Naoya Asai Nagoya Üniversitesi'nde düşük sıcaklık antijen alma serbest yüzer değişir bölümleri için gelişimi için yararlı öneriler verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser 2012 (JP25460493) Scientific Research (KAKENHI) (C) için Grants-in-Aid tarafından desteklenen ve (B) 2017 (JP17H04065)--dan Japonya toplum için promosyon, bilim (JSP'ler) üzerinden 2014 (AS251Z02522Q) ve 2015 (AS262Z00715Q) A-adım verir Japonya bilim ve teknoloji Ajansı (JST) ve vizyoner bir Takeda Takeda Bilim Vakfı Hibe 2014 (yüksek lisans için) araştırma.

Tüm yöntem tanımlamak burada hayvan bakım ve gelişimsel araştırma, Aichi insan Servis Merkezi Enstitüsü kullanım Komitesi tarafından kabul edildi (uygulama numarası: M-03).
1. hazırlıkları
<ol><li>Fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 L hazırlamak: 32.27 g Na2HPO4·12H2O, NaH2PO4·2H2O, 4,5 g NaCl 80.0 g (RT) oda sıcaklığında 10 L. mağaza çözümün nihai bir birime ultrasaf su eklenir.</li>
	<li>PBS-T: 200 mL PBS adım 1.1 ile polyoxyethylene(10) octylphenyl eter 100 µL % 0.05 (vol:vol) son bir konsantrasyon için 200 mL hazırlayın. Mağazada RT.</li>
	<li>Eldiven ve göz koruması giyen, 50 mL % 15 Sükroz arabelleğe alınan % 10 tarafsız formalin çözümde hazırlamak: 7.5 g Sükroz % 10 eklendi, tarafsız formalin çözüm (Tablo reçetesi) 50 mL nihai bir birime arabelleğe alınmış. Mağazada RT. Dikkat: Arabelleğe alınan % 10 tarafsız formalin çözüm içinde formaldehit teneffüs ve/veya deri/göz kişiyle tehlikeli olabilir. Dikkatli bir şekilde başa.</li>
	<li>1.5 mL 200 adet/mL phalloidin-floresan boya eşlenik stok çözeltisi hazırlamak: phalloidin-floresan boya eşlenik (1 flakon, liyofilize katılar, uyarma ve emisyon dalga boylarında 300 kontur: 581 nm ve 609 nm, sırasıyla) 1,5 mL askıya metanol. Karanlıkta-20 ° C'de çözümde mağaza</li>
	<li>5 mg / mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole hazırlamak, dihydrochloride (DAPI) stok çözüm: DAPI 10 mg 2 ml n, N-dimethylformamide (DMF). Karanlıkta-20 ° C'de çözümde mağaza</li>
	<li>%5 sığır serum albumin (BSA) PBS içinde hazırlamak: 0.5 gram BSA, PBS 10 mL. 4 ° C'de mağaza</li>
	<li>Eğimli bir nipper kullanarak bir 18'lik düz iğne ucunu kaldırın ve sıvı iğne Lümen (şekil 1A1) akış izin vermek için bir boyuna yönde nipped sonuna bir pincher ile çimdik. Not: Protokol burada duraklatılmış.</li>
</ol>2. hayvan diseksiyon ve yalıtım değişir
<ol><li>Bir fare perfüzyon fiksasyonu<ol>
<li>Eldiven giymek ve iyi havalandırılan bir alanda iş.</li>
		<li>100 mL cam kabı hazırlamak, % 10 arabelleğe tarafsız formalin çözüm, cerrahi araçlar (makas, pens), metalik bir tepsi, 6-0 naylon dikiş, 1.7 olduğu gibi hazırlanan bir 18'lik düz iğne kesmek bir 22'lik kanatlı iğne, 20 mL şırınga.</li>
		<li>20 mL % 10 arabelleğe alınmış tarafsız formalin çözeltisi cam kabı 20 mL şırınga yük ve 22'lik kanatlı iğne prizine takın.</li>
		<li>Sıvı jelatin PBS (son % 5 jelatin) 20 ml 50 mL santrifüj tüpü içinde 1 g jelatin tozu ekleyerek hazırlayın. RT 15 dakikadır iliklerine kadar bir su banyosu için 15 dk 50 ° C'de kuluçkaya sallayarak olmadan.</li>
		<li>Kısaca girdap ve başka bir 15 dakika jelatin tamamen erimesi 50 ° C'de kuluçkaya. Tüp kadar kullanmak RT bırakın.</li>
		<li>Yetişkin bir fare tarafından servikal çıkığı ötenazi.</li>
		<li>Adım 2.1.6 fareden metalik bir tepsiye yerleştirin ve cerrahi araçlarını kullanarak ensiform kıkırdak ile cilt üzerinde küçük bir kesi yapmak.</li>
		<li>Kesik göğüs ve karın bölgelerinde ortaya çıkarmak için her iki el ile genişletin.</li>
		<li>Diyafram ortaya çıkarmak için karın zarını açın ve sonra her iki tarafta diyaframı açın.</li>
		<li>Her iki tarafta anterior aksiler çizgisinde göğüs kafesi kesilmiş, sonra kalp ortaya çıkarmak için timus konumunda enine yönde keserek torasik duvarın kaldırın.</li>
		<li>Kanı ve bir 22'lik kanatlı iğne sol ventrikül apex eklemek için sağ atrium auricle üzerinde küçük bir kesi yapmak. % 10 kurcalayarak sıvı için itme pistonu tarafsız formalin çözüm arabelleğe alınmış.</li>
		<li>Pelvis organlarda ortaya sonra rektum anüs üzerinden sonu kesti ve bağırsak bıçaklanmasından kesim tarafından vücuttan ayrı.</li>
		<li>Değişir yalıtmak için bağırsak mide test anal tarafındaki 4 cm kesti. Kalan ince bağırsak anal yarısı atın.</li>
		<li>Değişir reçeteye göre sarf yordamı kolaylaştırmak için ikiye küçük. Yük % 10 20 mL tarafsız formalin çözüm 20 mL şırınga arabelleğe alınmış ve çıkış 1.7. adımda hazırlanan 18'lik düz iğne ekleyebilirsiniz.</li>
		<li>Arabelleğe alınan % 10 tarafsız formalin eriyik--dan bir son-in kirpik değişir bağırsak içeriğini floş için ve gut Lümen yüzey (şekil 1A2) düzeltmek için enjekte.</li>
		<li>Gut Lümen 2.1.15 adımda anlatıldığı gibi PBS enjekte edilerek yıkayın.</li>
