We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission&#8217;s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the &#8220;Stem Cells Call for Proposals.&#8221; This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by &#8220;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&#8221;.

1.. Aksonal Etiketleme <ol><li> Tırmanma lifler yüksek molekül ağırlıklı dekstranlar veya floresan protein 26-29 sentezlenmesini uyaran plasmid / virüslere karşı konjuge organik boyalar ya da enjekte edilmesi ile etiketlenebilir. Bu protokolde, organik boya Dekstran Alexa Fluor 488 tırmanma elyaflar ve etiket (Şekil 1), serebellar korteks Onları görselleştirmek için alt oliva enjekte edilir. Burada açıklanan tüm prosedürler İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır. </li><li> Bir mikropipet çektirmesi çekerek cam kapiller tüp hazırlayın. Dış çapı yaklaşık 30 um olan kadar makasla cam kılcal tüpün ucu kesin. </li><li> Dekstran-bağlı boya 1-2 ul kılcal yerleştirin. </li><li> Başlamadan önce, bir otoklav içinde, tüm cerrahi aletler sterilize edin. İşlem sırasında, bir cam boncuk sterilizatör kullanılarak kontaminasyon riskini azaltır. </li><li> Fareyi (9-12 anestezisiketamin (90 mg / kg) ve ksilazin (9 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile hafta). Hayvan tam kuyruk ve / veya ayak tutam kullanılarak sedasyon emin olun. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın. </li><li> Bir jilet veya tüy dökücü krem ​​ile ya boyun üzerinde tüyleri tıraş. Etanol% 70 ile dönüşümlü betadin, iki kez cerrahi yerin silinmesi. </li><li> Stereotaksik tutucuya fare yerleştirin. Bir ısıtma pedi ile hayvan sıcak tutun. </li><li> Baş sıkıca tutulur şekilde hafifçe yanındaki kulaklara kemik üzerinde earbars itin. Gövde ile 140 ° açı oluşturacak şekilde baş aşağı çevirin. Istenen yönlendirme yavaşça stereotaktik tutucuya burun tutucu çubuğun yüksekliğini değiştirerek elde edilebilir. </li><li> Kulak arasında ciltte lidokain bazı damla uygulayın. Oksiputa altındaki cilt üzerinde yaklaşık 1 cm&#39;lik dikey bir kesi gerçekleştirmek için forseps veya bir tıraş bıçağı kullanma. </li><li> Yavaşça künt cımbız ile deri altı doku ve kasları ayrıDiseksiyon mikroskobu altında. Yatay kas demeti aşağı doğru itin ve foramen magnum üzerinde dura ortaya koymak için iki dikey kaslar fasiküller ayrı tutun. </li><li> Çok dikkatli kullanılması, beyin sapı ortaya çıkarmak için bir şırınga iğnesi ya da çok keskin forseps ile dura teşrih. Dura kesilmiş edildiğinde beyin-omurilik sıvısı küçük bir miktar dökülebilir. </li><li> Stereotaktik mikromanipülatör, dikeyden kapiler 45 ° &#39;lik tutucuyu döndürün. Serebellar korteks kuyruk kenarı ve ilk servikal omur arasındaki orta noktada, orta hatta kılcal yerleştirin. Yüzeyden 2 mm derinlikte pipet yerleştirin. </li><li> 10-15 dakika boyunca bir boya 0.5-1.5 ul hacmi sunun. Bir mikroenjeksiyon dağıtma sistemi, kılcal içindeki sıvının kontrollü basınç dağıtımını sağlar: (Pulse basıncı = 20 psi; darbe süresi = 3-4 msn, darbe doğum = 12 Hz arasında frekansı). </li><li> Daha sonra, 15 dakika boyunca yerinde kılcal bırak slowly (2-3 dk) çıkarın. İncelikli kasları yeniden ayarlamak ve üzeri cilt sütür. De işlem boyunca bazı tuzlu su uygulayarak sulu kasları tutun. </li><li> Su kaybını önlemek için, deri altına 0.5 ml% 0.9 NaCl enjekte edilir. Anesteziden tam iyileşme kadar ısıtılmış bir kafeste hayvan tutun. </li><li> Deri altına ameliyattan sonra 2-3 gün süreyle günde Carprofen (5 mg / kg) uygulanması. </li></ol> Serebellar Korteks 2. Optik Pencere Not: boya (bkz. Şekil 1) CFS terminallere serebellar korteks için alt olivary çekirdekten yukarıya 2 hafta içinde taşınmaktadır. Seyrek etiketli CFS aşağıdaki gibi gerçekleştirilebilir sürekli kafatası pencerenin altında görüntülenmiştir olabilir: <ol><li> Tüm cerrahi aletler