Tüm hayvan deneyleri Ulusal kurumları, sağlık hayvan kullanım kılavuzlarınıza uygun olarak yapılmıştır. Bu eser kısmen C. Gu için Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01NS093073 ve R21AA024873) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntemler aşağıda açıklanan kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Ohio State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Coverslip hazırlık
<ol><li>Bir veya daha fazla kutu 12 mm veya 25 mm coverslips % 70 nitrik asit içeren bir cam kabı yerleştirin ve oda sıcaklığında coverslips gecede kuluçkaya. Not: 12 mm coverslips olarak aynı ölçek 25 mm coverslips yıkama yok. Onları ayrı ayrı yıkamak iyidir.</li>
	<li>GKD2O 2.5 L ile dolu bir 4 L kabı içine tüm coverslips transfer ve 1 h 100 RPM için coverslips içeren kabı sallamak. Lastik bantlar kabı sallayarak sırasında tutmak için kullanın. Durulama taze 2.5 L GKD2O ile dört kez tekrarlayın.</li>
	<li>Temizlenmiş coverslips metal bir kapak ile kuru bir şişesi aktarın. Coverslips 225 ° c 6 h için fırında pişirin ve oda sıcaklığına kadar soğutmak izin. Not: 25 mm coverslip için kırılma eğilimli. Coverslips tek tek ayrı ve kurutma sonra onları bir fırında pişirin.</li>
	<li>Kurutulmuş ve temizlenmiş coverslips oda sıcaklığında bir steril plastik kap içinde kullanımı kadar saklayın.</li>
	<li>
Coverslips aşağıdaki gibi kat:
	<ol>
<li>Taze kaplama çözümde bir santrifüj tüpü hazırlayın.</li>
		<li>Her coverslip 24-iyi (veya 6-şey) plaka bir kuyunun içine yerleştirin. 30 (-100) µL coverslip kaplama çözüm (Tablo 1) bir 12 mm (veya 25 mm) coverslip ve girdap üzerine yerleştirin. 1 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS, doku kültürü sınıf) kuyuya ekleyin. Bu tabakları hemen kullanılan ya da steril PBS için bir hafta içinde 4 ° C'de depolanan.</li>
		<li>Diseksiyon günü, PBS kaldırın. Kuruması ve UV ışık (30W) için 2-4 h altında tabak yerleştirin. Not: Son adım bir hücre kültür laminar akış başlıklı UV ışığı ile tamamlanmalıdır. Kapıyı kapüşonlu coverslips kurutma için hava akımı sağlamak için biraz kaldırdı.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. diseksiyon, ayrışma ve hamile Mouse/fare Hipokampal Neurons kültür
<ol><li>
Diseksiyon ve Hipokampal nöron kültürü için ayrılma
	<ol>
<li>Proteaz enzimi çözüm (3 mg/mL proteaz 23 SLD'ler, Tablo 1içinde) çözülme ve kaplama öncesi sıcak ortam (Tablo 2) 37 ° C'de</li>
		<li>Hippocampus teşrih ve önceki yayın14' te açıklanan yöntemlere göre SLD ile durulayın. Not: Dört hippocampi bir 24-şey veya bir 6-şey plaka için yeterince hücre sağlar.</li>
		<li>SLD'ler kaldırmak, proteaz enzimi çözüm 2 mL ekleyin ve 37 ° c, % 5 CO2 15dk için örnek kuluçkaya.</li>
		<li>Hippocampus explants 5-10 mL kaplama orta ile iki kez yıkayın. Orta kaplama 5 mL ekleyin. Hipokampal explants Tek Kişilik hücrelere bir pipet ile 1 mL plastik ucu kullanarak küçük bir girdap oluşturarak ayırmak. Yukarı ve aşağı yaklaşık 40 kez, pipet oksijen kabarcıkları, oluşumu çözüm bulutlu olur ve explant büyük no adet kalması kadar uzak durmaya. Not: yıkama sırasında bazı medya bırakmayı unutmayın, Hipokampal explants tüm süreç sırasında ortamda batık kalmalıdır.</li>
		<li>1.125 x g 3 dk. süpernatant hücreleri ile medyada batık Kaldır, hücreleri santrifüj kapasitesi. Medya kaplama 145 mL hücrelerde resuspend. 1 mL/iyi hücre süspansiyon 24-şey plaka (3 mL/iyi bir 6-şey plaka) ekleyin. Not: medya kaplama 145 mL düşük hücre yoğunluğu olan bir hücre süspansiyon üretmek için kullanılır. Bu birim hücre kaplama altı 24-şey plakaları, sekiz 6-şey plakaları veya yapılacak deneyler bağlı olarak 24 - veya 6-da plakaların çeşitli kombinasyonları sağlayacaktır. 24-şey plaka her şey-ecek-si olmak 3 x 104 hücreleri9.</li>
		<li>Kaplama medya 37 ° c, % 5 CO2 için 2-4 h, hücrelerde kuluçkaya sonra tüm kaplama medyayı çıkarın ve taze bakım ortamı ile değiştirin.</li>