		<li>PBS ile sıvı jelatin yerine 2.1.15 adımda açıklandığı gibi bağırsak Lümen içine sıvı jelatin floş.</li>
		<li>6-0 naylon kullanarak dikiş ligasyonu tarafından kısaltıldı değişir yakın bir ucunu dikiş kesip, değişir sıvı jelatin ile doldurun ve ucunu dikiş ligasyonu (şekil 1A3) kapatın.</li>
		<li>Depresif bölümüne bir cryomold (şekil 1A4) bir sosis şeklinde değişir bölümü sığacak şekilde dört dikiş knot ekleyin. Not: bir 20 x 25 mm x 5 mm depresif bölümü ile cryomolds için bir ~ 20 mm sosis gibi değişir bölümü tercih edilir.</li>
		<li>50 ml % 15 Sükroz gecede 4 ° C'de % 10 arabelleğe alınmış tarafsız formalin çözümde dokular emmek Not: Aşağıdaki adımları cryoprotection tarafından jelatin ve doku formalin sukroz ve protein fiksasyon tarafından emin olun. Oysa RT. sabit olmayan gelatinized jelatin 4 ° C'de erir formalin gelatinized jelatin RT eritmek değil</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. donma jelatin dolu değişir dokuların oturtun
<ol><li>Dikiş saatte mil hızla değişir kesim tarafından üç sosis gibi değişir taşlarla bakmaksızın her iki ucu (şekil 1A4) elde edilir. Sosis gibi parçalar halinde dondurulmuş doku numunelerin hazırlanması için bileşik katıştırma ek bir cryomold hizalayın.</li>
	<li>Ek nitrojen ile soğutmalı isopentane cryomold dondur. Cryomolds-80 ° C'de depolayın Not: Protokol burada duraklatılmış.</li>
</ol>4. tutam ayirt serbest yüzer Cryosections kullanarak hücreleri
<ol><li>Cryosectioning<ol>
<li>Cryostat Oda sıcaklığı (CT) ve nesne sıcaklık (OT)-22 ° c için ayarla Yer donmuş doku engellemek için en az 15 dakika cryostat odasında bir cryomold içinde.</li>
		<li>PBS 3 mL 35-mm kültür yemek için ekleyin.</li>
		<li>Donmuş doku blok cryomold kaldır ve blok değişir enine bölümünü ortaya çıkarmak için bir tıraş bıçağı ile ikiye böldüm. Bir mount kesme düzleminin jilet ile bölüm için bir ayna (cryostat adaptör) blokta yarısı.</li>
		<li>Bölüm 30 µm kalınlığında bölümlere jelatin dolu değişir. Forseps yavaşça 4.1.2 (şekil 2Bdeğil) adımda hazırlanan 35-mm kültür çanak içine bölümleri aktarmak için dondurulmuş kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Birincil antikorlar uygulanması<ol>
<li>3 hafif sallayarak üzerinde karşılıklı bir shaker ile mL PBS-T ile her 5 min için 3 kez 35-mm kültür çanak serbest yüzer bölümlerde yıkayın (yaklaşık 36 kez / dk).</li>
		<li>Hazırlayın Antigen alma çözüm: 0.3 mL 2.7 ml ultrasaf su antijen alma çözüm konsantresi (Malzemeler tablo). Antijen alma çözüm 3 mL serbest yüzer bölüm içeren 35-mm kültür yemek için ekleyin.</li>
		<li>Kapağını kapatın, çanak ve kapak vinil bandın bir şerit ile arasındaki boşluğu mühür ve 50 ° c 3 h için hibridizasyon kuluçka kuluçkaya sallayarak olmadan.</li>
		<li>Çanak kuluçka ve serin RT, 20 dk kaldırın. Vinil teyp kaldırdıktan sonra 3 kez 5 min için her 3 mL ile PBS-T ve hafif sallayarak bölümleri yıkayın.</li>
		<li>PBS-T Aspire edin ve engelleme çözüm (Tablo reçetesi) bölümleri üzerine 5 damla ekleyin. RT hafif sallayarak ile 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Birincil antikor çözüm hazırlamak: PBS %5 BSA 495 µL 5 µL fosfo-Y1798 (pY1798) girdin antikor (Malzemeler tablo) ile. Birincil antikor çözüm (engelleme çözüm kaldırılması gerekmez) bölümler üzerine 500 µL ekleyin.</li>
		<li>Bir oksijen kuluçka odasında çanak yerleştirin ve gecede 4 ° c hafif sallayarak ile kuluçkaya. Not: Gece kuluçka ilâ üç gece için genişletilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İkincil antikorlar uygulanması<ol>
<li>3 kere 5 min için her 3 ml hafif sallayarak ile PBS-t bölümleri yıkayın.</li>
		<li>Seyreltilmiş DAPI hisse senedi çözüm hazırlamak: 2 µL DAPI hisse senedi çözüm (Adım 1.5), PBS 998 µL.</li>
		<li>İkincil antikor çözüm olun: 476 µL PBS, seyreltilmiş DAPI çözüm, phalloidin-floresan boya eşlenik hisse senedi çözüm 12.5 µL, keçi Anti-tavşan IgG-floresan boya eşlenik 1 µL 10.5 µL % 5 BSA (dalga boyu: uyarma 496 nm, emisyon 520 nm).</li>
		<li>PBS-T aspirating sonra ikincil antikor çözümü uygulamak ve hafif sallayarak ile 30 dk için RT, bir ışık korumalı kuluçka odasında kuluçkaya.</li>
		<li>3 kere 5 min için her 3 mL ile PBS-T ve hafif sallayarak bölümleri yıkayın.</li>
		<li>Son yıkama sonra PBS-T kaldırın ve polyoxyethylene(10) octylphenyl eter eksik PBS 3 mL ile değiştirin. Yemek için stereoskopik mikroskop aktarın.</li>
		<li>Bir damlacık bir MAS kaplı beyaz cam slayt ve transfer bir değişir bölümünden P200 damlalıklı ucu kullanarak damlacık amacına ortasına içinde yer 200 µL PBS.</li>
		<li>Bölüm hizalama stereoskopik mikroskop altında ayarladıktan sonra bölümü çevreleyen tüm kalan PBS Aspire edin.</li>
		<li>20 µL sulu montaj medya ekleyin ve 20 x 20 mm coverslip medya üstüne yerleştirin.</li>
