Işık noktası teşbesi kullanılarak larvaların davranışı, larva hareketinin ayrıntılarının analiz edilmesine izin vererek ışık alanına girmeden önce, sırasında ve girdikten sonra izlenebilir. Bu titrebasit ve gerçekleştirmek kolaydır. Işık tepkisi yalnızca bir kez test edilir, böylece ışık adaptasyonunun olası etkileri dışlanabilir.
Agar plakaları hazırlamak için, yavaş ve eşit sıcak% 1 agar yaklaşık dört milimetre kalınlığında tabaka ile 15 santimetre Petri çanak alt kapağı. Agar katılanına kadar tabağın oda sıcaklığında soğumasını bekleyin. Görsel stimülasyon sistemini kurmak için, ışığın masaüstüne doğru yansamasını göz önüne alarak, hazırlanmış bir LED ışık kaynağını demir bir çerçeveye takın.
Silindir düzlemi ile dikey düzlem arasındaki açı yaklaşık 10 derece olana kadar silindiri hafifçe yatırın. 470 nanometre mavi LED ışığını yüksek güçlü LED sürücüsünün LED tek fişe bağlayın ve sürücüyü açın. Kanal 470 nanometreseçmek için sürücünün sağ üst köşesindeki düğmesini çevirin ve LED'i tıklatın.
Ekran bir çek görüntülediğinde, masaüstünde mavi bir ışık noktası görünür. Tamam'ı tıklatın ve ışığın yoğunluğunu ayarlamak için düğmesini çevirin. Işık noktasının çapını iki santimetreye ayarlamak için ışık kaynağının konumunu yukarı ve aşağı hareket ettirin.
Deneysel gereksinimlere göre ışık yoğunluğunu seçmek için düğümü döndürün. Spottaki maksimum ve minimum ışık gücünü ölçmek için standart fotoğraf diyot güç sensörüne sahip kompakt bir güç ölçer konsolu kullanın. Işık gücünün gerçek deneyde karanlıkta ölçülmesi gerekir.
Daha sonra ışık gücünü kaydedin, üç kez ölçün ve ortalama değeri kullanın. Hayal sistemini kurmak için, yüksek çözünürlüklü bir web kamerayı masaüstündeki ışık noktasının yaklaşık 10 santimetre üzerinde demir klipsle kenetleyin ve kamera merceğinin masaüstüne doğru yönünü ayarlayın. Kamerayı USB arabirimi üzerinden Windows 7 çalıştıran bir bilgisayara bağlayın ve agar plakasını kameranın hemen altına masaüstüne yerleştirin.
AMCap 9.22 yazılımını açın, ışık noktası AMCap penceresinde otomatik olarak gösterilir. Işık noktasının pencerenin merkezine yakın olduğundan emin olmak için kamerayı hafifçe sola veya sağa hareket ettirin. Kameranın hemen altında 5 ila 7 milimetrelik bir 850 artı veya eksi üç nanometre bandpass filtresini düzeltmek için bir klip kullanın.
Agar plakasının etrafına 850 nanometrelik merkezi dalga boyuna sahip üç kızılötesi ışık üreten LED'leri plakanın kenarından yaklaşık beş santimetre uzağa ve plakaya doğru bakan 70 derecelik bir açıyla LED lenslerle yerleştirin. Daha sonra LED'leri AC'leri aracılığıyla dc dönüştürücülerine bir güç kaynağına bağlayın. AMCap yazılımının menüsünde seçenekleri, video aygıtını ve yakalama biçimini seçin ve yakalanan videonun piksel boyutunu 800'e 600'e, kare hızını ise saniyede 60 kare olarak ayarlayın.
Filtreyi çıkarın ve kameranın altına bir cetvel yerleştirin. Ölçek çizgisi net olana ve video alanının genişliğine paralel olana kadar kamera odağı ayarlayın ve kaydetme yolunu seçmek için yakalama, kurulum ve video yakalamayı tıklatın. Ardından, 600 piksele karşılık gelen gerçek mesafeyi kaydetmek ve her pikselin gerçek uzaklık oranını hesaplamak için kayıt başlat'ı tıklatın.
Larvayı görüntüleme kurulumuna tanıtmadan önce, ışık konumunun kısa bir videosunu edinin ve filtrelenmemiş kontrol arka plan video ışık alanı nın adını adlandırın. Filtreyi kamera merceği üzerine geri yerleştirin ve larvaların net bir şekilde gözlemlenebilmesine izin verirken deneysel cihazdan mümkün olduğunca düşük bir ayarda Bir ışık açın. Kültür ortamı bazı larvaları kaldırmak ve yavaşça üçüncü bir yıldız larva seçmek için bir kaşık kullanın.
Larvayı distile suda yıkayın ve larvayı agar plakasının ortasına yerleştirin. Larvadaki fazla suyu yavaşça çıkarın ve odanın ışığını kapatın. Kızılötesi LED ışığını açmadan önce larvanın karanlık ortamda iki dakika boyunca alışmasını bekleyin.
Aşağıdaki ışık kaçınma davranışı deneyi karanlıkta yapılmalıdır. Gösterinin kolaylığı için parlak ışıkta filme aldık. Larvayı tabağın ortasına doğru hafifçe fırçalayın.
Larva düz sürünmeye başladığında, larvanın ışık noktasına doğru yönelmesi için plakayı döndürün. Kaydet yolunu seçmek için yakalama, kurulum ve video yakalama'yı tıklatın ve kaydetmek için kayıt başlat'ı tıklatın. Larvanın görüş alanının dışına çıkana kadar ışık noktasını doğru sürünmesine, girmesine ve bırakmasını bekleyin ve kaydı durdur'u tıklatın.
Filtreyi kameradan uzağa taşıyın ve ışık noktasının konumunun kısa bir videosunu edinin. Sonra post tsay filtresiz video ışık alanı iki adı ve ışık nokta konumunu değişmedi emin olmak için ışık alanı bir video ile bu videoyu karşılaştırın. Burada kuyruk hızının zaman eğrileri, gövde bükme açısı ve temsili bir larvanın gövde bükme açısal hızı görülebilir.
Larva kafa döküm boyutu ve bu nedenle, maksimal vücut bükme açısı önemli ölçüde tdc2-Gal4 nöronlar normal bir larva ışık yanıtı için gerekli olduğunu gösteren ebeveyn kontrolleri ile karşılaştırıldığında tetanoz toksik ekspresyonu ile inhibe ahtapotaminjik nöronlar ile üçüncü instar larvaları azalır. Başarılı görüntü işleme için kameranın ışığı engellemediğinden ve ışık noktasının yuvarlak ve pencerenin merkezine yakın olduğundan emin olun. Bu işlemden sonra, belirli nöronlar aktive edildiğinde larvaların nasıl tepki verdiğini gözlemlemek için optogenetik yapılabilir.
Bu analiz kullanılarak, larva hareketinin ayrıntıları analiz edilerek çevresel ve iç faktörlerin larva ışıktan kaçınma davranışı üzerindeki uzak etkisi nin incelenmesine olanak sağlar.