		<li>2 gün sonra (2 gün vitro, 2DIV), medya yarısı ile 2 yerine µM Ara-C (arabinosylcytosine) çözünmüş bakım medya hangi fibroblastlar, endotel ve gliyal hücreler büyümesini engeller. Ara-C hücrelere iki gün boyunca maruz kalmaları ortamı taze bakım medya ile değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection hücre morfolojisi görselleştirme için Not: yeşil flüoresan protein (GFP), sarı floresan protein (YFP), mCherry, bireysel nöronların morfolojisi aydınlatmak için vb floresan yapıları içeren hücreleri Transfect.<ol>
<li>Yapıları (1 µg/µL) stoktan Opti-MEM medya (Opti-MEM Medya 50 µL inşa 0.8 µg) ve girdap sulandırmak. 1 yapı seyreltme her şey için hazır olun. Not: 24-şey plaka 0.8 µg Opti-MEM Medya 50 µL inşa gerekir. 6-şey plaka yapı 150 µL Opti-MEM medya 2.4 µg gerektirir.</li>
		<li>Lipozom aracılı transfection reaktif Opti-MEM medya (50 µL Opti-MEM medya transfection reaktif 1,5 µL) ve girdap sulandırmak. 1 transfection seyreltme her şey için hazır olun. Not: 24-şey plaka 50 µL Opti-MEM medya transfection reaktif 1,5 µL gerektirir. 6-şey plaka transfection reaktif Opti-MEM medya 150 µL içinde 4,5 µL gerektirir.</li>
		<li>1:1 karışımı (100 µL) Opti-Mem medya ve transfection reaktif Opti-MEM medya ve girdap içinde yapı, hazır olun. Karışımı, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Not: iyi yaklaşık 100 µL yapý, transfection reaktif ve Opti-MEM medya 24-şey plaka (6-şey plaka için 300 µL) kullanarak, içeren çözüm olmalı.</li>
		<li>Ve bu ortamı temiz konik tüp içine transfer medya (24-şey plaka, 6-şey plaka için 1,5 mL için 500 µL) yarısı her kuyudan çıkarın. Bu tüp da kuluçka makinesine tutun. Daha sonra 100 µL karışımı (Adım 2.2.3) iyi kalan medya ekleyin. 20-30 dk 37 ° C'de kuluçkaya hücrelere izin.</li>
		<li>Kuluçka (Adım 2.2.4) sırasında konik tüp (Adım 2.2.4) medyada bir birim taze bakım medya ekleyin. Karışım aynı İnkübatör (37 ° C ve % 5 CO2) yerleştirin.</li>
		<li>Kuluçka kuyulardan transfection solüsyon içeren tüm medyayı çıkarın ve 1:1 karışımı eski ve yeni bakım medya konik tüp (Adım 2.2.5) ile değiştirin. Not: yapıları boyutuna bağlı olarak, hücre içinde 12 h ifade başlamak; yapıları, en yüksek ifade ulaşılmadan 3-4 gün daha büyük yapıları için gerekli olabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. şişirme pipet aparatı ayarlama
Not: Bu kurulum için beş temel bileşeni vardır: cam pipet, tüp, şırınga, micromanipulator ve tampon (Hank'in). Fizyolojik olarak ilgili tuz konsantrasyonları vardır herhangi bir arabellek bu kurulum içinde kullanılabilir.
<ol><li>45-µm-çapı açılış ipucu Tablo 3' te bir micropipette çektirmenin ve teknik özellikleri kullanma civarında olması borosilikat pipet çek. Not: Bulunan 45 µm deneysel koşullar altında açılış pipet çapları için uygun bir boyutudur. Açılış boyutu küçük farklılıklar sonuçları önemli ölçüde etkilememelidir. Bu sayıdan büyük gidiş hala pipet boru üzerinden bağlandığı şırınga yüksekliğini ayarlayarak varisler indüksiyon için çalışması gerektiğini unutmamak gerekir, ama bu ayarlamayı basınç değeri gerektirir.</li>
	<li>Pipet un çekti sonuna ince lastik boru içine yerleştirin. Not: Boru duvar ince ve sıvı direnci şırınga yüksekliğini doğrudan pipet ile ihmal edilebilir direnç akan sıvı basıncı orantılıdır sağlanması, en aza indirmek için katı olmalıdır. Yaklaşık 0,6 m uzunluğunda daha en aza indirmek daha direniş tüp artık olmalıdır.</li>