		<li>Hemen coverslip kenarları montaj Ksilen tabanlı medya ile kapatın. Slayt üzerinde bir ahşap mappe yerleştirin ve RT 2-3 h için kuvvetlendirmek montaj Ksilen tabanlı medya sağlar. Not: Protokol burada duraklatılmış. Sonra montaj Ksilen tabanlı medya katılaşır, slaytları 2-3 hafta boyunca RT. adlı bir ışık korumalı slayt kutusunda saklanabilir</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. confocal mikroskobu
<ol><li>Daldırma yağ confocal mikroskop 63 X amaçta koyun. Coverslip-slayt geri çevirmek ve slayt sahne alanı üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Lazer dalga boyu 405, 488 ve 555 nm'de alınan TC görüntüleri dijital ortama ve görüntüleri TIFF biçimi (.tiff) kaydedin. Not: floresan boyalar için uygun olan bir algılama filtre seçin (yani, uyarma/emisyon maxima: 358/461 nm, 490/525 ve 590/617).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kuga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+an+actin-binding+protein+Girdin+specifically+marks+tuft+cells+in+human+and+mouse+gut.">Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut.</a> J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).</li><li>Jarvi, O., Keyrilainen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+cellular+structures+of+the+epithelial+invasions+in+the+glandular+stomach+of+mice+caused+by+intramural+application+of+20-methylcholantren.">On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren.</a> Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).</li><li>Enomoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt/PKB+regulates+actin+organization+and+cell+motility+via+Girdin/APE.">Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE.</a> Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).</li><li>Asai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+phenotypes+of+Girdin+germ-line+and+conditional+knockout+mice+indicate+a+crucial+role+for+Girdin+in+the+nestin+lineage.">Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage.</a> Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+VEGF-mediated+angiogenesis+by+the+Akt/PKB+substrate+Girdin.">Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin.</a> Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Girdin+is+an+intrinsic+regulator+of+neuroblast+chain+migration+in+the+rostral+migratory+stream+of+the+postnatal+brain.">Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain.</a> J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).</li><li>Nahorski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCDC88A+mutations+cause+PEHO-like+syndrome+in+humans+and+mouse.">CCDC88A mutations cause PEHO-like syndrome in humans and mouse.</a> Brain. 139 (Pt 4), 1036-1044 (2016).</li><li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Phosphorylation+of+the+G+alpha-Interacting+Protein+GIV+Promotes+Activation+of+Phosphoinositide+3-Kinase+During+Cell+Migration.">Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration.</a> Science signaling. 4 (192), ra64 (2011).</li><li>Omori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Girdin+is+phosphorylated+on+tyrosine+1798+when+associated+with+structures+required+for+migration.">Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration.</a> Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).</li><li>Goto, H., Inagaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+site-+and+phosphorylation+state-specific+antibody.">Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+sensitive+antigen+retrieval+method+for+free-floating+and+slide-mounted+tissue+sections.">A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections.</a> J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).</li><li>Feltkamp-Vroom, T. M., Boode, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+embedding+and+sectioning+technique+for+immunohistochemical+studies+of+minute+specimens+of+tissue.">An embedding and sectioning technique for immunohistochemical studies of minute specimens of tissue.</a> J Clin Pathol. 23 (2), 188-189 (1970).</li><li>Ushida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-embedding+technique+with+low+melting+temperature+gelatin+for+preparation+of+histological+sections.">Pre-embedding technique with low melting temperature gelatin for preparation of histological sections.</a> Proceeding of the Annual Meeting on Technologies in Biological Research. 36, 66-69 (2014).