><tr><td>DMEM F:12</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>11320033</td><td>MCF10A basal media</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>10-014-CV</td><td>MDA-MB-231 basal media</td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC basal media</td></tr><tr><td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3162</td><td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;trade; 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td></td><td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Cytiva, Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16210064</td><td>Immunofluorescence labelling component</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>G8898-500G</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>62249</td><td>Nuclei stain immunofluorescence</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16050130</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>H0888-5G</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td><td>Cell applications, San Diego , CA</td><td>200-05f</td><td>Endothelial cell lines</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>MAB1378</td><td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td></tr><tr><td>Live Dead assay</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>L3224</td><td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocal microscope</td><td>Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td>Used to visualize cells</td></tr><tr><td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>354230</td><td>Spheroid formation</td></tr><tr><td>MCF10A cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317</td><td>Breast cell line</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Breast cell line</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>158127-500G</td><td>cell fixative</td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15140122</td><td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>7001106</td><td>Wash buffer for cells before trypsinization</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline 10X</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AM9625</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>P36934</td><td>immunofluorescence mountant medium</td></tr><tr><td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A/ assay media component</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>S2002-25G</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Sterile syringe (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>75846-757</td><td>bioprinting process</td></tr><tr><td>Tissue culture dish (10cm)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25382-166</td><td>monolayer cell culture</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>T8787-250ML</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td>cell counter additive</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td>cell detachment</td></tr><tr><td>Tween -20</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>85113</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Vascular Endothelial Growth factor (VEGF&lt;sub&gt;165&lt;/sub&gt;)</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>100-20</td><td>HUVEC tube additive</td></tr><tr><td>Volocity 6.3 cell imaging software</td><td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>Z stack compresser</td></tr></tbody></table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

Biyobaskı, in vivo doku mimarisinin kritik özelliklerini daha iyi yeniden toplayan 3D insan kanseri modelleri imal etmek için umut verici bir araç olarak ortaya çıkıyor. Mevcut katman katman ekstrüzyon biyobaskısında, tek tek hücreler hiyerarşik doku kendini birleştirmeyi teşvik etmek için karmaşık mekansal ve zamansal ipuçları ile birlikte bir biyoinkte ekstrüde edilir. Bununla birlikte, bu biyofabrikasyon tekniği hücreler, biyoinksler ve biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçları arasındaki karmaşık etkileşimlere dayanır. Bu nedenle, kendi kendine montaj günler hatta haftalar sürebilir, belirli biyoinksler gerektirebilir ve her zaman birden fazla hücre tipi söz konusu olduğunda ortaya çıkmayabilir. Bu nedenle, çeşitli biyoinkslerde önceden oluşturulmuş 3D meme epitel sferoidlerini doğrudan biyobaskılamak için bir teknik geliştirdik. Biyobaskı önceden oluşturulmuş 3D meme epitel sferoidleri baskıdan sonra canlılıklarını ve polarize mimarilerini sürdürdüler. Ayrıca 3D sferoidleri vasküler endotel hücre ağlarına yazdırarak ortak kültür modeli oluşturduk. Böylece, yeni biyobaskı tekniği hızla daha düşük maliyetle ve geleneksel biyobaskı tekniklerinden daha yüksek esneklikle daha fizyolojik olarak ilgili bir 3D insan meme modeli oluşturur. Bu çok yönlü biyobaskı tekniği, ek biyoinkslerde diğer dokuların 3D modellerini oluşturmak için tahmin edilebilir.

Meme epitel hücreleri matris çözeltisi üzerinde 5-8 günlük kültürden sonra ve % 2 matris çözeltisi ile kültür ortamında 3D sferoidler halinde kendi kendine organize edilmelidir. Tümörijenik olmayan MCF10A meme epitel sferoidleri yuvarlak görünmeli ve entegre α6 sferoidin dış kenarına polarize edilmiş içi boş bir merkeze sahip olmalıdır(Şekil 1, inset içi içi boş merkezleri gösterir). Son derece invaziv MDA-MB-231 meme kanseri epitel hücreleri düzensiz sferoid...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bu protokolün amacı, ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilecek 3D meme endotelyal ortak kültür modellerini hızla oluşturmak için önceden oluşturulmuş endotel ağlarına çok hücreli sferoidler olarak meme epitel hücrelerini doğrudan biyobaskılamaktır.