	<li>10 mL plastik enjektör çevirmek mümkün bir vana ile bir bağlayıcıyla hortumunun diğer ucunu bağlayın. Not: Pipet akan kabul edilen basınç için doğru bir ölçü sağlamak için sürekli, ölçülebilir bir yükseklik yapılacak plastik şırınga ihtiyacı var. 190 mm yüksekliğe kullanılmıştır, beri bu en az basınç sağlar fakat güvenilir bir şekilde aksonlar varicosities neden olmaktadır. Eğer basınç coverslip yüzeyinden ayırmak hücreleri neden diğer yükseklik değerleri de kullanılabilir. Bu deney boyunca aynı ayarı kullanmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Pipet pipet tutmak için micromanipulator vida tepesine yerleştirin. Böylece hemen üzerinde nerede alıpkendi bağlı olduğu pipet un çekti sonu tutan micromanipulator koluna bağlı metal, düz tepesinde vida canı cehenneme. Açı nöron içeren coverslips yüzeyi ile 45° açıyla pipet. Not: pipet alıpkendi constricting olmadan tutulabilen böylece micromanipulator inşa edilmelidir. Micromanipulator doğru hücre aralığında pozisyon x, y ve z yön pipet hareket izin vermesi gerekir. Bir fotoğraf cihazları yanı sıra grafik (şekil 1) sağlamıştır.</li>
	<li>Bir floresan Filtresi'ni açmak, diyafram açın ve floresan bir yer-ebilmek var olmak seen amacı ile geliyor emin olun. Micromanipulator kullanarak, pipet ucu ile floresan nokta kadar hatları ve pipet hücre kültür çanak (35 mm x 10 mm) yüksekliği yukarıda sadece bir konum içine daha düşük bir pozisyon içine taşıyın. Bir kez o pozisyonda, iletilen ışığı ve floresan açmak.</li>
	<li>Cımbız kullanarak, bir coverslip (hücrelerle pipet doğru yukarı bakacak şekilde) hücre kültür plaka Hank'in arabellek oda sıcaklığında yaklaşık 2 mL içeren hücre kültür çanak ekleyin.</li>
	<li>Coverslip kapsamı üzerine içeren kültür çanak yerleştirin.</li>
	<li>İyi odak düğmesi ve 20 X objektif kullanarak, bir uçağa Hücreleri (yaklaşık 0.4 mm) yukarıda yaklaşık dört tam döner odaklan. Böylece odaklanmıştır ve merkezinde, uçağın göz parçaları görüldüğü gibi sol tarafta pipet ucu konumlandırmak için micromanipulator kullanın. Not: Dendrites onlar kaynaklanan hücre organ olarak aynı çerçevede olmalıdır projeksiyonları vardır. Aksonal varicosities ikna etmek için bir daha uzun projeksiyonlar hücre gövdesinden medial ve distal aksonlar takip etmeli.</li>
</ol>4. bir gerilebilir membran sistemi kullanan pipet Basınç Kalibrasyonu
<ol><li>Şişirme pipet aparatı ile tam olarak aynı parametreleri içeren bir microfabricated silikon membran (çapı 500 µm) ve 50 µm kalınlığında bir sistemde yukarıda açıklandığı gibi kurulum ve membran yüzeyinin mikroskop odak. Not: Bu sistem küçük basınç değerleri ölçmek için tasarlanmıştır ve sistem açıklaması10önce yayımlanmıştır. Bu ölçüm yalnızca bir kez şişirme tam aynı ayarı kullanıldığında deneyler şişirme için yapılması gereken.</li>
	<li>Mikroskop merkezleri arasında ölçülen microdots (çapı 4 µm) ve 10 µm ayrı, diziler üzerinde odaklanın. Kapatma vanasını açın ve pipet dışarı akışı için sıvı sağlar. Sıvı basıncını cevaben membran saptırma confocal mikroskopla inceleyin.</li>
	<li>Membran saptırma ile ilişkili karşılık gelen basınç belirlemek için doğrusal bir model kullanmak. Not: Süre son bir çalışmada bulundu ki bir saptırma w-3.143 = ± 0,69 µm 190 mm şırınga yükseklik için elde edilen, bu fizyolojik ve patolojik aralığı içinde olsa geçerli pipet kurulumundan 0,25 ± 0,06 nN/µm2 baskı üretilen şırınga yüksekliği tek belirleyici değil. Diğer faktörler açma, konumlandırma pipet (mesafe ve açı) hücreleri ve hatta esneklik tüp4,10göre pipet ucu da dahil olmak üzere tam basınç değeri de, nöronlar üzerinde etkiler.</li>
</ol>5. Varicosities ikna etmek için şişirme
<ol><li>Pipet konumda olduğunda, mikroskop ilgi bölgesi içeren bir uçakta odaklan. Sağ alan şişirme dışında iken hücreleri ve işlemleri (kamera canlı yakalama tarafından görüldü) görüntüleme alanı şişirme alaný sol yarısında yerleştirin. Not: akson geniş akıbet ve nöronların dendrites nedeniyle, bu bir nöron tüm işlemler aynı şişirme alanı içinde olduğunu düşüktür. Şişirme yerel etkisi incelenmesi sağlayan bu sistem, aslında bir avantajı bu. Varicosities ikna etmek için kullanılan şişirme iki tür vardır: uzun süre şişirme ve nabız şişirme.</li>
	<li>
Şişirme
	<ol>
<li>Uzun süre şişirme<ol>