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li><li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit.">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li><li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites.">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol araştırmacılar Histoloji deneyimi olmayan bir tutam hücre (TCs) güvenilir görüntüleri elde etmek izin vermek için tasarlanmıştır. Bu iletişim kuralının üç kritik noktaları vardır: 1) bir özel şirket (elde edildi insan 1798 (pY1798 antikorlar) tirozin fosforile girdin karşı site - ve fosforilasyon durum özel tavşan poliklonal antikorlar kullanımı Immuno-Biological laboratuvarları şirket X =); 2) jelatin dolgu değişir; ve 3) düşük sıcaklık antijen alma. En geniş anlamda, fosforilasyon durum özel antikorlar translasyonel modifikasyon (örneğin asetilasyon, metilasyon veya fosforilasyon) belirli bir tip tanımak değişiklik özgü antikor kategorize edilebilir bir protein, belirli amino asit tortu. Omori vd. ve şirket X pY1798 antikorlar fosforile peptid tavşanlarla immunizing ve katı faz Kromatografi Goto'nın yöntemi9, takip unphosphorylated bir peptid ile kullanarak elde edilen antikor arındırıcı tarafından ortaklaşa oluşturulan 10. pY1798 antikorlar yoğun tam uzunlukta insan girdin ifade vektörel çizimler kullanarak/tirozin 17989nokta mutasyon olmadan vitro fosforilasyon deneyleri ile doğrulanmış. Daha sonra Kuga vd. pY1798 antikorlar şirket X bağırsak Kıbrıslı Türkler1özel ve hassas bir işaretleyici bulundu. Böylece, pY1798 antikorlar şirket X eklenmesi bu protokolündeki bir kritik noktasıdır.
Jelatin ve uzun histochemical araştırmalar cryosections13kullanarak doku örnekleri katıştır için kullanılan hayvan dokulardan çıkarılan kollajen içerir. Jelatin bir sıvı durumdaki14katıştırma sırasında korumak için gerekli ısı olumsuz etkileri önlemek için uygulanacak olan 4 ° C'de gelatinized ama oda sıcaklığında erir, düşük erime noktası jelatin başladı. Bu protokol için 4 ° C'de gelatinizes ve RT erir jelatin tozu imal düşük erime noktası jelatin fare değişir enine cryosections Morfoloji korumak için kullanıldı. Bu jelatin tamamen değişir doldurmak için kullanıldığında, örnekleri sonra formalin-geri dönüşümsüz gelatinization ulaşmak için tespit edildi. Isı kaynaklı antijen alma aldehid içeren Fiksajlar12tarafından maskeli antijenleri ortaya çıkarmak için etkili bir yöntemdir. Ancak, sık kullanılan parafin kesitler analizi için yüksek sıcaklık (30 dk için 95-99 ° C) doku/jelatin karmaşık morfolojisi zarar verebilir. Burada biz antijen alma ve doku Morfoloji korunması sağlar düşük sıcaklık antijen alma (50 ° C 3 h için) kullanılır.
pY1798 antikor TCs fare değişir değil sadece, aynı zamanda birden çok organlarda (mide, ileum, iki nokta üst üste ve safra kesesi) fareler ve insanlar1etiketleyebilirsiniz. PY1798 sinyalleri herhangi bir dokusundan sabitlenmemiş dokularda hızla düşer çünkü ancak, bu iletişim kuralını değişir Lümen içine formalin enjeksiyon içerir (Adım 2.1.15., şekil 1A2).
Serbest dalgalanma cryosections kalınlığı ile ilgili sınırlamalar vardır. İnce cryosections kalınlığı mikroskopi için açısından avantajlı olmasına rağmen inceliği bu bölümleri fiziksel olarak savunmasız bırakıyor. Buna ek olarak, kalın cryosections fiziksel olarak sağlam, ama daha düşük antikor geçirgenliği bölüme sahip. Bu protokol için 30 µm kalınlığında bölümlerde kullanılan hem fiziksel olarak istikrarlı ve geçirgen antikorlar için vardı. İletişim kuralı başarısız olması durumunda bu yöntem Histoloji, geniş deneyim olmadan araştırmacılar için tasarlanmış olsa da, pY1798/villin/DAPI parafin üçlü boyama Kuga vd tarafından kullanılan benzer bölümler gerçekleştirilen1olabilir. Parafin kesitler burada F-aktin parafin bölümlerde, phalloidin boyama ile ilişkili sorunları yaşamamak için kullanılan değildi.
Amino asit dizileri tirozin-1798 girdin için bitişik korunması nedeniyle, fare, sıçan ve insan da dahil olmak üzere başka türlerin TCs leke pY1798 antikorlar uygulanabilir. Bu protokol için kullanılan jelatin dolum için içi boş diğer organlara da uygulanabilir. Gerçekten de, dışında pY1798 veya TC, düşük sıcaklık antijen alma ile doldurma jelatin kombinasyonu Rootkitler fare gut "zor" epitopları ifşa için yararlı olabilir ve sonuç olarak, pek çok araştırmacı için ilgi olabilir.
Girdin biyolojik rolü ve TCs onun fosforilasyon önemi belirsizdir. Ancak, Lin ve ark. tarafından yapılan bir çalışma önerilen bu tirozin fosforilasyon girdin, büyük F-aktin polimerizasyon8derece ile ilişkilidir. Bu arada, Kuga vd buldum bu öldürücü apoptosis indükleyicileri doz (e.g., sisplatin, x-ışını radyasyon) TCs göreli sıklığı onlar olan fare bağırsağı içinde büyük bir artış nedeni ile iliskili olabilir olası dönüştürme enterositler Kıbrıslı Türkler, microvilli1' girdin fosforilasyon ile senkronizasyon içinde. Bu olasılığı gelecekte ek bir araştırma gerektirir. Son zamanlarda hızlı gözlenen üç grup parazit enfeksiyonu15,16,17takip TC frekans artırmak. Böylece, bu yüzen boyama sadece insan gut endoskopik toplanan dokuları analiz etmek için kullanılabilir, ama TC birikimi de insan bağırsak parazit enfeksiyon tanısında yardımcı olabilir.