3D Çok Hücreli Meme Sferoidlerinin Endotel Ağlarına Doğrudan Biyobaskı

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

direct-bioprinting-3d-multicellular-breast-spheroids-onto-endothelial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.8K Görüntüleme.  Drexel University. Bu protokolün amacı, ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilecek 3D meme endotelyal ortak kültür modellerini hızla oluşturmak için önceden oluşturulmuş endotel ağlarına çok hücreli sferoidler olarak meme epitel hücrelerini doğrudan biyobaskılamaktır.

Video: Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Meme Kanseri Araştırmaları için Potansiyel Fonksiyonel In vitro Model Olarak Meme Epitel ve Endotel Hücre Sferoidleri

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Kanser Araştırmaları

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Üç Verici Kartezyen Yazıcı Kullanımı Bioprinted Hücresel Yapıların Canlılık

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Biyomühendislik

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

3D Bioprinting&#39;i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

İstilayı Yönlendirmek İçin Epitelyal Kanser Hücrelerinin İskelesiz 3D Kültürlerinde Heteromultihücreli Stromal Hücreler

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Bioprintable aljinat/jelatin hidrojel 3D Vitro Model sistemleri hücre küresel oluşumu teşvik

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Boru yapıları doku mühendisliği için Çekirdek / kabuk Baskı İskeleler

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create tissues by adding layer upon layer of printable biomaterials, termed bioinks, and cells in an orderly and automatic manner, which allows for creating highly intricate structures that traditional tissue engineering techniques cannot achieve. Thus, 3D bioprinting is an appealing in vitro approach to mimic the native vasculature complex structure, ranging from millimetric vessels to microvascular networks. 
Advances in 3D bioprinting in granular hydrogels enabled the high-resolution extrusion of low-viscosity extracellular matrix-based bioinks. This work presents a combined 3D bioprinting and sacrificial mold-based 3D printing approach for fabricating engineered vascularized tissue flaps. 3D bioprinting of endothelial and support cells using recombinant collagen-methacrylate bioink within a gelatin support bath is utilized for the fabrication of a self-assembled capillary network. This printed microvasculature is assembled around a mesoscale vessel-like porous scaffold, fabricated using a sacrificial 3D printed mold, and is seeded with endothelial cells. 
This assembly induces the endothelium of the mesoscale vessel to anastomose with the surrounding capillary network, establishing a hierarchical vascular network within an engineered tissue flap. The engineered flap is then directly implanted by surgical anastomosis to a rat femoral artery using a cuff technique. The described methods can be expanded for the fabrication of various vascularized tissue flaps for use in reconstruction surgery and vascularization studies.

Engineered flaps require an incorporated functional vascular network. In this protocol, we present a method of fabricating a 3D printed tissue flap containing a hierarchical vascular network and its direct microsurgical anastomoses to rat femoral artery.

3D Baskı Teknolojileri Kullanılarak Mühendislik Vasküler Flaplarının İmalatı

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

<meta charset="utf8"></head><body>Plaka Üzerinde Kaplar Kullanarak Hızlı Vasküler Ağ İmalatı için 3D Biyobaskı

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in coronary arteries and impaired function of the blood-brain barrier. Existing fabrication techniques do not adequately replicate the geometrical variation in vascular networks in the human body, which substantially influences disease progression; moreover, these techniques often involve multi-step fabrication procedures that hinder the high-throughput production necessary for pharmacological testing. This paper presents a bioprinting protocol for creating multiple vascular tissues with desired patterns and sizes directly on standard six-well plates, overcoming existing resolution and productivity challenges in bioprinting technology. A simplified fabrication approach was established to construct six hollow, perfusable channels within a hydrogel, which were subsequently lined with human umbilical vein endothelial cells to form a functional and mature endothelium. The computer-controlled nature of 3D bioprinting ensures high reproducibility and requires fewer manual fabrication steps than traditional methods. This highlights VOP's potential as an efficient high-throughput platform for modeling vascular permeability and advancing drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Yüksek Verimli Vasküler Model İmalatı için Otomatik Biyobaskı

We present a protocol for high-throughput production of vascular channels with flexible sizes and desired patterns on a standard six-well plate using 3D bioprinting technology, referred to as vessels-on-a-plate (VOP). This platform has the potential to advance the development of therapeutics for the disorders associated with compromised endothelium.

Boyut ve Desen Esnekliği ile Standart Altı Kuyulu Plakalarda Vasküler Geçirgenliğin Modellenmesi için Yüksek Verimli Biyobaskı Yöntemi

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in ...