<li>Kültürlü nöronlar4içeren coverslip yukarıda 190 mm yükseklikte şırınga getirin. İlgi alanı hızlandırılmış görüntüleme açık nöronal Morfoloji açığa bir en iyi duruma getirilmiş çekim hızı ile başlar. En az 15 kare taban çizgisi olarak 2 s aralıklarla (30 s toplam) yakalama. Aralığı dayalı deneme olarak ayarlanabilir. Karede 16, şırınga çevirmek mümkün vanasını açın ve sıvı akışı için 75 kare izin (150 s). Sıvı akışı durur böylece çerçeve 75, kapak kapat. Video yakalama durdurmak. Not: büyük nöronlar formu varicosities için daha uzun sürer, ancak bu nöronlar içinde aksonal varicosities 7-9 DIV içinde 5-10 lar, ikna etmek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nabız (2 s süresi) şişirme<ol>
<li>Şırınga uygun yükseklikte (190 mm) konumlandırın. Hızlandırılmış görüntüleme başlar ve en az 15 çerçeveleri yakalamak (30 s) 2 s aralıkta. Karede 16, şırınga Vanayı aç ve sıvı akışı izin verin ve sonra tekrar kapak açmadan önce 2 s. bekle 5-20 s (bağlı olarak test edilmesi için frekans) ardından vanayı kapat. Açılış ve kapanış Vana sıvı bakliyat oluşturmak ve toplam 150-300 s. kurtarma sahne yakalamak için 20 min için Imaging hızlandırılmış devam için devam için yineleyin. Not: Ne zaman aralığı 10'dan daha uzun s, bakliyat büyük ölçüde daha az varicosities ikna etmek. 20 s aralıkta, hiçbir varicosities bakliyat4tarafından indüklenen. Güvenilir ve tutarlı varisler formasyonu elde etmek için bu şırınga yüksekliği yaklaşık 190 mm. şırınga yüksekliği olmalıdır ve sıvı basıncı hücreleri coverslip yüzeyden ayırma başladığı bir noktaya artırılmalıdır değil tavsiye edilir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kullanım bir gün önce 10 mL % 70 hakkında akan tarafından kurulum (pipet, boru ve şırınga) temiz up ile etanol. Etanol yıkayın, sistem o günkü kullanmak için hazırlamak için set-up Hank'in arabellek (veya istediğiniz arabellek) 10 mL akışı. Gün için bitirme deneyler temizledikten sonra set-up olarak etanol ile gecede kirletici gelişimini önlemek için daha önce açıklanan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. övgü yöntemleri
Not: Şişirme tahlil çeşitli giriş bölümünde açıklanan farklı teknikleri ile kombine edilebilir. Burada, yüksek çözünürlüklü Floresans timelapse görüntüleme, kalsiyum görüntüleme ve kurtarma deneyleri gibi şişirme tahlil ile birlikte, en sık kullanılan temel teknikleri üzerine odaklanmıştır. Bunlar aşağıda ele alınmıştır.
<ol><li>
Aşağıdaki iletişim kuralı takip ederek yüksek çözünürlüklü floresan hızlandırılmış görüntüleme kuralları
	<ol>
<li>Nöronlar bir 100 X Petrol mercek ile içinde fluorescently öğesini proteinlerin hareketlerini takip. Nöronlar sahip uygun cDNA yapı transfected. İçin 150 çerçeveleri yakalamak (Toplam 300 s) 2 s aralığı ile. Not: Bazen, aynı anda birden fazla protein fluorescently öğesini hareketi görüntüye birden çok renkli hızlandırılmış görüntüleme yapılır.</li>
		<li>Bir kymograph video yazılım yakalama veya aracılığıyla ImageJ (NIH) oluşturur. Not: Hız ve yön seyahat kymograph kullanarak belirlenebilir. * Emin soma bölgeden yatıyor yönünü unutmamak yakalanması. Aksonal ipucu soma uzak seyahat anterograd soma doğru seyahat retrograd, iken.</li>
		<li>Tekrar bu işlemi şişirme, veya kymograph görüntü yakalama sırasında şişirme tahlil kullanılarak oluşturulabilir. Not: mitokondri ve sinaptik proteinler aksonal taşımacılığının şişirme etkileri bir son kağıt4' te gösterilmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kalsiyum görüntüleme
	<ol>
<li>1 µL (için 24-şey plaka) ya da 5 mm Fluo-4 (6-şey plaka için) 3 µL eklemek AM medya bir şey ve 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya kültürüne.</li>
		<li>1 mL Hank'in arabellek iki kez hücrelerle yıkayın. Not: Yüklenen nöronlar FITC filtre kümesi yeşil Floresans yayarlar. Loci hücre içinde kayda değer kalsiyum bölgeleri gösterir. Şişirme ile birleştirildiğinde, yoğunluğu (iç kalsiyum düzeyinde artış) bir artış görülebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Varisler kurtarma Not: Hemen şişirme bir deney, bir 20 dk kurtarma deneme yapılabilir.<ol>