Tutam hücreleri (TCs) apikal tufts ve biriktirme şeklinde somas1ile karakterize gastrointestinal epiteli, küçük dağınık bileşenleridir. Kıbrıslı Türkler ilk olarak 19562' de açıklanan rağmen TC işlevi, kısmen güvenilir TC işaretleri eksikliği nedeniyle belirsizdir.
Enomoto vd. ilk sinir sisteminin yanı sıra kan damarları, kalp kapakları, tendon ve kas iskelet4gibi sigara-nöro dokuları ifade3, girdin aktin bağlayıcı protein ile karakterizedir. Girdin, genetik ablasyon ile fareler büyüme geriliği ve birden çok beyin anomalileri4,5,6görüntülenir. Bu arada, insan girdin içinde işlev kaybı mutasyon ilerleyici ensefalopati, ağır retardasyon ve erken başlangıçlı Epileptik nöbetler7ile ilişkilidir.
2011 yılında, Lin ve ark. , tirozin tirozin kinaz EGFR ve Src8gibi tarafından aracılı 1798 girdin, dinamik fosforilasyon tespit edilmiştir. Onlar da fosforile girdin hücre geçiş8tetiklemek için aktin tadilat nedeniyle gerekli olduğunu gösterdi. Omori vd. sitesi - geliştirilen ve insan girdin karşı fosforilasyon durum özel antikorlar Goto'nın protokol sonrası tirozin 1798 (pY1798 antikorlar) fosforile ve site yönettiği mutagenesis kullanarak antikorlar doğrulanmış ifade taşıma tam uzunlukta girdin9,10Vektörler. 2017 yılında, Kuga vd. Bu pY1798 yüksek özgüllük ve yüksek hassasiyet1ile Kıbrıslı Türkler etiketleri bildirdi. PY1798 antikorlar fosfo-TC girdin ve önceki TC işaretleri karakteristik lumenal ucunda ' tutam' henüz dahil olmak üzere bütün hücre şekil girdin biyolojik rolü ortaya mükemmel boyama özelliklerine göre üstün olması gösterilmiştir işlev belirsiz1kaldı.
Bu çalışmada açıklanan yöntem boyama, belirli bir protein bir hedef protein karşı birincil bir antikor ve birincil karşı floresan Birleşik ikincil antikor kullanarak doku üzerinde işaretlemek için bir histolojik teknik ayirt içerir antikor. Bu yöntemin amacı araştırmacılar sınırlı histolojik tecrübesi ile yüksek kaliteli TC görüntüler elde etmek izin vermektir. Bu protokol slayt monte cryosections ihtiyacını önlemek veya bölüm alkol serbest yüzer cryosections kullanır. Ancak, serbest dalgalı bölümleri bir cam slayt desteğinden yokluğu nedeniyle kırılgan ve bölüm kalınlığı antikor geçirgenliğini azaltmak olabilir. Bu iletişim kuralı bu sorunları aşmak iki yaklaşım içerir: 1) tüm değişir lumen serbest yüzer bölümleri boyunca boyama işlemleri, Morfoloji korumak için jelatin ile doldurma ve 2) düşük sıcaklık antijen alma için kullanımı pY1798 sinyalleri güçlendirin.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Slc:DDY 6-week-old female mice</td>
			<td>Chubu Kagaku Shizai</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-02835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>199-02825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>199-10665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100,&#160; Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether</td>
			<td>Katayama Chemical</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>190-00013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% buffered neutral formalin solution</td>
			<td>Muto Chemical</td>
			<td>20215</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>21915-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N.N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13015-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-gauge stainless steel straight needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun</td>
			<td>Kono Seisakusho</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gauge winged needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SV-22DLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL TERUMO syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-20ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Iwaki centrifuge tubes</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>2325-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro test tube</td>
			<td>Star</td>
			<td>RSV-MTT1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder, Gelare-blanc</td>
			<td>Nitta Biolab</td>
			<td>2809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece</td>
			<td>Sakura FineTech</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm)</td>
			<td>Shoei Work&#39;s</td>
			<td>1101-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26404-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Block</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Blocking solution in 4.2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X</td>
			<td>28143</td>
			<td>Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>C022221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAS-coated slide glass white</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>MI-MAS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden Mappe KO-type</td>
			<td>Shoei Work&#39;s</td>
			<td>99-40007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801, F123600, F123601, F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water production system</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>GS-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic glove, Star Nitrile Glove</td>
			<td>Star</td>
			<td>RSU-NGVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer, SANYO Ultra Low</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MDF-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Showcase refrigerator</td>
			<td>Nihon Freezer</td>
			<td>NC-ME50EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C)</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>0068750-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C)</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>HB-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation chamber for immunostaining</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>10DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature)</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>NR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C)</td>
			<td>Tokyo Rika Kikai</td>
			<td>MMS-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope (for tissue handling)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope (for Figure 1B)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope (for Figure 3)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of anti-phospho-girdin antibodies to visualize intestinal tuft cells in free-floating mouse jejunum cryosections