sterilize. </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi fare anestezisi. Hayvan kontrol etmek için ayak tutam kullanmak tam sedasyon. </li><li> Sk silin, baş yukarıda saçlarını tıraş% 70 alkol ve betadin alternatif bira ile ve göz merhemi uygulanır. Bir stereotaksik çerçeveye fare yerleştirin ve sıkıca kafa tutmak için kulak çubukları yerleştirin. </li><li> Deri altına, kraniyal pencere yerinde beyin ve olası iltihaplanma şişme önlemek deksametason (0.2 mg / kg) ve Carprofen (5 mg / kg) uygulanması. </li><li> Kulak arasında gözlere yukarıda, kafatası üzerinde ciltte lidokain bir damla ve bir kanat kesti. Bir neşter ile kazıma önce periost üzerine tekrar lidokain çözümü uygulayın. </li><li> Beyincik Yukarıdaki kafatası ince bir yarım daire bölgeye diş matkap kullanın. Kafatası derinliği yarım daire çevresi boyunca hemen hemen sabit böylece penceresi genellikle, orta ve arka dikişin doğru yerleştirilir. Bu çok kalın bir bölgesi üzerinde lambda dikiş ve tekrar delme çok yakın bir pencere konumlandırma ödemlerin beyin ve oluşumu aşırı ısınmaya neden olabilir. </li><li> Hemostatik Uygulakanama durumunda kafatası sünger. </li><li> Bir jilet cımbız yardımı ile iki yarısı bir coverglass kesin. Coverglass kemik adası biraz daha büyüktür ve cımbız ile kemik kapağı çıkarmadan önce benzer bir şekle sahip olduğunu kontrol edin; değilse, coverglass yeniden şekillendirmek veya başka bir tane seçin. Kemik çizerken cımbız ile dura mater dokunmayın. Dikkatle dura üzerine coverglass uzandı. NOT: dura üzerinde, camın tüm yüzey yapışma uzun süreli beyin pencerelerin önceden bildiren edilir. </li><li> Art arda tuzlu su çözeltisi ile durulama ve pamuk sopalarla kurutulmasıyla cam altında hava kabarcıklarını çıkarın. Bu da camını yerleştirdikten sonra küçük kılcal damarlar dışarı dökülen olabilecek bazı kalıntı kan kaldırarak yardımcı olacaktır. Akrilik yapıştırıcı ve diş çimentosu 30 oluşan bir karışım ile pencereyi kapatın. </li><li> Tam anestezi kurtarıldı kadar bir kurtarma odasında bir ısıtma pedi üzerinde hayvan tutun. Re etmeyintamamen iyileşti kadar evde kafes içinde fareler açmak; Onlar sternal yatma korumak için yeterli bilinç kazanmış kadar onları yalnız bırakmayın. </li><li> Deri altına ameliyattan sonra 2-3 gün süreyle günde Carprofen (5 mg / kg) uygulanması. </li></ol> 3.. Vivo Multi-foton Lazer Axotomy <ol><li> Ilk görüntüleme oturumu gerçekleştirmeden önce ameliyat 2-7 gün bekleyin. Sapphire lazer kaynağı (120 fs genişlik bakliyat, 90 MHz tekrarlama oranı) ilk galvanometrik aynalar, bir çift tarafından taranan ve daha sonra bir su daldırma 20X tarafından numune üzerine odaklanmıştır: Burada kullanılan iki foton mikroskop yerleşik özel bir Ti ile sağlanır objektif (NA 0.95, WD 2 mm). Bir kapalı devre piezoelektrik aşamalı hedefi 400 mikron kadar eksenel değiştirmeleri gerçekleştirir. Photomultiplier tüpler floresan sinyalini toplar. </li><li> Kafatası penceresi objecti paralel bırakır, böylece hayvan anestezisi, daha sonra stereotaktik bir tutacak içerisine baş pozisyonuodak düzlemi ettik. </li><li> TPF kranial pencerenin altında korteks görüntüleme ile keşfedin. Parlak olanlar arasında hasarlı akson seçin. </li><li> Z-yığını Edinme hedef akson bir 3D rekonstrüksiyon elde etmek için (genellikle görüş alanı 512 x 512 piksel, 2 mikron z-ekseni adımında, 100 x 100 mikron 2). Görüntülü hacmi içinde, odak düzlemi çoğunlukla paralel uzanan bir akson dalında lezyon site seçin. Bu yönelim hızla başarılı bir diseksiyon akıllı olan morfolojik değişiklikler, puan sağlar. </li><li> Bir CF uzak bir bölümüne seçilen noktasında dozu yüksek bir enerji ile ışın tedavisi. Bu Labview yazılım aracılığıyla yapılır: (~ 4 bir satır tarama yapmak galvanometrik ayna konumunu ayarlamak, görüntüleme (objektif lens sonra ölçülen ≈ 300 mW) için kullanılan güç daha 5-10x daha fazla lazer gücünü arttırmak - 10 lezyon sitede mikron) ve 400 için lazer kapağını açın - 600 msn. Çizgi tarama oryantasyonCF düzlemine dik transeksiyonu tamamen akson için. Parlak noktalar (örn.., Varisler) aydınlatarak genellikle akson diseksiyon yardımcı olur. Lazer dalga boyu axotomy için görüntüleme (920 nm) için kullanılan ile aynıdır. </li><li> Genellikle ışınlanmış alanında akson floresans geçici ışıkla ağartma nedeniyle azalır. Işınlama ablasyon iyi bir performans sağlamak için edilmiş sonra aynı bölgenin birkaç dakikalık bir yığın elde edin. Bölge şişmeye başladı ve akson boncuk benzeri yapılar oluşmuş ise, nöron başarıyla disseke edildi. Bu durumda, birkaç saat içinde (dk birkaç on 24 saat için) akson distal kısmı dejenere ve tamamen kaybolur. </li><li> Ne yazık ki, bir tam axotomy üretmek için gerekli enerji dozu her zaman tahmin edilebilir değildir. Işınlama tek sonucu, foto ağartıcı ise, hızlı bir şekilde difüzyon floresan boya nedeniyle geri olmalı ve ışınlama etkili tekrar tekrar edilmelidirly akson teşrih. Ayrıca durumda şişlik belirtileri 5 dahilinde görünmüyor - artan Yeni taramalar ile tekrar deneyin, (. Benzer lazer dendrotomy için tarif edilmiştir ne Allegra Mascaro ark 23 bakınız) 20 dakika, ya da şişme kurtarma takip ediyor süresi ve / veya lazer gücü bekletilmiştir. </li><li> Vivo görüntüleme iki-foton ile lazer axotomy takip günlerde akson nihai yeniden Monitör (Şekil 2 ve 3). Vasküler desen şu günlerde disseke akson almak için referans model olarak kullanılır. </li><li> Deri altına Carprofen (5 mg / kg) Deney süresinin tamamı boyunca her görüntüleme oturumu yönetmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Strata, P., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+olivocerebellar+pathway.">Plasticity of the olivocerebellar pathway.</a> Trends Neurosci. 21, 407-413 (1998).</li><li>Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reparative+mechanisms+in+the+cerebellar+cortex.">Reparative mechanisms in the cerebellar cortex.</a> Prog Neurobiol. 72, 373-398 (2004).</li><li>Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Sacconi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).</li><li>Allegra Mascaro, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+single+branch+axotomy+induces+GAP-43-dependent+sprouting+and+synaptic+remodeling+in+cerebellar+cortex.">In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).</li><li>Ylera, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronically+CNS-injured+adult+sensory+neurons+gain+regenerative+competence+upon+a+lesion+of+their+peripheral+axon.">Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon.</a> Curr Biol. 19, 930-936 (2009).</li><li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+single+neuron+axotomy+triggers+axon+regeneration+to+restore+synaptic+density+in+specific+cortical+circuits.">In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits.</a> Nat Commun. 4, 2038 (2013).</li><li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+elimination+and+protection+after+minimal+injury+depend+on+cell+type+and+their+prelesion+structural+dynamics+in+the+adult+cerebral+cortex.">Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex.</a> J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog,+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres.">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .</li><li>Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration+and+regeneration+a+mechanistic+tug+of+war.">Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war.</a> J Neurochem. 108, 23-32 (2009).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Luo, L., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+retraction+and+degeneration+in+development+and+disease.">Axon retraction and degeneration in development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).