<li>300 kare için çekim (1.200 s) 4 s aralığı ile. Not: bir hücre ile YFP/mCherry/GFP çözünür transfected makul ses seviyelerinde (% 50'den az) görüntüleme oturum bitmeden kurtarma göstermelidir. Aksonal kurtarma bir dizi faktöre, kültürlü nöronlar4gelişim aşaması gibi bağlıdır. Bu da yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme ve yukarıda açıklanan kalsiyum görüntüleme ile kombine edilebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nikić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 17, 495-499 (2011).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+degeneration+after+injury+and+in+development+by+the+endogenous+calpain+inhibitor+calpastatin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin.</a> Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).</li>
<li>Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+in+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Information processing in the axon.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).</li>
<li>Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+varicosity+initiation+in+central+neuron+mechanosensation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation.</a> J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).</li>
<li>Chung, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+axonal+stretch+injury+in+vitro+induces+a+progressive+series+of+neurofilament+alterations+ultimately+leading+to+delayed+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy.</a> J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).</li>
<li>Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin-A+treatment+attenuates+delayed+cytoskeletal+alterations+and+secondary+axotomy+following+mild+axonal+stretch+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury.</a> Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+interruption+of+axonal+transport+due+to+microtubule+breakage+accounts+for+the+formation+of+periodic+varicosities+after+traumatic+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury.</a> Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).</li>
<li>Donkin, J. J., Vink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cerebral+edema+in+traumatic+brain+injury%3A+therapeutic+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments.</a> Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).</li>
<li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li>
<li>Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/23/1/015002">Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis.</a> J. Micromech. Microeng. 23, 015002(2013).</li>
<li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li>
<li>Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+heterogeneity+of+the+rat+hippocampus+measured+by+atomic+force+microscope+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation.</a> J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).</li>
<li>Franze, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+branch+retraction+is+caused+by+a+threshold-dependent+mechanical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact.</a> Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).</li>
<li>Campàs, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu microbiomechanical tahlil düz ön işlemdir. Eğer onun adımları dikkatlice yürütülen güvenilir sonuçlar üretecektir. Uygun olmayan şekilde gerçekleştirdiyseniz, başarılı veri toplama engel olacak çeşitli anahtar adımlar vardır. Akıntıya karşı kritik adımlara başlamadan şişirme uyarıcı gerçek uygulamanın. Dikkatli diseksiyon, kültür ve bakım birincil nöron kültürünün olağanüstü vardır. Kültürlü nöronlar sağlıklı değilse, onlar zaten stres için astarlanmalıdır bu ya...