Aktin bağlayıcı protein girdin aktin çeşitli dokularda hücre göç tetiklemek için remodeling için gerekli olan sitozolik bir proteindir. Reseptör ve reseptör tirozin kinaz tirozin 1798, fosforile girdin. Omori vd dağıtılan ve özellikle fosforile tirozin-1798, ancak unphosphorylated tirozin-1798 bağlayan insan (pY1798), tirozin-1798 girdin karşı site - ve fosforilasyon durum özel antikorlar geliştirdi. pY1798 antikorlar özellikle memeli gastrointestinal dokularda bulunan tutam hücreleri (TCs) etiketlemek için kullanılan, ancak bu hücreler belirsiz işlevidir. Bu iletişim kuralı TCs güçlü görselleştirme pY1798 antikorlar ve ayirt kullanarak Jejunumdaki sağlar. Başarılı ve basit TC görselleştirme emin olmak için bu iletişim kuralı iki histolojik teknikler içerir: jelatin dolu değişir doku ve 50 ° C 3 h. ile değişir doldurma için düşük sıcaklık antijen alımı yüzen cryosections imalatı düşük sıcaklık antijen alma güçlü sinyaller gelen TCs. başarılı kullanımı, bu iletişim kuralı için villus ucundan dağıtılmış Kıbrıslı Türkler, pY1798 boyama sonuçları sağlar, ancak jelatin serbest yüzer bölümleri boyama prosedürü boyunca şeklini korur mezar odası. Lekeli TCs biriktirme şeklinde soma var ve floresan sinyalleri için çıkıntılı 'tutam.' karşılık gelen lumenal ucundaki yoğunlaşmak Phalloidin boyama pY1798 pozitif TCs kalınlaşmış fırça sınır ile colocalized ve TC tutam uzanan bir rootlet kitle karşılık gelir. Bu iletişim kuralı ile gastrointestinal endoskoplar toplanan insan biyopsi örneklerinde TCs incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, TCs son zamanlarda parazit enfeksiyonu farelerde, ardından birikir bu protokol insan gut tanı parazit enfeksiyonları için uygulamalar olabilir düşündüren bildirildi.