</li><li>Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanycytes+present+in+the+adult+rat+mediobasal+hypothalamus+support+the+regeneration+of+monoaminergic+axons.">Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons.</a> Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).</li><li>Morrison, E. E., Costanzo, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+olfactory+sensory+neurons+and+reconnection+in+the+aging+hamster+central+nervous+system.">Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system.</a> Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).</li><li>Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+therapeutics+regeneration+or+sprouting+or+plasticity.">Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity.</a> Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Two-Photon+Excitation+Microscopy+and+Its+Applications+to+Neuroscience.">Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptors+regulate+dynamic+equilibrium+of+presynaptic+terminals+in+mature+hippocampal+networks.">AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks.</a> Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).</li><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li><li>De Paola, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+structural+plasticity+of+axonal+branches+and+boutons+in+the+adult+neocortex.">Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex.</a> Neuron. 49, 861-875 (2006).</li><li>Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+nanosurgery+in+live+brain.">Multi-photon nanosurgery in live brain.</a> Frontiers in neuroenergetics. 2, 21 (2010).</li><li>Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+cerebellar+Purkinje+cells+by+climbing+fibres+surviving+a+subtotal+lesion+of+the+inferior+olive+in+the+adult+rat.+II.+Synaptic+organization+on+reinnervated+Purkinje+cells.">Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells.</a> The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).</li><li>Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reparative+mechanisms+in+the+cerebellar+cortex.">Reparative mechanisms in the cerebellar cortex.</a> Progress in neurobiology. 72, 373-398 (2004).</li><li>Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sprouting+and+axonal+atrophy+in+cerebellar+climbing+fibres+following+in+vivo+silencing+of+the+growth-associated+protein+GAP-43.">Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43.</a> PLoS One. 6, e20791 (2011).</li><li>Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+motility+and+its+modulation+by+activity+are+branch-type+specific+in+the+intact+adult+cerebellum.">Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum.</a> Neuron. 56, 472-487 (2007).</li><li>Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entire+trajectory+of+single+climbing+and+mossy+fibers+in+the+cerebellar+nuclei+and+cortex.">The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex.</a> Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).</li><li>Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+trophic+interactions+between+climbing+fibres+and+Purkinje+cells+in+the+rat+cerebellum.">Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum.</a> Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. (12), (2008).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Bu protokol, bir floresan boya ile alt zeytinin nöronlar etiket gösterilmiştir. Daha sonra, serebellar korteks üzerinde bir kafatası pencere yapmak için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu teknik olivocerebellar nöronlar, tırmanma liflerin terminal kısmı için optik erişim sağlamaktadır. Ne yazık ki, etiketleme ve kraniotomi cerrahi hem de sonucu (genellikle 3 farelerin üzerinden 1 etiketli ve 1 out of 3 kafatası pencereleri 1-2 hafta sonra açık kalır) bile vasıflı operatörler elinde oldukça düş?...