Varisler oluşumu veya şişlik/boncuk, akson, boyunca önemli bir özelliğidir birçok bozuklukları veya yaralanma multipl skleroz, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin gözlenen ateş ve travmatik beyin yaralanması1,2. Aksonal varicosities aksiyon potansiyeli yayma ve sinaptik iletimi3önemli fizyolojik etkileri rağmen varicosities nasıl oluşturulduğunu bilinmemektedir. Son zamanlarda, yeni kurulan microbiomechanical tahlil kemirgenler kültürlü Hipokampal neurons kullanarak, mekanik uyaranlara varicosities son derece ilginç özellikleri ile bu nöronlar içinde tetikleyebilir buldum. İlk olarak, varisler indüksiyon hızlı (< 10 s) ve bu işlem beklenmedik bir şekilde geri alınabilir. İkinci olarak, varisler başlatma basınç şişirme gücüne bağlıdır: yüksek basınç, hızlı başlatma. Üçüncü olarak, varisler başlatma nöronal yaş üzerinde bağlıdır. Genç nöronların aksonlar mekanik stres, büyük nöronlar için göre daha duyarlı görünür. Dördüncü olarak, süre dendrites ve ilk axon kesimleri bu nöronların Hipokampal nöronlar akson boyunca varicosities şeklinde değişiklik yok aynı şişirme koşul altında görüntüler. Böylece, bizim çalışma nöronal polarite roman bir özelliği ortaya koydu. Bu bulgular vitro sistemiyle fizyolojik ilgilidir. Vivo modeli hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) kullanarak, biz aksonal varicosities hemen sonra Kapat-kafatası etkisi, bizim vitro ile tutarlı fareler somatosensor korteks multifokal bir biçimde geliştirilen gösterdi sonuçları4. Boyama ve görüntüleme mTBI farelerin sadece bir görüntüsü nöronal morfolojik değişiklikler sağlamak, in vivo performans beri nöronal Morfoloji hızlandırılmış görüntüleme sırasında bir mekanik etkisi hala mümkün değil unutmamak önemlidir.
Bu sıvı şişirme sistem sadece mekanik stres kaynaklı varisler oluşumu ile ilgili benzersiz özellikleri yakalamak için ama aynı zamanda temel mekanizması belirlemek için izin verdi. Farklı hücre dışı çözümler, blokerler ve mechanosensitive iyon kanalları ve hücresel Elektrofizyoloji farklı adayların açacakları test ederek, biz geçici reseptör potansiyel katyon kanal bu alt familya V üye 4 (TRPV4) tespit Ca2 + ve Na+ geçirgen ve Şişirme tarafından aktive kanal aksonal varisler oluşumu4sırasında ilk mekanik stres algılamak için esas olarak sorumludur. Bu daha da bir siRNA nakavt yaklaşım ile doğrulandı. Birlikte, Hipokampal nöron kültürü ile hazırladığımız bu yeni tahlil sistem ele alındığında, diğer teknikleri ile birlikte özellikle merkezi nöronların micromechanical özelliklerini çalışmak için son derece değerlidir.
Biz kurduk bu micromechanical sistemi benzersizdir ve birkaç önemli yönü daha önce var olan sistemleri farklıdır. İlk olarak, bu sistemde nöronlar uçak mekanik stres sıkıştırma ve yamultma şekillerde deneyim. Mekanik etkisi sırasında nöronal süreçleri coverslip yüzeye bağlı kalır ve hareket etmiyor. Bu deneysel diğer esas olarak bükme ve uçak-germe dahil sistemleri (veya gerilim) farklıdır, örneğin, birlikte aksonlar saptırma gibi dizeleri5,6 taşıyarak veya micropatterned üzerinde yetiştirilen aksonlar yayarak kanalları ve gerilebilir membranlar7,8. Ayrıca, aksonlar varicosities da içinde indüklenen her ne kadar bu deneyleri gibi sistemimizde sıvı şişirme, bu ayarları sürecinde (üzerinden birkaç saat6,7,810 dk) çok daha fazla zaman alır ve görünür geri alınamaz. Son olarak, sistemimiz yerel sıvı şişirme kullanarak varisler oluşumu uzamsal özelliklerinin incelenmesi sağlar (örneğin., dendrites, dendritik omurgalar, soma, aksonlar ilk kesimleri, aksonlar terminalleri), zamansal özellikleri yanında. Bu sistemi kullanarak, biz birkaç beklenmedik ve benzersiz özellikleri aksonal varisler oluşumu, özellikle hızlı başlangıçlı, yavaş reversibility ve akson-dendrite polarite keşfetti.
Biz bu yazıda görüşmek sistem moleküler ile birçok teknikleri uyumludur ve hücre biyolojisi. Örneğin, nöronal morfoloji ve fonksiyonu mekanik stres etkileri çalışmaya, miyelin coculture ile birlikte, düşsel floresan rezonans enerji transferi (FRET) ve toplam iç yansıma floresan (TIRF), hızlandırılmış kullanılabilmesi için Kalsiyum görüntü ve yama kelepçe kayıt. Bu yazıda, sistemin çekirdek bileşenlerinin odaklanacağız. Hipokampal nöron kültürü, sıvı şişirme Kur, aksonlar taşıma için yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntü ve kalsiyum görüntüleme hakkında adım adım aşağıda gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>12 mm coverslips&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>64-0702</td><td>for 24-well plate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25 mm coverslips&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-545-102&amp;nbsp;</td><td>for 6-well plate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rat tail collagen&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>11 179 179 001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS&amp;nbsp;</td><td>National Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Protease enzyme&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x (P/S)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Earle&#039;s Salts&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosylcytosine (Ara-C)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM media&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>1854313</td><td>transfection reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate rods&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>PG52151-4</td><td>for puffing pipette&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>rubber tubing&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>10cc plastic syringe and plunger</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish (35 mm x 10 mm)</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Molecular Probes</td><td>F14201</td><td>for calcium imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mito-YFP construct&amp;nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>for cell transfection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>YFP-N1 construct&amp;nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>for cell transfection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U Mcroscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor ELWD 20x lens&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>062933</td><td>objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Apo TIRF 100x/1.49 oil lens&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>objective&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a microbiomechanical system for studying varicosity formation and recovery in central neuron axons