Jelatin-dolgu değişir
Jelatin-(şekil 1B) dolum yararları olduğu gibi fare değişir jelatin ile doldurmak için tipik bir yordam (şekil 1A) gösterilir. Kısacası, eğimli bir 18'lik düz iğne ucu (şekil 1A1) bağırsak duvarı piercing karşı korumak için kaldırıldı. Jelatin dolgu elde kullanarak % 10 arabelleğe alınmış bir kirpik değişir bölümü bağırsak temizleme ve gut Lümen yüzey (şekil 1A2) düzeltmek için bir ucundan enjekte tarafsız formalin çözüm doldurma sıvı jelatin ( ) ile önce Şekil 1A3). Elde edilen sosis gibi parçalar (şekil 1A4) gömülü, dondurulmuş ve kemiği bir cryostat 30 µm kalınlığında dilimler halinde kesitli. Doldurma jelatin yokluğunda jejunal bölümleri geri sallanmaya villus izin kink için (şekil 1Bsol) eğilimindedir. Jelatin doldurma bölümleri yuvarlak disk şeklinde korur ve dik villus (şekil 1Bdeğil) konumlandırma korur. Görüntüleri serbest yüzer değişir bölümleri morfolojisi koruyarak doldurma jelatin tarafından tanınan yararı açıkça göstermektedir.
Bağırsak tutam hücre başarılı görüntüleme
pY1798 antikor dot Blot, western Blot, parafin bölüm boyama, boyama tezcan monte cryosection veya serbest yüzer cryosection1,9boyama gibi değişken immunostaining teknikleri için uygulanabilir. Bu protokol için floresan TCs pY1798 antikorlar, phalloidin ve TCs1yapısal özelliklerini göstermek için boyama DAPI kullanarak fare değişir içinde boyama için serbest yüzer cryosections üzerinde duruldu. Genel olarak, Kıbrıslı Türkler yaklaşık bir TC/100 epitel hücrelerinin villus ucundan mezar odası1' e bir oranda dağılmış. O pY1798 tekrarlanarak zarı, sitoplazma biriktirme şeklinde soma ve güçlü sinyal yoğunlaşma bir TC1 tutam' çıkıntılı kaynakçalara şiddetle lekeli lumenal ucu da dahil olmak üzere tüm TCs delineates temsilcisi sonuçları göster ()Şekil 2A-2B). Bu arada, phalloidin bir phallotoxin, zehirli bicyclic heptapeptides mantar Amanita phalloides, gelen bir ailenin ve bağırsak fırça sınır oluşturan microvilli mevcut olduğu için ipliksi aktin (F-aktin), yüksek ilgi vardır 11. Phalloidin tekrarlanarak ve belirgin işaretleri1tutam uzanan rootlets bir kitle için karşılık gelen kalınlaşmış fırça sınır. Böylece, bu iletişim kuralı başarıyla TCs bağımsız olarak tanımlayan pY1798 sinyalleri (soma, biriktirme şeklinde sinyal yoğunlaşma lumenal uç) belirgin kalınlaşmış phalloidin pozitif fırça sınır ile tutarlı co lokalizasyonu gösterir olup olmadığını bir i. (2A rakam) veya (2B rakam)bir crypt içinde bulunurlar.
Düşük sıcaklık antijen alma serbest yüzer bölümleri boyama için etkilidir
95-99 ° c ısı tabanlı antijen alma parafin kesitler ve slayt monte cryosections analiz için yaygın olarak kullanılır. Tür bölümleri genellikle slayt12tarafından desteklenen slayt monte edilmiş bölümlerde daha kırılgan olduğundan Ancak, bu yaklaşım serbest yüzer bölümlerine zarar vermeden uygulamak zordur. Düşük sıcaklık antijen alma (50 ° C 3 h için) beri bir su banyosu kullanarak morfolojisi etkilemez mi ön deneyler serbest yüzer değişir kısımlarında antijen alma bir kör objektif etkinliğini değerlendirildi testi, hangi istatistiksel olarak düşük sıcaklık antijen alma ()şekil 3)etkinliğini doğruladı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig1.jpg"> Resim 1: Jelatin dolum cryosections morfolojik korunması için değişir bölümlerin Yordamlar için fare değişir jelatin ile intraluminal dolgu (A) fotoğrafları. (A1) Eğimli bir 18'lik düz iğne ucu gut duvar piercing önlemek için kaldırıldı. (A2) Tamponlu tarafsız formalin çözüm (% 10) bağırsak içeriğini temizlemek ve gut Lümen yüzey düzeltmek için kırpılmış değişir bir ucunu enjekte ettiler. (A3) Kirpik değişir sıvı jelatin ve her iki tarafın 6-0 naylon dikiş (siyah oklar)kullanarak bakmaksızın dolu. (A4) Önceden varolan dikiş knot (siyah oklar) arasında yerleştirilmiş dört daha fazla dikiş knot (beyaz ok) üç kısa parça vermiştir. Doku sonra iki belirtilen konumda (beyaz ok uçları), üç sosis gibi parçalara ayrılacaktır. (B) yararlı etkileri jelatin doldurma serbest yüzer cryosection morfolojisi. Jelatin doldurma olmadan, bölümler fantazi, kolayca geri (sol)sallanmaya villus bırakmak eğilimindedir; jelatin dolgulu 30 µm kalınlığında bölümünde bir disk şekli tutar ve dik villus korunmuş (sağda)konumudur. Nomarski fark girişim Karşıtlık'ı kullanarak görüntüleri çekildi. Ölçek çubukları, 1 mm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig2.jpg"> Resim 2: Temsilcisi Floresans görüntüler fare bağırsak tutam hücre TCs villus (A) veya bir crypt içinde görüntülerini confocal Floresan (B), serbest dalgalı fare değişir bölümleri ile siteye özgü lekeli ve fosforilasyon durum özel antikorlar karşı girdin tirozin fosforile 1798) pY1798, yeşil, en uygun uyarma/emisyon dalga boyu 490/525 nm), phalloidin (kırmızı, 590/617 nm), 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, mavi, 358/461 nm). (Ölçek çubukları, 50 µm) düşük büyütme görüntülerde beyaz kutuları tarafından çevrili alanı sağdaki (ölçek çubukları, 10 µm) genişletilir. pY1798 antikor TCs, mevcut lumenal ipucu (oklar), membran ve biriktirme şeklinde TC soma sitoplazma boyama ile (bir i. (A), veya (B)bir crypt içinde), konumdan bağımsız olarak tekrarlanarak leke. Phalloidin (ok uçları) Boyama içinde belirgin kalınlaşmış fırça sınır başka bir ayırt edici TCs. işaretidir <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig3.jpg"> Şekil 3: Düşük sıcaklık antijen alma pY1798 ayirt artırır. Deneysel yordamları iki grup düşük sıcaklık antijen alma etkinliğinin onaylamak için karşılaştırıldı. Serbest dalgalanma değişir bölümler (30 µm kalınlığında, n = 13) üzerinden tek bir donmuş blok iki gruba ayrıldı ve her grup bölümlerden lekeli tam protokol sonrası veya aynı eksik olan düşük sıcaklık antijen alma (Adım 4.2.2) protokol. Boyama sonra bölümleri tek tek slaytlarda grup numaraları ile etiketli monte edildi ve her slaytta etiketleme maskeleme bandı ile kaplıydı. Tüm slaytları karıştırılır, banttaki yeni numaraları ile etiketli ve floresan mikroskobu altında bir FITC süzgeci gözlenen. Toplam sayıları görünür pY1798 pozitif TCs, her grupta ortalama ve bir çubuk grafik (ortalama ± standart sapma) sergilendi. İki kuyruklu t-test ortalama sayıları iki grup arasında karşılaştırmak için gerçekleştirildi. P-değerleri aşağıda 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Düşük sıcaklık antijen alma pY1798 ayirt verimliliğini önemli ölçüde geliştirilmiş. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections at JoVE.com