Mekanik yaralanma, zehirli hakaret ya da nörodejeneratif hastalıklara bağlı aksonal transseksiyon genellikle hücre gövdesi 10-13 ayrılır akson distal kısmının dejenerasyonu tarafından takip edilir. Birkaç istisna dışında 2,7,14,15 ile, yetişkin hayvanların MSS kopmuş aksonlar genellikle büyütme programı 16 aktive edemiyoruz. Küçük, hücresel düzeyde dejeneratif olayların gerçek-zamanlı dinamikleri hakkında bilinmektedir. Nöronal hasarı sınırlama ve sinir hücrelerinin yeniden büyümesini teşvik için yeni stratejilerin geliştirilmesi singularly yaralı nöronal hücreleri ölür ve yeniden hangi mekanizmasını açıklığa kavuşturulması, bir ilk adım olarak, gerektirir. Bu çalışma, en doğrudan in vivo tek bir nöronun dinamiklerinin görüntülenmesi tarafından ele alınmaktadır. Bir foton flüoresan görüntüleme teknikleri görünür ışık yoğun bir saçılma ile sınırlı olsa da, iki foton uyarma li derin kortikal katmanları ulaşırsubsellüler çözünürlük 3,4,17 ile fareler ettik. Floresan proteinleri selektif nöron 18-20 alt grupları olarak ifade edildiği transjenik farelerin yararlanarak, TPF mikroskopi vivo 21,22 gelişme sırasında sinaptik plastisite ve aksonal uzama keşif uygulanmıştır. Tek başına hasar görmüş sinir hücrelerinin T o yeteneği için yaralanma özellikle ilgi akson hedefleyen yaralanma modeli ile iki foton görüntüleme ile vivo izleme bağlantısı ile incelenebilir sonra tekrar kavuştu. Femtosecond palslarının çoklu foton emme tek dendrit ya da tek dikenler 5,23 bozmak için kullanılmıştır. Ayrıca, bu yaralanma paradigma temas dendrit 6 aksatmadan tek akson dalları kesme sağlar. Kez hasar, serebellar tırmanma lifler (CFS) aksonları yeniden belirli nöronal nüfusu izin özellikleri diseksiyon kapsamında yararlı bir model si vardırnce onlar bile yetişkin hayvanlarda 24,25 yaralanmadan sonra olağanüstü plastik özelliklerini korurlar. Son zamanlarda, CFS uzun süreli görüntüleme bu aksonlar lazer axotomy 6 takip günlerde regrowing yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir. Bu protokol anterograde izlemesi ile olivocerebellar nöronlar ve bunların akson uzamasını etiketlemek için nasıl açıklar. Ilgi konusu nöronlar floresan etiketli sonra, bir kafatası pencerenin altında hafta veya ay boyunca rasgele zaman noktalarında tekrar tekrar izlenebilir. In vivo lazer axotomy tarafından tek akson dalları incelemek için prosedürü daha sonra açıklanacaktır. Burada sunulan teknikler in vivo aksonal yeniden mekanizması yeni bakış açıları ve nöronal dejenerasyonu sınırlamak ve akson büyümesini teşvik etmek için tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab standard stereotaxic, rat and mouse</td>
			<td>Stoelting&#160;</td>
			<td>51670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500 (Glass bead sterilizer)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection dispense system</td>
			<td>Picospritzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R)</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>64-0720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses,&#160; 90 MHz repetition rate</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spongostan, haemostatic sponge&#160;</td>
			<td>Ferrosan</td>
			<td>MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirrors&#160;</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective&#160;</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN 20XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric stage&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier modules&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>H7710-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW System Design Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate)</td>
			<td>Boheringer Ingelheim</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rymadil (carprofen)&#160;</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine clorohydrate 2%</td>
			<td>ATI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 dextran</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser nanosurgery of cerebellar axons in vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Bu protokol tek nöronların aksonal etiketleme, in vivo görüntüleme ve lazer axotomy nasıl gerçekleştirileceği açıklanmıştır. Deneyin çizelgesi, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Alexa Fluor 488 Dekstran ile etiketlenmiş ve in vivo iki foton mikroskobu ile kafatası pencerenin altında görüntülendi CFS bir örnek, Şekil 2&#39;de verilmiştir. Önce 6,27 bildirdiği gibi, artan dalları birkaç gün gözlem sü...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo at JoVE.com

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Lazer nanodissection bağlanmış iki foton görüntüleme, hücre içi çözünürlük ile merkezi sinir sisteminin dejeneratif ve rejeneratif işlemlerini incelemek için yararlı araçlardır. Bu protokol, etiket görüntü ve in vivo serebellar korteks bir tırmanma lifleri incelemek için gösterilmiştir.

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

laser-nanosurgery-of-cerebellar-axons-in-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

8.1K Görüntüleme.  University of Florence.  Lazer nanodissection bağlanmış iki foton görüntüleme, hücre içi çözünürlük ile merkezi sinir sisteminin dejeneratif ve rejeneratif işlemlerini incelemek için yararlı araçlardır. Bu protokol, etiket görüntü ve in vivo serebellar korteks bir tırmanma lifleri incelemek için gösterilmiştir. 