Aksonal varicosities akson heterojenite yüksek derecesi ile Miller boyunca genişlemiş yapılardır. Onlar sadece beyin nörodejeneratif hastalıklar veya yaralanma ile ama aynı zamanda normal beyin bulunur. Burada, biz varisler oluşumu ve türdeş olmayan protein kompozisyon yöneten mekanizmalarını anlamamızı sağlayan hızlı, güvenilir ve ters aksonal varicosities, ikna etmek için bir yeni kurulan micromechanical sistemi açıklanmaktadır. Bu sistem farklı hücre altı bölmeleri nöronların, esas olarak germe etkisi üzerinde odaklanmak diğer vitro sistemlerinden farklı sıkıştırma ve kayma stres etkilerini değerlendirmek için bir roman araç temsil eder. Önemlisi, bizim sistemi ve benzersiz özellikleri sayesinde, son zamanlarda basınçlı sıvı uygulama hızla ve geri dönülebilir olarak geçici reseptör potansiyeli kanal etkinleştirmesi üzerinden aksonal varicosities tetikleyebilir gösterilen yeni bir keşif yaptı. Biyomekanik sistemimiz uygun ilaç perfüzyon, canlı hücre görüntüleme, kalsiyum görüntüleme ve yama kelepçe yazmak ile birlikte kullanılabilir. Bu nedenle, bu yöntem mechanosensitive iyon kanalları, aksonlar Taşıma Yönetmeliği, aksonlar sitoiskeleti dinamikleri, sinyal kalsiyum ve morfolojik değişiklikler ile ilgili travmatik beyin hasarı eğitimi için kabul edilebilir.