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

Serbest dalgalanma fare değişir Cryosections hücrelerde bağırsak tutam görselleştirmek için Anti-fosfo-girdin antikor kullanımı

Kuga vd fosforilasyon-durum belirli antikor aktin bağlayıcı protein tirozin 1798 (pY1798) fosforile girdin karşı tutam hücreleri (TCs) etiketlemek için kullanılabilir keşfetti. Bu iletişim kuralı serbest yüzer değişir cryosections pY1798 antikorlar ile immünfloresan boyama kullanarak TCs güçlü görselleştirme sağlar.

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

use-anti-phospho-girdin-antibodies-to-visualize-intestinal-tuft-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Görüntüleme.  Aichi Human Service Center. Kuga vd fosforilasyon-durum belirli antikor aktin bağlayıcı protein tirozin 1798 (pY1798) fosforile girdin karşı tutam hücreleri (TCs) etiketlemek için kullanılabilir keşfetti. Bu iletişim kuralı serbest yüzer değişir cryosections pY1798 antikorlar ile immünfloresan boyama kullanarak TCs güçlü görselleştirme sağlar.

Video: Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

Catheterization of Intestinal Loops in Ruminants

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the outside world. As such, the intestine plays a pivotal role in immunosurveillance and protection from enteric pathogens. Investigating intestinal physiology and immunology commonly employs 'intestinal loops' as an experimental model. The majority of these loop models are non-recovery surgical procedures that study short-term (&lt;24 hr) changes in the intestine (1-3). We previously created a recovery intestinal loop model to specifically measure long-term (&lt;6 mo) immunological changes in the intestine of sheep following exposure to vaccines, adjuvants, and viruses (4). This procedure localized treatments to a specific 'loop', allowing us to sample this area of the intestine. A significant drawback of this method is the single window of opportunity to administer treatments (i.e. at the time of surgery). Furthermore, samples of both the intestinal mucosa and luminal contents can only be taken at the termination of the project. Other salient limitations of the above model are that the surgical manipulation and requisite post-operative measures (e.g. administration of antibiotics and analgesics) can directly affect the treatment itself and/or alter immune function, thereby confounding results. Therefore, we modified our intestinal loop model by inserting long-term catheters into the loops. Sheep recover fully from the procedure, and are unaffected by the exteriorized catheters. Notably, the establishment of catheters in loops allows us to introduce multiple treatments over an extended interval, following recovery from surgery and clearance of drugs administered during surgery and the post-operative period.

We describe a novel surgical method for catheterizing 'intestinal loops' within the ileum of sheep. Once animals have recovered from surgery and have cleared antibiotics and analgesics, multiple treatments can be deposited directly in loops via the catheters.

Ruminantlarda Bağırsak Döngüler kateterizasyonu

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the ...

Biyoloji

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the differentiation of ES cells is the formation of embryoid bodies (EBs) aggregates 2, 3. EB formation is based on spontaneous aggregation when ES cells are cultured in non adherent plates. Three-dimensional EB recapitulates many aspects of early mammalian embryogenesis and differentiate into the three germ layers: ectoderm, mesoderm and endoderm 4.
Immunofluorescence and in situ hybridization are widely used techniques for the detection of target proteins and mRNA present in cells of a tissue section 5, 6, 7. Here we present a simple technique to generate high quality cryosections of embryoid bodies. This approach relies on the spatial orientation of EB embedding in OCT followed by the cryosection technique. The resulting sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to characterize populations of cells containing certain proteins, RNA or DNA. In this sense, the preparation of EB cryosections (10&mu;m) are essential tools for histology staining analysis (e.g. Hematoxilin and Eosin, DAPI), immunofluorescence (e.g. Oct4, nestin) or in situ hybridization. This technique can also help to understand aspects of embryogenesis with regards to the maintenance of the tri-dimensional spherical structure of EBs.

Pluripotent stem cells growing in suspension differentiate into embryoid bodies (EBs). Here we demonstrate how to obtain high quality EB cryosections useful for studying cellular and molecular aspects of embryogenesis, while preserving their organization as aggregates.

Embriyoid Kuruluşlar Cryosections kullanarak Pluripotent Kök Hücre Analizi

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

Embriyolar yılında Programlı Hücre Ölümü Algılama LysoTracker kullanımı ve Embriyonik Kök Hücreler Farklılaşan

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize&#39;a Time Lapse Mikroskopi kullanın<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyolar

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...