Şişirme önce akson normalde küçük varisler oluşumu göster. Aşağıdaki bizim standart basınç ile (190 mmH2O yükseklik), birçok boncuk benzeri varicosities geliştirmek için aksonlar Başlat şişirme. Varicosities oluşumu 10 dk kurtarma döneminden sonra (Şekil 2A-B) önceden kahvaltılık durumlarına geri dönen axon bölgelerinde tarafından gösterildiği gibi kısmen tersinir olduğunu. Kurtarma daha uzun bir s...

Watch this Scientific Journal Video about A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons at JoVE.com

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Bu iletişim kuralı bir fizyolojik alakalı, basınçlı sıvı yaklaşım varicosities nöronlar içinde hızlı ve geri dönüşümlü indüksiyon için açıklar.

Varisler oluşumu ve kurtarma merkezi nöron aksonlar içinde çalışmak için bir Microbiomechanical sistemi

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

a-microbiomechanical-system-for-studying-varicosity-formation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.3K Görüntüleme.  The Ohio State University. Bu iletişim kuralı bir fizyolojik alakalı, basınçlı sıvı yaklaşım varicosities nöronlar içinde hızlı ve geri dönüşümlü indüksiyon için açıklar.

Video: A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the 10-1000 &mu;dyne range1,2. Force measurements are obtained through observation of the Hookean bending of the glass needles, which are calibrated by a direct and empirical method3. Equipment requirements and procedures for fabricating, calibrating, treating, and using the needles on cells are fully described. The force regimes previously used and different cell types to which these techniques have been applied demonstrate the flexibility of the methodology and are given as examples for future investigation4-6. The technical advantages are the continuous 'visualization' of the forces produced by the manipulations and the ability to directly intervene in a variety of cellular events. These include direct stimulation and regulation of axonal growth and retraction7; as well as detachment and mechanical measurements on any type of cultured cell8.

Application and direct measurements of forces on neurons in the 2-1000 microdyne range are achieved with high precision using calibrated glass needles. This methodology can be used to control and measure several aspects of axonal development, including axonal initiation, axonal tension, velocity of axonal elongation, and force vectors.

Nöronlar Aksonal Geliştirme Kontrol Mekanik Manipülasyon

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Nörobilim

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Nöron Dejenerasyonu

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Tıp

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

Aksonal Taşımacılığın In Vivo Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Inducing Axonal Varicosities with a Micromechanical Stimulus on Neurons

Source: Servello, D., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57202">A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the induction of axonal varicosities by applying micromechanical stimulus on neurons. The system comprises a micropipette attached to a syringe containing buffer via tubing. Using a micromanipulator, the micropipette is positioned above the neurons. Fluid pressure is then applied to induce varicosities in axons.

Varisler oluşumu ve kurtarma merkezi nöron aksonlar içinde çalışmak için bir Microbiomechanical sistemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Nöronlar Aksonal Geliştirme Kontrol Mekanik Manipülasyon

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery

Bir

Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Aksonal Taşımacılığın In Vivo Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi

Aksonal Varislerin Nöronlar Üzerinde Mikromekanik Bir Uyaran ile İndüklenmesi